Определение методом пцр. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение

В диагностике инфекционных заболеваний используются различные лабораторные методы обнаружения возбудителей. Одним из наиболее прогрессивных, специфичных и точных лабораторных тестов является анализ методом ПЦР, позволяющий определять наличие возбудителей в крови и других видах биологического материала, обнаруживать микроорганизмы на первых стадиях развития болезни, в случаях носительства инфекции.

Анализ на ПЦР на специальной аппаратуре

Как проводят диагностические тесты с помощью ПЦР

Полимеразная цепная реакция – лабораторный молекулярно-биологический способ обнаружения ДНК бактерий и грибов, ДНК и РНК вирусов. Основа ПЦР – особая ферментативная реакция, протекающая в присутствии специальных ферментов и веществ молекулярной природы. Благодаря тому, что метод способен зафиксировать наличие непосредственно возбудителя болезни, его считают наиболее информативным и чувствительным при выявлении латентных инфекций и носительства по сравнению со всеми другими диагностическими методами.

Анализ биологических образцов с помощью ПЦР-тестирования позволяет быстро обнаружить присутствие самих бактерий и вирусов.

Остальные лабораторные способы диагностики, как правило, определяют косвенные признаки инфекции, либо требуют длительной процедуры проверки.

Основными стадиями ПЦР-методики являются:

взятие биологического материала, его доставка в диагностическую лабораторию,
выделение генетического материала бактерий и вирусов из взятого материала,
непосредственно анализ ПЦР и расшифровка полученных данных.

Для постановки реакции ПЦР используют образцы жидкостей, тканей, секретов, в которых предполагают присутствие болезнетворных микроорганизмов. Чаще всего в качестве образцов для тестирования используют венозную кровь, плазму или сыворотку крови. В лаборатории бактериальные и вирусные частицы отделяют от остальных компонентов и с использованием специальных реагентов выделяют из них молекулы ДНК или РНК.

Полимеразная цепная реакция

На следующей стадии эти генетические молекулы многократно размножают в специальных приборах. Для этого используют особые ферменты и молекулы, которые позволяют искусственно размножить строго определенный вид ДНК, принадлежащий только одному конкретному возбудителю. В результате реакции образуется огромное количество коротких фрагментов ДНК, идентичных тем, что входят в состав вирусов и бактерий.

На третьем этапе накопленные фрагменты обнаруживают с помощью специальных красителей и оборудования для детекции. Если в исходном образце содержались болезнетворные микроорганизмы, в результате реакции образуется специфический продукт, и анализ показывает положительный результат. Если возбудителя в материале не было, продукт реакции не синтезируется и тест дает отрицательный результат.

Тестирование методом ПЦР – один из самых быстрых способов диагностики инфекций. Полный цикл проверки материала занимает от нескольких часов до одного дня.

Метод ПЦР — суть

Именно использование в реакции многократного размножения молекул ДНК строго определенного вида позволяет точно определять наличие микроорганизмов в биологических образцах с предельной чувствительностью. Даже незначительная концентрация инфекционных агентов в тканях и жидкостях организма может привести к синтезу огромного количества продукта реакции и положительному заключению.

Какие инфекции определяют ПЦР-тестом

С помощью технологии ПЦР детектируют присутствие самых разных бактерий, дрожжеподобных клеток, вирусных частиц. В современной диагностической практике анализ ПЦР наиболее распространен для выявления возбудителей следующих заболеваний:

ВИЧ-инфекция (СПИД),
гепатиты (гепатит B, гепатит С и другие более редкие разновидности),
цитомегаловирусная инфекция,
практически все инфекционные заболевания мочеполового тракта,
кандидоз,
микоплазмоз,
инфекции, вызванные герпес-вирусами,
папилломовирусная инфекция,
токсоплазмоз,
кишечные заболевания,
дифтерия,
туберкулез,
редкие очаговые инфекции,
мононуклеоз и многие другие.

Полимеразная цепная реакция – самый распространенный, достоверный и быстрый метод обнаружения половых инфекций, гепатита, ВИЧ, папиллом и других заболеваний.

Для многих диагностируемых заболеваний ПЦР не является единственным способом диагностики. Диагноз подтверждается врачом только при наблюдении других признаков болезни.

Схема выявления вирусов и бактерий

Но для целого ряда случаев полимеразная реакция является «золотым стандартом» лабораторной диагностики.

Список обнаруживаемых с помощью ПЦР инфекций расширяется с каждым годом. Развитие метода уже позволило определять одновременно несколько возбудителей. Это послужило распространению комплексных программ обследований. Среди них: комплексное исследование микрофлоры на бактериальный вагиноз, определение TORCH-инфекций, выявление папиллом человека высокого и низкого канцерогенного риска. Кроме того, анализ крови ПЦР входит в обязательный госпитальный комплекс диагностики.

С использованием полимеразной реакции ученые смогли определить молекулы, сигнализирующие о развитии разных форм злокачественных опухолей — онкомаркеры. Благодаря чему метод нашел применение в раннем выявлении рака. ПЦР-тесты активно используют для обнаружения наследственных генетических дефектов, в том числе в пренатальной диагностике и в процессе планирования беременности.

Особенности биологического материала для анализа ПЦР

Забор определенного вида материала для исследования определяется типом инфекции, которую хотят диагностировать в результате тестирования. В качестве исследуемых образцов выполняют забор:

венозной крови,
слюны,
соскобов, например из цервикального канала, с внутренней стороны щеки,
образцов слизи,
мочи,
плевральной жидкости,
образцов спермы и секрета предстательной железы,
мокроты и бронхо-легочного лаважа,
выделений из уретры.

Результаты могут расшифровать только специалисты

В случае отдельных инфекций и при особых показаниях врачи могут назначить анализ спинномозговой жидкости. В обнаружении внутриутробных заболеваний применяют образцы плаценты и околоплодных вод.

В общем случае для диагностики с помощью ПЦР используют тот вид материала, в котором с большой вероятностью присутствует непосредственно сам возбудитель заболевания. Вид биологического материала определяется врачом при направлении на анализ.

Чтобы анализ был точным и правильным необходима простая подготовка перед забором материала и соблюдение особой чистоты взятия образов и проведения самого анализа.

Для получения точного результата анализа следует придерживаться нескольких правил подготовки и забора материала на исследование:

отменить половые контакты за несколько дней до забора материала из половых органов и в случае диагностики половых инфекций по анализу крови,
венозную кровь на ПЦР анализ сдавать утром, перед сдачей не употреблять напитки и еду,
не курить минимум за два часа до сдачи крови,
мочу собирать строго в стерильный контейнер сразу после сна.

Важно! Прием антибиотиков и других лекарственных препаратов может исказить результаты анализа. Перед сдачей материала следует проконсультироваться с врачом.

Если для выполнения анализа ПЦР планируется забор материала из половых органов, рекомендуется отменить использование антибактериальных гигиенических средств и сильнодействующих лекарственных препаратов по согласованию с лечащим врачом.

Как расшифровать результат анализа ПЦР

Результаты ПЦР-анализа обычно представлены в качественном формате. Инфекционный агент либо обнаруживается в образце биологического материала, либо не детектируется в нем.

Интерпретация заключения в этом случае максимально проста:

положительный результат свидетельствует о том, что микроорганизм присутствовал в анализируемом образце,
отрицательный тест указывает на то, что инфекционный агент не был обнаружен.

Внимание! Отрицательный результат иногда является следствием неправильного забора материала или ошибок в процессе проведения анализа.

При наличии явных симптомов заболевания и подозрении на ложноотрицательный результат может быть целесообразно повторить исследование.

Проведение анализа ПЦР требует большой точности

В особых случаях используют количественные методы определения возбудителя. Результаты таких анализов выдаются в виде полученной концентрации ДНК или РНК возбудителя в пересчете на определенный объем материала. Например, в копиях молекул ДНК на миллилитр плазмы крови.

Количественный и полуколичественный анализ ПЦР и расшифровка его результатов выполняются для мониторинга течения заболевания, определения вирусной нагрузки, выявления стадии болезни, диагностики заболеваний, вызванных условными патогенами.

Положительные стороны диагностики методом ПЦР

Активное внедрение метода полимеразной цепной реакции в диагностику такого широкого спектра инфекционных болезней стало возможным благодаря целому ряду его преимуществ:

высокая специфичность метода – анализ позволяет обнаруживать строго определенный вид ДНК возбудителей,
возможность постановки анализа на поток и автоматизации процесса,
высокая чувствительность метода и возможность диагностировать болезнь на ранних стадиях,
диагностика одновременно нескольких инфекций;
быстрота процедуры и небольшая стоимость расходных материалов.

К недостаткам метода можно отнести необходимость дорогостоящего оборудования, высокие требования к чистоте и технологичности лаборатории, возможность получения ложных результатов при несоблюдении методики анализа.

Мазок методом ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний обладает следующими преимуществами:

Прямое определение возбудителей инфекционных заболеваний.

Многие традиционные методы лабораторной диагностики подразумевают выявление возбудителей заболевания по различным косвенным признакам. Например, ИФА-диагностика основана на обнаружении в крови пациента белков, являющихся продуктами распада инфекционных возбудителей, на основании чего врач может поставить тот или иной диагноз. Метод ПЦР-анализа дает прямое указание на присутствие в забранном у пациента материале специфического участка ДНК возбудителя болезни.

Высокая специфичность ПЦР-диагностики.

В процессе проведения анализа в исследуемом материале выделяется фрагмент ДНК, специфичный, т. е. присущий только конкретному возбудителю — только определенной бактерии или вирусу. Данный участок ДНК уникален и не характерен ни для одной инфекции на земле.

Высокая чувствительность ПЦР.

Обнаружение инфекции возможно даже в том случае, если в забранном у пациента материале содержится лишь одна клетка бактерии или вируса. По сравнению с другими иммунологическими и микробиологическими методами диагностики: чувствительность ПЦР-анализа — 10-100 клеток в пробе, другие методы - 103-105 клеток.

0Array ( => Анализы) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Универсальность ПЦР-анализа.

Для ПЦР-исследования может применяться практически любые материалы, в том чиле недоступные для исследования другими методами: слизь, моча, кровь, сыворотка, мокрота, эякулят, соскоб эпителиальных клеток - поскольку инфекция может содержаться в любых биологических выделениях и тканях.

Высокая скорость получения результата ПЦР-анализа.

Единый для всех метод обработки забранного на анализ у пациента материала, детекции продуктов реакции, автоматизированная ПЦР-амплификация позволяются провести полную ПЦР-диагностику за 4-5 часов. В тоже время, на культуральные методы исследования затрачивается гораздо больше времени — от нескольких дней до нескольких недель, поскольку необходимо выделение, а затем и выращивание возбудителя на культуре клеток.

Возможность диагностики любого вида инфекции.

Высокая чувствительность метода ПЦР позволяет диагностировать инфекцию не только на острой стадии заболевания, но и хронические инфекции и даже наличие единичных бактерий или вирусов.

Мазок методом ПЦР позволяет выявить инфекции, которые невозможно обнаружить в мазке на флору: хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, генитальный герпес.

Какими бы значительными достоинствами не обладал метод исследования, но и ПЦР-диагностика имеет некоторые ограничения. К недостаткам ПЦР-диагностики можно отнести:

Возможность получения ложноположительного результата

ПЦР-анализ может показать положительный результат даже в том случае, если инфекция уже мертва, «убита» антибиотиками, но ее мертвые клетки все еще содержатся в тканях пациента. Как такое возможно? Очень просто. Например, инфекция живет в клетках эпителия (на слизистой половых органов или глаз). И ее полечили. Но для «обновления» клеток эпителия требуется время. Если материал будет забран врачом до срока полного обновления клеток, в материале могут содержаться мертвые клетки инфекции. Клетки, очевидно, содержат генетический материал — ДНК или РНК возбудителя, который и «ищет» ПЦР. ПЦР не отличает мертвые клетки от живых: она ищет ДНК, и «клонирует» их в огромных количествах. Результат такого анализа положительный. В действительности же он является ложноположительным.

Неспособность ПЦР «отличить» мертвую инфекцию от живой налагает определенные требования при использовании ПЦР и для контроля эффективности лечения. Основное правило, конечно же, дождаться полного выведения мертвых остатков инфекции из организма, что у среднего человека происходит в течение 4-8 недель. По истечении этого срока после приема последней таблетки антибиотика метод ПЦР можно и нужно использовать для контроля эффективности проведенного лечения.

гастроэнтерологиядиагностический комплекс - 5 360 рублей

ТОЛЬКО В МАРТЕэкономия - 15%

1000 рублейснятие ЭКГ с расшифровкой

- 25%первичный
приём врача
терапевта по выходным

980 руб.первичный прием гирудотерапевта

прием терапевта - 1 130 рублей (вместо 1500 рублей)"Только в марте, по субботам и воскресеньям, приём врача- терапевта со скидкой 25% - 1 130 руб., вместо 1 500руб. (диагностические процедуры оплачиваются по прейскуранту)

На более ранних сроках контроль излеченности можно произвести только с помощью культурального метода, или посева: признаком неизлеченности могут служить только жизнеспособные размножающиеся микроорганизмы.

Нежелательно использовать ПЦР-анализ для диагностики гарднереллеза, так как гарднереллы — возбудители этого заболевания в небольшом количестве в норме живут во влагалище. ДНК этих бактерий же при использовании ПЦР будет раз за разом находиться. Гарднерелл не должно быть в мазке, и бактериоскопия в данном случае — достаточный метод для диагностики гарднерелллеза и контроля лечения.
Изменчивость микроорганизмов

Любой микроб обладает способностью изменяться, причем на уровне ДНК. Наиболее яркий пример из этой области — это вирус гриппа. Переболев однажды, на вирус у человека вырабатываются антитела. Чисто теоретически, если мы переболели гриппом хоть один раз, то как и ветряной, второй раз мы болеть не должны. Но болеем мы практически каждый год. В чем причина? Вирус «мутирует», немного «изменяя» свой геном, и наша иммунная система, наши антитела уже «не узнают» старого гостя в новом обличии. Как ни прискорбно, приходится болеть гриппом заново...

При проектировании амплификатора (тестовой ПЦР-системы) используют специфичный для данного микроорганизма фрагмент ДНК, наименее подверженный изменениям. Он «выбирается» из так называемой высоко консервативной области ДНК. Но изменчивость микроорганизмов может приводить к тому, что некоторые генотипы или штаммы исследуемого возбудителя могут приобретать мутации в амплифицируемом (клонируемом) участке генома, и, таким образом, становиться неуловимыми данной тест-системой.

Таким образом, различные тест-системы — одна из причин, почему анализы, сделанные в разных лабораториях и в разных клиниках «одним и тем же» методом ПЦР могут показывать диаметрально противоположные результаты. Чтобы максимально избегать ошибок по вине мутаций, в настоящее время разработаны стандарты, регламентирующие объем испытаний (включая проверку на перекрестные реакции, а также тестирование известных штаммов определяемого возбудителя), которые должна выдержать тест-система, прежде чем она попадет на рынок и будет использована для диагностики вашего здоровья. Вот почему хорошие клиники и лаборатории используют последние поколения тест-систем. И наш медицинский центр «Евромедпрестиж» один из немногих, кто может предложить своим клиентам качественную диагностику.

Для того чтобы быстро и с высокой точностью выявить у человека наличие генетических и иных заболеваний сегодня врачами используется ПЦР диагностика. Этот анализ обладает высокой информативностью и широко применяется специалистами разной направленности. Это исследование способно показать наличие болезни задолго до появления симптоматики. Сегодня без этого анализа врачи не ставят окончательного диагноза.

Суть метода

Метод был открыт еще в 1983 году американским ученым по имени Кэри Мюллис. Позже за свое изобретение ученый был удостоен премии Нобеля. Что же такое тест ПЦР? Принцип метода заключается в том, что в условиях лаборатории специалисты многократно увеличивают количество фрагментов ДНК человека. При этом увеличивается и молекула инфекции. Таким образом, чужеродные клетки становятся видимы в микроскоп.

Сегодня метод ПЦР используется в разных областях. Именно он помогает идентифицировать биологический материал криминалистам, установить спорное отцовство или материнство, помогает выявить генетические заболевания, указывает на наличие или отсутствие инфекционных болезней.

Что может обнаружить анализ

ПЦР методику в наши дни активно применяют для обнаружения скрытых инфекций. Благодаря особой технологии анализа инфекцию можно обнаружить на самых ранних стадиях, когда о симптомах еще не может идти и речи.

Исследование методом ПЦР может показать наличие следующих заболеваний:

Онкологические болезни.
Гепатиты всех видов и подвидов.
Уреаплазмоз.
Сальмонеллез.
Кандидоз.
Дифтерия.
Хламидиоз.
Цитомегаловирус.
Микоплазмоз.
Хеликобактериоз.
Герпес.
Гонорея и др.

Особое значение ПЦР диагностика инфекций имеет для выявления хронических вялотекущих и скрытых инфекций, которые не проявляют себя специфичной симптоматикой. Такое исследование часто назначают при планировании беременности. Важно исследовать кровь не только будущей матери, но и отца, ведь многие заболевания могут передаваться по наследству.

Преимущества анализа

Анализ методом ПЦР обладает рядом бесспорных преимуществ перед другими видами исследования крови на наличие инфекций, а именно:

Выявление возбудителя болезни с высокой точностью.
Исключение ложноположительных результатов.
Возможность обнаружения даже одной клети возбудителя.
Возможность исследовать биологический материал для выявления нескольких инфекций одновременно.
Быстрое получение результатов исследования.
Возможность обнаружения инфекции до клинических проявлений болезни.

Сегодня метод постоянно совершенствуется. Появляются новые тесты на обнаружение опасных вирусов и инфекций. По данным статистики именно это обследование позволяет обнаружить вредоносные клетки задолго до появления клинических симптомов. Это значит, что анализ относится к методам ранней диагностики, что позволяет провести лечение пациента на самых ранних стадиях болезни.

Особое значение сегодня врачи придают этому методу в обнаружении раковых клеток в организме.

Современные врачи заявляют, что использование полимеразной цепной реакции ПЦР в борьбе с раком является самым современным и эффективным методом диагностики онкологии на ранних стадиях заболевания.

Разновидности анализа

Сегодня врачи часто предлагают сделать комплексный тест ПЦР. Данное исследование более информативно и помогает врачам быстро поставить точный диагноз. Анализ на отдельный возбудитель чаще всего проводится для контроля лечения или при подозрении на то или иное заболевание, а комплексный тест помогает выявить скрытые инфекции.

Самыми частыми комплексными исследованиями являются ПЦР 6 и ПЦР 12. Цифры в названии означают количество инфекций, на которые исследуется биологический материал. Также бывает ПЦР количественный или качественный. Первый чаще всего дороже, ведь он с точностью определяет количество вирусных клеток в биологическом материале, а значит, помогает установить стадию заболевания.

Чаще всего анализ назначается в том случае, когда врачи не могут выявить возбудителя болезни. Так, к примеру, у пациента есть определенные симптомы заболевания, а другие исследования не выявляют инфекцию. В этом случае метод ПЦР просто незаменим. Также исследование обязательно перед планированием беременности. Помимо этого анализ крови назначается на выявление врожденных генетических заболеваний и по другим показаниям врача. Помимо этого исследование может быть назначено по решению суда для определения отцовства или иных показателей по запросу прокуратуры.

Материал для исследования

Материалом для исследования методом ПЦР диагностики могут служить различные жидкости и среды человека. Чаще всего для исследования берут кровь, мочу, соскобы и слизь пациента. Забор того или иного материала напрямую зависит от исследования на те или иные инфекции.

Половые болезни определяются по мазкам, взятым из половых органов, моче или соскобу. Для определения наличия ВИЧ, гепатитов, токсоплазмоза и других инфекций врачам нужно исследовать кровь пациента. Иногда на анализ берут спинномозговую жидкость, к примеру, чтобы обследовать ее на наличие инфекций нервной системы. А для обнаружения внутриутробных инфекций необходимо сдать пробы околоплодных вод и тканей плаценты.

Сегодня гинекологи советуют сдать тест ПЦР всем женщинам в самом начале беременности, если вы не сделали анализ на этапе ее планирования.

Этот тест нужно сдавать до 12 недель беременности. Материал для исследования берется из шейки матки. Процедура безопасна и не доставляет дискомфорта. Анализ позволяет выявлять опасные инфекции, которые могут повлиять на внутриутробное развитие плода. Данный анализ называется ПЦР-6.

Правила сдачи и расшифровка

Каждый пациент должен знать, что точность результата любого анализа зависит от соблюдений правила сдачи биоматериала. Способ и правила сдачи анализа определяются видом теста. Если вам нужно сдать кровь, на забор нужно приходить утром на голодный желудок. Если необходимо исследование на половые инфекции, следует соблюдать половой покой минимум сутки до забора материала. Забор мочи также требует соблюдение определенных правил. Мочу нужно собирать во время первого утреннего мочеиспускания. Собрать надо среднюю мочу, перед этим нужно помыться и вытереться чистым полотенцем. Посуда должна быть стерильной.

Расшифровка результата исследования не представляет особой сложности. В молекулярной ДНК РНК диагностике методом ПЦР результат может быть только положительным или отрицательным. На бланке лаборатории напротив каждой инфекции, на которые было проведено исследование можно увидеть знак «+» или «-». Соответственно «+» это положительный результат, который говорит о том, что в исследуемом материале найдены следы данной инфекции.

При расшифровке анализа очень важно определить количественное соотношение клеток вируса. Не всегда наличие инфекции можно расценивать как заболевание. Есть такое понятие как носительство инфекции. Это значит, что у человека есть клетки инфекции, но он этой болезнью не болеет. Однако такое носительство не уберегает от возможности заражения других людей. Именно количественный анализ помогает врачам определить, являетесь вы носителем или больным, а также идентифицировать стадию заболевания и подобрать эффективную терапию.

Где сдать

Многие пациенты интересуются, где сдать ПЦР, чтобы получить достоверный результат? Сегодня сдать анализ можно в любой специализированной клинике или частном медицинском центре. Анализ ПЦР платный, его цена зависит от вида исследования.

В районных поликлиниках данного исследования не проводят, там просто нет специального современного оборудования.

Многие люди пренебрегают анализом, считая, что данное исследование им не нужно. Однако если врач назначил вам данный анализ, значит, у него возникли определенные трудности с постановкой точного диагноза, а значит и с назначением эффективной терапии. В этом случае исследование лучше пройти, ведь это в ваших интересах.

Также все молодые пары, которые планируют беременность, должны пройти данное обследование. Направление на анализ можно получить в центре планирования семьи. Многие пары также не придают анализу должного значения, считая, что если у супругов нет явных наследственных заболеваний, то и малыш у них родится здоровым. Однако сегодня существует масса скрытых инфекций, которые могут повлиять на течение беременности и здоровье малыша.

Сегодня диагностические методы могут выявить самые скрытые инфекции, которые годами могут жить в организме человека, никак себя не проявляя. Однако не нужно самостоятельно сдавать анализы. Все исследования должны проводиться по показаниям лечащего врача, иначе ваша жизнь может превратиться в бесконечные походы по диагностическим центрам. В первую очередь при любых жалобах нужно идти к врачу. Именно он сможет провести оценку вашего состояния и назначить только нужные именно для вас анализы.

Вконтакте

Полимеразная цепная реакция (ПЦР-диагностика инфекций) основана на определении участков ДНК, специфичных для определенных патогенных микроорганизмов, в образцах биоматериала (соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта, крови или др.). Полимеразная цепная реакция является «золотым стандартом» диагностики большинства бактериальных, вирусных, грибковых инфекций. Тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью, поскольку позволяет определять фрагменты ДНК, характерные для конкретного возбудителя, за счет их многократного копирования (амплификации) в лабораторных условиях. Обнаружение патогенов методом ПЦР возможно еще до возникновения симптомов инфекционного заболевания, т. е. на доклинической стадии, а также при латентном течении инфекции и в тех случаях, когда другие лабораторные методики (бактериологические, вирусологические, серологические) еще не дают положительного результата.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), как метод лабораторной диагностики, был запатентован американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году, хотя параллельные исследования в этой области велись некоторыми другими американскими и советскими учеными. Однако именно К. Мюллис считается родоначальником метода ПЦР, за что спустя десятилетие был удостоен Нобелевской премии в области химии. Внедрение ПЦР в клиническую практику совершило настоящую революцию в диагностике инфекционных заболеваний, поскольку сделало возможным быстро (в течение 1-2 дней) выявлять даже самые малые концентрации патогенов, присутствующих в организме. Это позволяет диагностировать не только активные стадии заболеваний, но также их хроническое и скрытое течение. ПЦР исследования находят применение в диагностике вирусных гепатитов, ВИЧ, ЗППП, туберкулеза, респираторных, кишечных, трансмиссивных инфекций и мн. др. В настоящий момент анализы методом ПЦР проводятся повсеместно, во всех крупных лабораториях Москвы.

Сущность исследования

Полимеразная цепная реакция позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы путем выявления их генетического материала (РНК или ДНК) в биологических пробах, взятых от обследуемого человека. Это достигается путем многократного удвоения специфического фрагмента нуклеиновой кислоты патогена в присутствии фермента ДНК-полимеразы в лабораторных условиях. При этом копируется (амплифицируется) только строго определенный участок ДНК, специфичный для конкретного возбудителя, при его наличии в исследуемом материале. Весь лабораторный процесс проходит 3 этапа.

1. Выделение ДНК. Для очистки ДНК от посторонних примесей (белков, крови, слизи) пробу пропускают через сорбент, отмывают, центрифугируют, высушивают. Полученный осадок растворяют, получая очищенную ДНК в элюенте.

2. Амплификация . ПЦР-анализ проводят в амплификаторе – специальном приборе-термостате, который обеспечивает периодическое нагревание и охлаждение пробирок в циклическом режиме с точностью до 0,1°C. Обычно в ходе одного исследования выполняется 20-35 циклов, каждый из которых включает три фазы: денатурации ДНК, отжига и элонгации матричной цепи. На первом этапе пробирку с реакционным раствором, содержащим ДНК-матрицу, два праймера (короткие синтетические олигонуклеотиды, комплементарные концам искомого фрагмента), ДНК-полимеразу, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ионы магния и буферный раствор, нагревают до 93-95°С на 30-40 сек. В результате нагрева происходит денатурация – расхождение цепей двухцепочечной ДНК-матрицы вследствие разрушения водородных связей между ними. Затем температуру смеси снижают до 50-65°С, что позволяет праймерам связаться с ДНК-матрицей. Эта фаза ПЦР (фаза отжига) длится не более 2-х минут. Для протекания третьей стадии – элонгации или достраивания матричной цепи – смесь вновь подогревают до 72°С (время третьей фазы зависит от длины амплифицируемого участка – в среднем 20-40 сек.). Таким образом, за два-три десятка циклов в пробирке накапливается множество копий фрагмента ДНК, достаточное для обнаружения, идентификации, качественной или количественной оценки возбудителя.

3. Электрофорез. Полученный субстрат, содержащий продукты амплификации, помещают в лунки с агарозным гелем. Анализатор подключают к источнику тока, проводя электрофорез. Под действием электрического тока фрагменты нуклеиновых кислот разделяются и затем становятся хорошо видимы в трансиллюминаторе в лучах ультрафиолета в виде светящихся полосок оранжевого цвета. В заключении получают изображение (электрофореграмму), которую анализируют на ПК.

Сегодня, наряду с вышеописанной методикой, широкое применение находит ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). От стандартной ПЦР ее отличает добавление в реакционную смесь высокоспецифичных флуоресцентных меток, что позволяет измерять количество амплифицированной ДНК в настоящем времени сразу после завершения каждого цикла. Real-Time ПЦР предоставляет возможность проводить как качественный, так и количественный анализ, благодаря чему делаются выводы о стадии и динамике заболевания, эффективности этиотропной терапии. Также методика используется для генотипирования - определения штаммов вирусов (например, ВПЧ или гепатита В).

Сферы применения

Основные области применения ПЦР-диагностики включают:

инфекциологию - выявление возбудителей широкого круга воздушно-капельных, трансмиссивных и гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний;
гинекологию , урологию и венерологию – выявление возбудителей урогенитальных инфекций;
онкологию и гематологию - детекция опухолевых клеток и генов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями;
генетику - диагностика наследственных заболеваний, установление родства и отцовства;
эпидемиологию – выявление патогенов в пище;
экологию – мониторинг объектов окружающей среды (почвы, воды);
судебную медицину – идентификация личности и др.

Специфичность ПЦР в диагностике этих и других инфекций составляет 100%, что значительно превышает таковую у микробиологических, серологических, микроскопических методик. Бесспорным достоинством ПЦР-диагностики является возможность одновременно идентифицировать сразу несколько возбудителей в одной биопробе, поэтому многие лаборатории предлагают комплексные исследования - ПЦР-6, ПЦР-9, ПЦР-12, ПЦР-20 инфекций .

Правила взятия материала

Биологическими образцами, которые могут быть исследованы с помощью ПЦР, могут являться практически любые секреты организма - кровь, слюна, моча, сперма, кал, мокрота, отделяемое половых путей, спинномозговая, плевральная, суставная жидкость, а также эпителиальные соскобы и биоптаты. Однако точность результатов во многом зависит не только от неукоснительного соблюдения методики анализа, но и от правильности сбора и транспортировки исследуемого материала.

Забор любых биологических образцов для ПЦР-диагностики производится в условиях процедурного кабинета. Для этих целей используется исключительно стерильный (желательно, одноразовый) инструментарий и контейнеры. Для взятия крови применяются специальные вакуумные системы и одноразовые пробирки с антикоагулянтом. Соблюдение асептики и антисептики позволяет исключить контаминацию материала извне и, следовательно, получение недостоверных данных.

Существуют определенные требования при подготовке к анализу. Так, перед сдачей мазков и соскобов из урогенитального тракта необходимо за 3 суток до анализа исключить половые контакты, не подмываться антибактериальными средствами, не мочиться за 3 часа. У женщин биоматериал рекомендуется брать накануне менструации или через 1-2 дня после ее окончания, поскольку в эти периоды численность возбудителей инфекции максимально высока. Забор крови для ПЦР-диагностики должен производиться в утренние часы натощак. Если материалом для исследования служит моча, то собирается ее первая утренняя порция. Перед сдачей слюны полость рта требуется трехкратно прополоскать физиологическим раствором.

Взятую пробу необходимо как можно скорее доставить в диагностическую лабораторию (при невозможности незамедлительной транспортировки материал хранится в холодильнике при температуре от +4°С до +8°С). В отношении некоторых видов биоматериала допускается однократное замораживание и оттаивание. Контейнеры (пробирки) с пробами должны быть промаркированы и снабжены направлением на ПЦР-исследование, заполненным по установленной форме. Окончательный результат ПЦР анализа бывает готов уже в течение 1-2 суток (иногда буквально через несколько часов).

Результаты

Качественный результат ПЦР-обследования может быть положительным либо отрицательным. Положительный анализ указывает на выявление искомых инфекционных агентов в исследуемом материале; отрицательный – на их отсутствие. Получение ложноотрицательных результатов практически исключено; их минимальный процент может быть связан с латентной инфекцией или хронической инфекцией вне обострения. Ложноположительные реакции обычно обусловлены человеческим фактором (неправильным сбором, хранением и транспортировкой образцов, нарушением методики проведения ПЦР).

Количественная оценка (определение числа комплектов ДНК или РНК возбудителя в образцах материала, МЕ/мл) позволяет судить о так называемой вирусной/бактериальной нагрузке на организм, т. е. активности течения инфекционного процесса. Количественный анализ помогает подобрать дозу лекарственных препаратов и определиться с длительностью курса лечения. Через 1 месяц после завершения этиотропной терапии проводится контрольное ПЦР-исследование.

Сдать анализы методом ПЦР в Москве можно в специализированных лабораториях и лабораторных отделениях медицинских центров, оборудованных необходимой аппаратурой и тест-системами. Цена на ПЦР зависит от количества определяемых возбудителей, качественного или количественного тестирования, вида анализируемого материала.