Основные мишени молекулярной структуры при воздействиях. Молекулярные мишени

Статья дает базовое представление о том, как в современном мире создаются лекарства. Рассмотрены история драг-дизайна, основные понятия, термины и технологии, применяющиеся в этой сфере. Особое внимание уделено роли вычислительной техники в этом наукоемком процессе. Описаны методы поиска и валидации биологических мишеней для лекарственных препаратов, высокопроизводительный скрининг, процессы клинических и доклинических испытаний лекарств а также применение компьютерных алгоритмов.

Драг-дизайн: история

Индустрия направленного конструирования новых лекарственных препаратов, или, как этот процесс называют, калькируя с английского за неимением такого же короткого и удобного русского термина, драг-дизайн (drug - лекарственный препарат, design - проектирование, конструирование) - сравнительно молодая дисциплина, но все же не настолько молодая, как это принято считать .

Рисунок 1. Пауль Эрлих, впервые выдвинувший гипотезу о существовании хеморецепторов и их возможного использования в медицине.

Национальная библиотека медицины США

К концу девятнадцатого века химия достигла значительной степени зрелости. Была открыта таблица Менделеева, разработана теория химической валентности, теория кислот и оснований, теория ароматических соединений. Этот несомненный прогресс дал толчок и медицине. Новые химические продукты - синтетические краски, производные смол, начали использоваться в медицине для дифференциального окрашивания биологических тканей. В 1872–1874 годах в Страсбурге, в лаборатории известного анатома Вильгельма Валдеера, студент-медик Пауль Эрлих (рис. 1), изучавший селективную окраску тканей, впервые выдвинул гипотезу о существовании хеморецепторов - специальных тканевых структур, специфически взаимодействующих с химическими веществами, и постулировал возможность использования этого феномена в терапии различных заболеваний. Позже, в 1905 году, эта концепция была расширена Дж. Лэнгли, предложившим модель рецептора как генератора внутриклеточных биологических импульсов, который активируется агонистами и инактивируется антагонистами.

Этот момент можно считать рождением хемотерапии и новым витком в фармакологии, и в 20-м веке это привело к беспрецедентному успеху в клинической медицине. Одним из самых громких достижений фармакологической промышленности 20-го века можно по праву назвать пенициллин, антибиотик, открытый в 1929 году Александром Флемингом и исследованный впоследствии Чейном и Флори. Пенициллин, обладающий антибактериальным действием, сослужил человечеству незаменимую службу в годы Второй мировой войны, сохранив жизни миллионам раненых.

Пораженные успехом пенициллина, многие фармацевтические компании открыли собственные микробиологические подразделения, возлагая на них надежды по открытию новых антибиотиков и других лекарств. Последовавшие успехи биохимии привели к тому, что стало возможным теоретически предсказывать удачные мишени для терапевтического воздействия, а также модификации химических структур лекарств, дающих новые соединения с новыми свойствами. Так, антибиотик сульфаниламид в результате ряда исследований дал начало целым семействам гипогликемических, диуретических и антигипертензивных препаратов. Драг-дизайн поднялся на качественно новый уровень, когда разработка новых лекарственных соединений стала не просто плодом работы воображения химиков, а результатом научного диалога между биологами и химиками.

Новый прорыв был связан с развитием молекулярной биологии, позволившей привлечь к разработкам информацию о геноме, клонировать гены, кодирующие терапевтически важные биологические мишени и экспрессировать их белковые продукты.

Завершение ознаменовавшего начало нового тысячелетия проекта «геном человека», в результате которого была прочитана полная информация, содержащаяся в ДНК человека, явилось настоящим триумфом раздела биологической науки, получившей название «геномика». Геномика дает совершенно новый подход к поиску новых терапевтически важных мишеней, позволяя искать их непосредственно в нуклеотидном тексте генома.

Геном человека содержит 12000–14000 генов, кодирующих секретируемые белки. На данный момент в фармацевтической промышленности используется не более 500 мишеней. Существуют исследования, говорящие, что многие заболевания являются «мультифакторными», то есть обуславливаются дисфункцией не одного белка или гена, а 5–10 связанных между собой белков и кодирующих их генов. Исходя из этих соображений можно заключить, что количество исследуемых мишеней должно увеличиться минимум в 5 раз.

Биохимическая классификация исследуемых в настоящее время биологических мишеней и их численное соотношение представлены на рисунке 2. Особо следует отметить, что бóльшую (>60%) долю рецепторов составляют мембранные G-белок сопряженные рецепторы (GPCR , G-protein coupled receptors ), а суммарный объем продаж лекарств, направленных на взаимодействие с ними, равняется 65 млрд. долл. ежегодно, и продолжает расти.

Основные понятия

Рисунок 3. Три типа влияния лигандов на клеточный ответ: увеличение ответа (положительный агонгист ), постоянство ответа, но конкурирование за связывании с другими лигандами (нейтральный агонист ) и уменьшение ответа (антагонист ).

Основные понятия, используемые в драг-дизайне - это мишень и лекарство . Мишень - это макромолекулярная биологическая структура, предположительно связанная с определенной функцией, нарушение которой приводит к заболеванию и на которую необходимо совершить определенное воздействие. Наиболее часто встречающиеся мишени - это рецепторы и ферменты. Лекарство - это химическое соединение (как правило, низкомолекулярное), специфически взаимодействующее с мишенью и тем или иным образом модифицирующее клеточный ответ, создаваемый мишенью.

Если в качестве мишени выступает рецептор, то лекарство будет, скорее всего, его лигандом, то есть соединением, специфическим образом взаимодействующим с активным сайтом рецептора. В отсутствие лиганда рецептор характеризуется собственным уровнем клеточного ответа - так называемой базальной активностью.

По типу модификации клеточного ответа лиганды делят на три группы (рис. 3):

Агонисты увеличивают клеточный ответ.
Нейтральные агонисты связываются с рецептором, но не изменяют клеточный ответ по сравнению с базальным уровнем.
Обратные агонисты, или антагонисты понижают клеточный ответ.

Степень взаимодействия лиганда с мишенью измеряют аффинностью, или сродством. Аффинность равна концентрации лиганда, при которой половина мишеней связана с лигандом. Биологической же характеристикой лиганда является его активность, то есть та концентрация лиганда, при которой клеточный ответ равен половине максимального.

Определение и валидация мишени

Один из самых ранних и самых важных этапов драг-дизайна - выбрать правильную мишень, воздействуя на которую можно специфическим образом регулировать одни биохимические процессы, по возможности не затрагивая при этом другие. Однако, как уже было сказано, такое не всегда возможно: далеко не все заболевания являются следствием дисфункции только одного белка или гена.

С наступлением постгеномной эры, определение мишеней происходит с использованием методов сравнительной и функциональной геномики. На основании филогенетического анализа в геноме человека выявляются гены, родственные генам, функции чьих белковых продуктов уже известны, и эти гены могут быть клонированы для дальнейшего исследования.

Однако мишени, чьи функции определены лишь гипотетически, не могут служить отправной точкой для дальнейших исследований. Необходима многоступенчатая экспериментальная валидация, в результате которой может быть понята конкретная биологическая функция мишени применительно к фенотипическим проявлениям исследуемой болезни.

Существует несколько методов экспериментальной валидации мишеней:

геномные методы заключаются в подавлении синтеза мишени в тестовой системе путем получения мутантов с генным нокаутом (в которых ген мишени попросту отсутствует) или использования РНК-антисмысловых последовательностей, «выключающих» тот или иной ген;
мишени можно инактивировать с помощью моноклональных антител или облучая мишень, модифицированную хромофором, лазерным излучением;
мишени можно инактивировать с помощью низкомолекулярных лигандов-ингибиторов;
также можно непосредственно производить валидацию мишени, устанавливая ее взаимодействие с тем или иным соединением методом плазмонного резонанса.

Уровень валидации мишени повышается с числом модельных животных (специальных генетических линий лабораторных животных), в которых модификация мишени приводит к желаемому фенотипическому проявлению. Высшим уровнем валидации является, несомненно, демонстрация того, что модификация мишени (например, блокирование или нокаут рецептора или ингибирование фермента) приводит к клинически идентифицируемым и воспроизводимым симптомам у человека, однако, понятно, такое можно наблюдать достаточно редко.

Кроме того, при выборе мишени не следует забывать о таком явлении, как полиморфизм - то есть о том, что ген может существовать в разных изоформах у разных популяций или рас людей, что приведет к разному эффекту лекарства на разных больных.

Когда мишень уже найдена и проверена на валидность, начинаются непосредственные исследования, результатом которых являются многочисленные структуры химических соединений, лишь немногим из которых суждено стать лекарствами.

Исследование всех возможных с химической точки зрения лигандов («химическое пространство») невозможно: простая прикидка показывает, что возможно не менее 10 40 различных лигандов, в то время как с момента возникновения вселенной прошло лишь ~10 17 секунд. Поэтому на возможную структуру лигандов накладывается ряд ограничений, который существенно сужает химическое пространство (оставляя его, тем не менее, совершенно необъятным). В частности, для сужения химического пространства накладываются условия подобия лекарству (drug-likeness ), которые в простом случае можно выразить правилом пяти Липинского, согласно которому соединение, чтобы «быть похожим» на лекарство, должно:

иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи;
обладать молекулярным весом менее 500;
иметь липофильность (log P - коэффициент распределения вещества на границе раздела вода-октанол) менее 5;
иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (грубая оценка количества акцепторов водородной связи).

В качестве стартового набора лигандов, исследуемых на способность связываться с мишенью, обычно используют так называемые библиотеки соединений, либо поставляемые на коммерческой основе специализирующимися на этом компаниями, либо содержащиеся в арсенале фармацевтической компании, проводящей разработку нового лекарства или заказавшей его у сторонней фирмы. Такие библиотеки содержат тысячи и миллионы соединений. Этого, конечно, совершенно недостаточно для тестирования всех возможных вариантов, но этого, как правило, и не требуется. Задачей на этом этапе исследования является выявление соединений, способных после дальнейшей модификации, оптимизации и тестирования дать «кандидат» - соединение, предназначенное для тестирования на животных (доклинические исследования) и на людях (клинические исследования).

Этот этап осуществляется с помощью высокопроизводительного скрининга (in vitro ) или его компьютерного (in silico ) анализа - высокопроизводительного докинга.

Комбинаторная химия и высокопроизводительный скрининг

Скринингом называется оптимизированная конвейеризованная процедура, в результате которой большое количество химических соединений (>10 000) проверяется на аффинность или активность по отношению к специальной тестовой (имитирующей биологическую) системе. По производительности различают разные виды скрининга:

низкопроизводительный (10000–50000 образцов);
среднепроизводительный (50000–100000 образцов);
высокопроизводительный (100000–5000000+ образцов).

Для скрининга как для «промышленной» процедуры очень критична эффективность, стоимость и время, потраченное на операцию. Как правило, скрининг производится на роботизированных установках, способных работать в круглосуточном и круглогодичном режиме (рис. 4).

Рисунок 4. Аппаратура, используемая для высокопроизводительного скрининга. А - Роботизированная пипетка, в автоматическом высокопроизводительном режиме наносящая образцы тестируемых соединений в плашку с системой для скрининга. Типичное количество углублений на плашке - тысячи. Объем системы в одной лунке - микролитры. Объем вносимого образца - нанолитры. Б - Установка для высокопроизводительного скрининга и считывания флуоресцентного сигнала Mark II Scarina. Работает с плашками, содержащими 2048 углублений (NanoCarrier). Полностью автоматическая (работает в круглосуточном режиме). Производительность - более 100 000 лунок (образцов) в день.

Принцип скрининга достаточно прост: в плашки, содержащие тестовую систему (например, иммобилизованная мишень или специальным образом модифицированные целые клетки), робот раскапывает из пипетки исследуемые вещества (или смесь веществ), следуя заданной программе. Причем на одной плашке могут находиться тысячи «лунок» с тестовой системой, и объем такой лунки может быть очень мал, так же как и объем вносимой пробы (микро- или даже нанолитры).

Потом происходит считывание данных с плашки, говорящее о том, в какой лунке обнаружена биологическая активность, а в какой - нет. В зависимости от используемой технологии детектор может считывать радиоактивный сигнал, флюоресценцию (если система построена с использованием флуоресцентных белков), биолюминесценцию (если используется люциферин-люциферазная система или ее аналоги), поляризацию излучения и многие другие параметры.

Обычно в результате скрининга количество тестируемых соединений сокращается на 3–4 порядка. Соединения, для которых в процессе скрининга выявлена активность выше заданного значения, называются прототипами. Однако следует понимать, что такие «удачи» еще очень и очень далеки от конечного лекарства. Лишь те из них, которые сохраняют свою активность в модельных системах и удовлетворяют целому ряду критериев, дают предшественников лекарств, которые используются для дальнейших исследований.

Как уже было сказано, даже библиотеки, содержащие более миллиона соединений, не в состоянии представить все возможное химическое пространство лигандов. Поэтому при проведении скрининга можно выбрать две различные стратегии: диверсификационный скрининг и сфокусированный скрининг . Различие между ними заключается в составе используемых библиотек соединений: в диверсификационном варианте используют как можно более непохожие друг на друга лиганды с целью охватить как можно большую область химического пространства, при сфокусированном же, наоборот, используют библиотеки родственных соединений, полученных методами комбинаторной химии, что позволяет, зная приблизительную структуру лиганда, выбрать более оптимальный его вариант. Здравый смысл подсказывает, что в масштабном проекте по созданию нового лекарственного препарата следует использовать оба этих подхода последовательно - сначала диверсификационный, с целью определения максимально различных классов удачных соединений, а потом - сфокусированный, с целью оптимизации структуры этих соединений и получения рабочих прототипов.

Если для мишени известно так называемое биологическое пространство, то есть какие-либо характеристики лигандов (размер, гидрофобность и т.д.), которые могут с ней связываться, то при составлении библиотеки тестируемых соединений выбирают лиганды, попадающие в «пересечение» биологического и химического пространств, так как это заведомо повышает эффективность процедуры.

Структуры прототипов, полученные в результате скрининга, далее подвергаются разнообразным оптимизациям, проводимым в современных исследованиях, как правило, в тесном сотрудничестве между различными группами исследователей: молекулярными биологами, фармакологами, моделистами и медицинскими химиками (рис. 5).

Рисунок 5. Фармакологический цикл. Группа молекулярной биологии отвечает за получение мутантных мишеней, группа фармакологии - за измерение данных по активности и аффинности синтезированных лигандов на мишенях дикого типа и мутантных, группа моделирования - за построение моделей мишеней, предсказание их мутаций и предсказание структур лигандов, группа медицинской химии - за синтез лигандов.

С каждым оборотом такого «фармакологического цикла» прототип приближается к предшественнику и затем к кандидату, который уже тестируется непосредственно на животных (доклинические испытания) и на людях - в процессе клинических испытаний.

Таким образом, роль скрининга заключается в существенном сокращении (на несколько порядков) выборки прототипов (рис. 6).

Рисунок 6. Роль высокопроизводительного скрининга в разработке нового лекарственного препарата. Скрининг, будь то его лабораторный (in vitro ) или компьютерный (in silico ) вариант, - главная и наиболее ресурсоемкая процедура по выбору стартовых структур лекарств (прототипов) из библиотек доступных соединений. Выходные данные скрининга часто являются отправной точкой для дальнейшего процесса разработки лекарства.

Клинические исследования

Медицина - это область, в которой ни в коем случае не следует спешить. В особенности, если речь идет о разработке новых лекарственных препаратов. Достаточно вспомнить историю с препаратом Талидамидом, разработанным в конце 50-х в Германии, применение которого беременными женщинами приводило к рождению детей с врожденными пороками конечностей, вплоть до их полного отсутствия. Этот побочный эффект не был вовремя выявлен во время клинических исследований в силу недостаточно тщательного и аккуратного тестирования.

Поэтому в настоящее время процедура тестирования лекарств достаточно сложна, дорога и требует значительного времени (2–7 лет тестирования в клинике и от 100 миллионов долларов на одно соединение-кандидат, см. рис. 7).

Рисунок 7. Процесс разработки нового лекарства занимает от 5 до 16 лет. Затраты на клиническое тестирование одного соединения-кандидата составляют более 100 миллионов долларов США. Суммарная стоимость разработки, с учетом препаратов, не достигших рынка, часто превышает 1 миллиард долларов.

Прежде всего, еще до поступления в клинику, препараты исследуются на токсичность и канцерогенность, причем исследования должны проводиться, кроме систем in vitro , как минимум на двух видах лабораторных животных. Токсичные препараты, само собой, в клинику не попадают, за исключением тех случаев, когда они предназначены для терапии особо тяжелых заболеваний и не имеют пока менее токсичных аналогов.

Кроме того, препараты подвергаются фармакокинетическим исследованиям, то есть тестируются на такие физиологические и биохимические характеристики, как поглощение, распределение, метаболизм и выведение (по-английски обозначается аббревиатурой ADME - Absorption, Distribution, Metabolism and Extraction ). Биодоступность, например, является подхарактеристикой введения препарата в организм, характеризующая степень потери им биологических свойств при введении в организм. Так, инсулин, принимаемый перорально (через рот), имеет низкую биодоступность, так как, будучи белком, расщепляется желудочными ферментами. Поэтому инсулин вводят либо подкожно, либо внутримышечно. По этой же причине часто разрабатывают препараты, действующие аналогично своим природным прототипам, но имеющие небелковую природу.

Юридически процесс клинических исследований новых препаратов имеет очень много нюансов, так как они требуют огромного количества сопроводительной документации (в сумме несколько тысяч страниц), разрешений, сертификаций и т.д. Кроме того, многие формальные процедуры сильно разнятся в разных странах в силу различного законодательства. Поэтому, для решения этих многочисленных вопросов, существуют специальные компании, принимающие от крупных фармацевтических компаний заказ на проведение клинических испытаний и перенаправляющие их в конкретные клиники, сопровождая весь процесс полной документацией и следя, чтобы никакие формальности не были нарушены.

Роль вычислительной техники в драг-дизайне

В настоящее время в драг-дизайне, как и в большинстве других наукоемких областей, продолжает увеличиваться роль вычислительной техники. Следует сразу оговорить, что современный уровень развития компьютерных методик не позволяет разработать новый лекарственный препарат, используя только компьютеры. Основные преимущества, которые дают вычислительные методы в данном случае - это сокращение времени выпуска нового лекарства на рынок и снижение стоимости разработки.

Основные компьютерные методы, используемые в драг-дизайне, это:

молекулярное моделирование (ММ);
виртуальный скрининг;
дизайн новых лекарственных препаратов de novo ;
оценка свойств «подобия лекарству»;
моделирование связывания лиганд-мишень.

Методы ММ, основывающиеся на структуре лиганда

В случае, если ничего не известно про трехмерную структуру мишени (что случается достаточно часто), прибегают к методикам создания новых соединений исходя из информации о структуре уже известных лигандов и данных по их активности.

Подход основывается на общепринятой в химии и биологии парадигме, гласящей, что структура определяет свойства. Основываясь на анализе корреляций между структурой известных соединений и их свойствами, можно предсказать структуру нового соединения, обладающего желаемыми свойствами (или же, наоборот, для известной структуры предсказать свойства). Причем, этот подход используется как при модификации известных структур с целью улучшения их свойств, так и при поиске новых соединений используя скрининг библиотек соединений.

Методы определения похожести молекул (или методы отпечатков пальцев) состоят в дискретном учете определенных свойств молекулы, называемых дескрипторами (например, число доноров водородной связи, число бензольных колец, наличие определенного заместителя в определенном положении и т.д.) и сравнивании получившегося «отпечатка» с отпечатком молекулы с известными свойствами (используемой в качестве образца). Степень похожести выражается коэффициентом Танимото, изменяющимся в диапазоне 0–1. Высокая похожесть предполагает близость свойств сравниваемых молекул, и наоборот.

Методы, основывающиеся на известных координатах атомов лиганда, называются методами количественной связи между структурой и активностью (QSAR , Quantitative Structure-Activity Relationship ). Один из наиболее используемых методов этой группы - метод сравнительного анализа молекулярных полей (CoMFA , Comparative Molecular Field Analysis ). Этот метод заключается в приближении трехмерной структуры лиганда набором молекулярных полей, отдельно характеризующих его стерические, электростатические, донорно-акцепторные и другие свойства. CoMFA модель строится на основании множественного регрессионного анализа лигандов с известной активностью и описывает лиганд, который должен хорошо связываться с исследуемой мишенью, в терминах молекулярных полей. Полученный набор полей говорит, в каком месте у лиганда должен быть объемный заместитель, а в каком - маленький, в каком полярный, а в каком - нет, в каком донор водородной связи, а в каком - акцептор, и т.д.

Модель может использоваться в задачах виртуального скрининга библиотек соединений, выступая в данном случае аналогом фармакофора. Самым главным недостатком этого метода является то, что он обладает высокой предсказательной силой лишь на близких классах соединений; при попытке же предсказать активность соединения другой химической природы, чем лиганды, использовавшиеся для построения модели, результат может оказаться недостаточно достоверным.

Схема возможного процесса создания нового лекарства, основывающегося на структуре лиганда, приведена на рисунке 8.

Рисунок 8. Пример молекулярного моделирования, основывающегося на структуре лиганда. Для циклического пептида уротензина II (внизу слева ) определена трехмерная структура методом ЯМР спектроскопии водного раствора (вверху слева ). Пространственное взаиморасположение аминокислотных остатков мотива ТРП-ЛИЗ-ТИР, являющегося важным для биологической функции, было использовано для построения модели фармакофора (вверху справа ). В результате виртуального скрининга найдено новое соединение, демонстрирующее биологическую активность (внизу справа ).

Очевидно, что достоверность моделирования, как и эффективность всего процесса конструирования нового лекарства, можно существенно повысить, если учитывать данные не только о структуре лигандов, но и о структуре белка-мишени. Методы, учитывающие эти данные, носят общее название «драг-дизайн, основывающийся на структурной информации» (SBDD , Structure-Based Drug Design ).

Методы ММ, основывающиеся на структуре белка

В связи с растущим потенциалом структурной биологии, все чаще можно установить экспериментальную трехмерную структуру мишени, или построить ее молекулярную модель, основываясь на гомологии с белком, чья трехмерная структура уже определена.

Наиболее часто используемые методы определения трехмерной структуры биомакромолекул с высоким разрешением (Часто, когда экспериментальная структура мишени все же недоступна, прибегают к моделированию на основании гомологии - методу, для которого показано, что построенная им модель обладает достаточно высоким качеством, если гомология между структурным шаблоном и моделируемым белком не ниже 40%.

Особенно часто к моделированию по гомологии прибегают при разработке лекарств, направленных на G-белок сопряженные рецепторы, так как они, будучи мембранными белками, очень плохо поддаются кристаллизации, а методу ЯМР пока недоступны такие большие белки. Для этого семейства рецепторов известна структура только одного белка - бычьего родопсина, полученная в 2000 г. в Стэнфорде, которая и используется в качестве структурного шаблона в подавляющем числе исследований .

Обычно при исследовании, базирующемся на структурных данных, учитывают также данные по мутагенезу мишени, чтобы установить, какие аминокислотные остатки наиболее важны для функционирования белка и связывания лигандов. Эти сведения особенно ценны при оптимизации построенной модели, которая, будучи лишь производной от структуры белка-шаблона, не может учитывать всей биологической специфики моделируемого объекта.

Трехмерная структура мишени, кроме того, что может объяснить молекулярный механизм взаимодействия лиганда с белком, используется в задачах молекулярного докинга, или компьютерном моделировании взаимодействия лиганда с белком. Докинг использует в качестве стартовой информации трехмерную структуру белка (на данном этапе развития технологии, как правило, конформационно неподвижную), и структуру лиганда, конформационная подвижность и взаиморасположение с рецептором которого моделируется в процессе докинга. Результатом докинга является конформация лиганда, наилучшим образом взаимодействующая с белковым сайтом связывания, с точки зрения оценочной функции докинга, приближающей свободную энергию связывания лиганда. Реально, в силу множества приближений, оценочная функция далеко не всегда коррелирует с соответствующей экспериментальной энергией связывания.

Докинг позволяет сократить затраты средств и времени за счет проведения процедуры, аналогичной высокопроизводительному скринингу, на компьютерных комплексах. Эта процедура называется виртуальным скринингом, и основным ее преимуществом является то, что для реальных фармакологических испытаний нужно приобретать не целую библиотеку, состоящую из миллиона соединений, а только «виртуальные прототипы». Обычно же, с целью избежания ошибок, скрининг и докинг используются одновременно, взаимно дополняя друг друга (рис. 9).

Рисунок 9. Два варианта совместного использования высокопроизводительного скрининга и молекулярного моделирования. Сверху: последовательный итеративный скрининг. На каждом шаге процедуры используется сравнительно небольшой набор лигандов; по результатам скрининга строится модель, объясняющая связь между структурой и активностью. Модель используется для выбора следующего набора лигандов для тестирования. Снизу: «разовый» скрининг. На каждом шаге модель строится по обучающей выборке и используется для предсказаний на тестовой выборке.

С увеличением компьютерных мощностей и появлением более корректных и физичных алгоритмов, докинг будет лучше оценивать энергию связывания белка с лигандом, начнет учитывать подвижность белковых цепей и влияние растворителя. Однако, неизвестно, сможет ли виртуальный скрининг когда-нибудь полностью заменить реальный биохимический эксперимент; если да - то для этого необходим, очевидно, качественно новый уровень алгоритмов, неспособных на сегодняшний день абсолютно корректно описать взаимодействие лиганда с белком.

Одно из явлений, иллюстрирующих несовершенство алгоритмов докинга, - парадокс похожести. Этот парадокс заключается в том, что соединения, структурно совсем немного различающиеся, могут иметь драматически различную активность, и в то же время с точки зрения алгоритмов докинга быть практически неразличимыми.

Прототипы лекарства можно получать не только выбирая из уже подготовленной базы данных соединений. Если есть структура мишени (или хотя бы трехмерная модель фармакофора), возможно построение лигандов de novo, используя общие принципы межмолекулярного взаимодействия. При этом подходе в сайт связывания лиганда помещается один или несколько базовых молекулярных фрагментов, и лиганд последовательно «наращивается» в сайте связывания, подвергаясь оптимизации на каждом шаге алгоритма. Полученные структуры, так же, как и при докинге, оцениваются с помощью эмпирических оценочных функций.

Ограничения применения компьютерных методов

Несмотря на всю свою перспективность, компьютерные методы имеют ряд ограничений, которые необходимо иметь ввиду, чтобы правильно представлять себе возможности этих методов.

Прежде всего, хотя идеология in silico подразумевает проведение полноценных компьютерных экспериментов, то есть экспериментов, результаты которых ценны и достоверны сами по себе, необходима обязательная экспериментальная проверка полученных результатов. То есть, подразумевается тесное сотрудничество научных групп, проводящих компьютерный эксперимент, с другими экспериментальными группами (рис. 5).

Кроме того, компьютерные методы пока не в силах учесть всего разнообразия влияния лекарственного препарата на организм человека, поэтому эти методы не в силах ни упразднить, ни даже существенно сократить клиническое тестирование, занимающее основную долю времени в разработке нового препарата.

Таким образом, на сегодняшний день роль компьютерных методов в драг-дизайне сводится к ускорению и удешевлению исследований, предшествующих клиническим испытаниям.

Перспектива драг-дизайна

Рисунок 1. Типы молекулярных мишеней для действия лекарственных средств .

Молекулярная мишень -- это молекула или молекулярный ансамбль, имеющий специфический центр связывания для биологически активного соединения. Молекулярная мишень может быть представлена мембранными белками, распознающими гормоны или нейротрансмиттеры (рецепторы), а также ионными каналами, нуклеиновыми кислотами, молекулами-переносчиками или ферментами. Как видно из Рисунка 2, не все лекарственные соединения воздействуют на рецепторы. Большинство лекарственных средств должны связаться с молекулярной мишенью, чтобы произвести эффект, но существуют и исключения. Уже в первых исследованиях эффектов лекарств на тканях животных в конце XIX в. стало ясно, что большинство ФАВ реализуют специфическое действие в определенных тканях, т.е. соединение, которое оказывает эффект на один тип ткани, может не влиять на другой; одно и то же вещество может оказывать совершенно разные эффекты на разные ткани. Например, алкалоид пилокарпин, как и нейротрансмиттер ацетилхолин, вызывает сокращение гладких мышц кишечника и тормозит частоту сердечных сокращений. С учетом этих феноменов Сэмуэль Лэнгли (1852-1925) в 1878 г., основываясь на изучении эффектов алкалоидов пилокарпина и атропина на слюноотделение, предположил, что «существуют некие рецепторные вещества... с которыми оба могут образовывать соединения». Позже, в 1905 г., изучая действие никотина и кураре на скелетные мышцы, он обнаружил, что никотин вызывает сокращения, когда действует на определенные небольшие участки мышц. Лэнгли заключил, что «рецепторная субстанция» для никотина находится в этих участках и что кураре действует путем блокады взаимодействия никотина с рецептором .

Рисунок 2. Эффективность по отношению к эндогенному агонисту.

Таким образом, очевидно, что действие некоторых соединение может быть обусловлено не столько развитием биологического ответа на связывание с молекулярной мишенью, сколько препятствием связыванию эндогенного лиганда. Действительно, если рассматривать взаимодействие лиганда и рецептора, можно отметить, что существующие в настоящее время лекарственные соединения могут играть роль как агониста, так и антагониста. На Рисунке 3 можно увидеть более подробную классификацию лигандов по отношению к эффектам, ими обусловленными. Агонисты различаются по силе и направлению физиологического ответа, вызываемого ими. Данная классификация не связана с аффинностью лигандов и опирается лишь на величину отклика рецептора. Таким образом, можно выделить следующие классы агонистов:

o Суперагонист -- соединение, способное вызывать более сильный физиологический ответ, чем эндогенный агонист.

o Полный агонист -- соединение, вызывающее такой же отклик, как эндогенный агонист (например, изопреналин, агонист в-адренорецепторов).

o В случае меньшего отклика соединение называют частичным агонистом (например, арипипразол -- частичный агонист дофаминовых и серотониновых рецепторов).

o В случае если у рецептора имеется базальная (конститутивная) активность, некоторые вещества -- обратные агонисты -- могут уменьшать её. В частности, обратные агонисты рецепторов ГАМК A обладают анксиогенным или спазмогеннымдействием, однако могут усиливать когнитивные способности .

Рассматривая механизм связывания лиганда и рецепторной молекулы, можно увидеть, что специфичность и сила связывания обусловлена особенностями строения обоих компонентов. В частности, важную роль играет активный центр белков - определённый участок белковой молекулы, как правило, находящийся в её углублении ("кармане"), сформированный радикалами аминокислот, собранных на определённом пространственном участке при формировании третичной структуры и способный комплементарно связываться с лигандом. В линейной последовательности полипептидной цепи радикалы, формирующие активный центр, могут находиться на значительном расстоянии друг от друга.

Высокая специфичность связывания белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра белка структуре лиганда. Под комплементарностью понимают пространственное и химическое соответствие взаимодействующих молекул. Лиганд должен обладать способностью входить и пространственно совпадать с конформацией активного центра. Это совпадение может быть неполным, но благодаря конформационной лабильности белка активный центр способен к небольшим изменениям и "подгоняется" под лиганд. Кроме того, между функциональными группами лиганда и радикалами аминокислот, образующих активный центр, должны возникать связи, удерживающие лиганд в активном центре. Связи между лигандом и активным центром белка могут быть как нековалентными (ионными, водородными, гидрофобными), так и ковалентными. Активный центр белка - относительно изолированный от окружающей белок среды участок, сформированный аминокислотными остатками. В этом участке каждый остаток благодаря своему индивидуальному размеру и функциональным группам формирует "рельеф" активного центра.

Объединение таких аминокислот в единый функциональный комплекс изменяет реакционную способность их радикалов, подобно тому, как меняется звучание музыкального инструмента в ансамбле. Поэтому аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, часто называют "ансамблем" аминокислот.

Уникальные свойства активного центра зависят не только от химических свойств формирующих его аминокислот, но и от их точной взаимной ориентации в пространстве. Поэтому даже незначительные нарушения общей конформации белка в результате точечных изменений его первичной структуры или условий окружающей среды могут привести к изменению химических и функциональных свойств радикалов, формирующих активный центр, нарушать связывание белка с лигандом и его функцию. При денатурации активный центр белков разрушается, и происходит утрата их биологической активности.

Часто активный центр формируется таким образом, что доступ воды к функциональным группам его радикалов ограничен, т.е. создаются условия для связывания лиганда с радикалами аминокислот.

В некоторых случаях лиганд присоединяется только к одному из атомов, обладающему определённой реакционной способностью, например присоединение О 2 к железу миоглобина или гемоглобина. Однако свойства данного атома избирательно взаимодействовать с О 2 определяются свойствами радикалов, окружающих атом железа в составе тема. Гем содержится и в других белках, таких как цитохромы. Однако функция атома железа в цитохромах иная, он служит посредником для передачи электронов от одного вещества другому, при этом железо становится то двух-, то трёхвалентным.

Центр связывания белка с лигандом часто располагается между доменами. Например, протеолитический фермент трипсин, участвующий в гидролизе пептидных связей пищевых белков в кишечнике, имеет 2 домена, разделённых бороздкой. Внутренняя поверхность бороздки формируется аминокислотными радикалами этих доменов, стоящими в полипептидной цепи далеко друг от друга (Сер 177 , Гис 40 , Асп 85).

Разные домены в белке могут перемещаться друг относительно друга при взаимодействии с лигандом, что облегчает дальнейшее функционирование белка. В качестве примера можно рассмотреть работу гексокиназы, фермента, катализирующего перенос фосфорного остатка с АТФ на молекулу глюкозы (при её фосфорилировании). Активный центр гексокиназы располагается в расщелине между двумя доменами. При связывании гексокиназы с глюкозой окружающие её домены сближаются, и субстрат оказывается в "ловушке", что облегчает его дальнейшее фосфорилирование.

Основное свойство белков, лежащее в основе их функций, - избирательность присоединения к определённым участкам белковой молекулы специфических лигандов.

Классификация лигандов

· Лигандами могут быть неорганические (часто ионы металлов) и органические вещества, низкомолекулярные и высокомолекулярные вещества;

· существуют лиганды, которые изменяют свою химическую структуру при присоединении к активному центру белка (изменения субстрата в активном центре фермента);

· существуют лиганды, присоединяющиеся к белку только в момент функционирования (например, О 2 , транспортируемый гемоглобином), и лиганды, постоянно связанные с белком, выполняющие вспомогательную роль при функционировании белков (например, железо, входящее в состав гемоглобина).

В тех случаях, когда аминокислотные остатки, формирующие активный центр, не могут обеспечить функционирование данного белка, к определённым участкам активного центра могут присоединяться небелковые молекулы. Так, в активном центре многих ферментов присутствует ион металла (кофактор) или органическая небелковая молекула (кофермент). Небелковую часть, прочно связанную с активным центром белка и необходимую для его функционирования, называют"простатическая группа". Миоглобин, гемоглобин и цитохромы имеют в активном центре простетическую группу - гем, содержащий железо.

Соединение протомеров в олигомерном белке - пример взаимодействия высокомолекулярных лигандов. Каждый протомер, соединённый с другими протомерами, служит для них лигандом, так же как они для него.

Иногда присоединение какого-либо лиганда изменяет конформацию белка, в результате чего формируется центр связывания с другими лигандами. Например, белок кальмодулин после связывания с четырьмя ионами Са 2+ в специфических участках приобретает способность взаимодействовать с некоторыми ферментами, меняя их активность .

Важным понятием в теории взаимодействия лиганда и активного центра биологической мишени является «комплементарность». Активный центр фермента должен определенным образом соответствовать лиганду, что отражается в некоторых требованиях, предъявляемых к субстрату.

Рисунок 3. Схема взаимодействия лиганда и молекулярной мишени.

Так, например, ожидаемо, что для успешного взаимодействия необходимо соответствие размеров активного центра и лиганда (см. 2 положение на рисунке 3), что позволяет повысить специфичность взаимодействия и оградить активный центр от заведомо неподходящих субстратов. Вместе с тем, при возникновении комплекса «активный центр-лиганд» возможны следующие виды взаимодействий:

· вандерваальсовы связи (положение 1, рисунок 3), обусловленые флуктуациями электронных облаков вокруг противоположно поляризованных соседних атомов;

· электростатические взаимодействия (положение 3, рисунок 3), возникающие между противоположно заряженными группами;

· гидрофобные взаимодействия (положение 4, рисунок 3), обусловленные взаимным притяжением неполярных поверхностей;

· водородные связи (положение 5, рисунок 3), возникающие между подвижным атомом водорода и электроотрицательными атомами фтора, азота или кислорода.

Несмотря на относительно малую силу описанных взаимодействий (в сравнении с ковалентными связями), не стоит недооценивать их важность, отражающуюся в повышении аффинности связывания.

Обобщая вышесказанное, можно отметить, что процесс связывания лиганда и молекулярной мишени представляет собой высокоспецифический процесс, контролируемый как размером лиганда, так и его строением, что позволяет обеспечить селективность взаимодействия. Тем не менее, возможно взаимодействие между белком и не свойственным ему субстратом (т.н. конкурентное ингибирование), которое выражается в связывании с активного центра со схожим, но не целевым лигандом. Стоит отметить, что конкурентное ингибирование возможно как в естественных условиях (ингибирование малонатом фермента сукцинатдегидрогеназы, ингибирование фумаратгидратазы пиромеллитовой кислотой ), так и искусственно, во время приема лекарственных средств (ингибирование моноаминооксидазы ипрониазидом, ниаламидом, ингибирование дигидроптероатсинтетазы сульфаниламидами - структурными аналогами пара-аминобензойной кислоты, ингибирование ангиотензинпревращающего фермента каптоприлом, эналаприлом).

Таким образом, существует возможность целенаправленного изменения активности многих молекулярных систем при помощи синтетических соединений, имеющих строение, схожее с естественными субстратами.

Тем не менее, поверхностное понимание механизмов взаимодействия лигандов и молекулярных мишеней может быть чрезвычайно опасно и, зачастую, приводить к трагическим последствиям. Наиболее известным случаем можно считать т.н. «талидомидовую трагедию», которая привела вследствие приема беременными женщинами недостаточно изученного лекарственного соединения талидомида к рождение тысяч детей с врожденными уродствами.

Введение

Фармакологическая активность целиком и полностью определяется строением лекарственного вещества. Вместе с тем, химическое строение подразумевает под собой не только известную последовательность атомов в молекуле, но и их определенное пространственное расположение. Развитие фармакологического эффекта зачастую обусловлено конформационными изменениями, вызванными влиянием молекулы лекарственного вещества на молекулярную мишень. Активация или ингибирование функции рецепторов, трансмембранных каналов и ферментов находятся под управлением лигандов - специфических соединений, имеющих определенное сродство к соответствующим биологическим структурам. Очевидно, что интенсивность фармакологического эффекта обусловлена комплементарностью взаимодействия, полнота которого подразумевает не только требуемое расположение радикалов, но и форму молекулы, что объясняется необходимостью проникновения к активному центру молекулярной мишени.

Форма молекулы, расположение заряженных и неполярных радикалов детерминирует проникновение через мембраны клеток, ГЭБ и ГМБ, силу и продолжительность действия, а также скорость элиминации из системного кровотока.

Если рассматривать важность пространственного строения для фармацевтической химии, можно отметить, что направленное формирование структуры лекарственного соединения должным образом может улучшить его терапевтический профиль, увеличивая продолжительность действия или нивелируя побочные эффекты. Введение в молекулу гидрофобных фрагментов, например линейных алкильных «якорей» может увеличить сродство соединения к мембранам и возможность проникать соединения в клетку, что было продемонстрировано на примере т.н. «ионов Сукачева».

Введение «якорей» может также способствовать пролонгации действия лекарственного соединения, что обеспечивается повышением депонирования в жировой ткани и снижением метаболизма в печени и почках. Азатиоприн является пролекарством для 6-меркаптопурина, неспецифического цитостатика. В организме азатиоприн медленно метаболизируется с образованием 6-меркаптопурина, что, в конечном итоге, приводит к пролонгации действия.

Модификация молекулы может использоваться и для коррекции органолептических показателей, так, например, левомицетина стеарат, гидролизующийся в пищеверительном тракте до левомицетина, не обладает обжигающе-горьким вкусом, что позволяет сохранять изначальную фармакологическую активность при улучшении вкусовых характеристик.

Многие лекарственные средства, используемые в настоящее время на рынке, прошли долгий путь от изначальной задумки до конечной реализации, в ходе которого преследовалось увеличение целевой активности и снижение частоты и выраженности побочных эффектов, повышение стабильности и времени действия. Пространственное строение целиком и полностью определяет судьбу лекарственного средства в организме - возможность связывания его с молекулярными мишенями, возможность «избежать» нежелательных биотрансформаций, и, напротив, участвовать в необходимых превращениях.

1. Молекулярные мишени биологически активных веществ в организме

Рисунок 1. Типы молекулярных мишеней для действия лекарственных средств .

Рисунок 2. Эффективность по отношению к эндогенному агонисту.

o Суперагонист -- соединение, способное вызывать более сильный физиологический ответ, чем эндогенный агонист.

Классификация лигандов

Рисунок 3. Схема взаимодействия лиганда и молекулярной мишени.

2. Оптическая изомерия

2.1 Общая характеристика

Оптическая изомерия наблюдается у веществ, проявляющих оптическую активность, то есть способных вращать плоскополяризованный световой луч. Вещества, отклоняющие плоскость поляризации луча вправо, называются правовращающими, влево - левовращающими. Для того чтобы вещество было оптически активным, требуется выполнение единственного условия - молекула не должна иметь ни центра, ни плоскости симметрии. В простейшем случае это определяется наличием в молекуле так называемого асимметрического (хирального) атома. Существуют оптически активные молекулы и без асимметрического атома углерода, однако мы их рассматривать не будем. Термин "хиральность" происходит от английского слова "chirality" (от греч. ceir - рука), предложенного Кельвином в конце XIX века .

Рисунок 4. Энантиомеры талидомида.

Талидомид (рисунок 4) представляет собой печально известное лекарственное средство для лечения бессонницы, применявшееся в странах Европы для седации у беременных женщин в период с 1956 по 1962 гг, в результате чего были рождены от 8000 до 12000 тысяч детей с уродствами. Несмотря на то, что механизм действия R-изомера, отвечающего за снотворный эффект неизвестен, причина тератогенности S-изомера в некоторой степени ясна - встраивание молекулы S-талидомида между Г-Ц связями ДНК приводит к нарушению процесса репликации и последующему аномальному развитию плода . На первый взгляд, может быть недостаточно очевидно, почему молекулы, имеющие одинаковый порядок атомов в своем составе, оказывают различный биологический эффект, поэтому проиллюстрируем дальнейшее рассуждение.

Рисунок 5. Энантиомерия как зеркальная симметрия

Вопреки тому, что молекулы аминокислот, приведенных на рисунке 5, имеют идентичную последовательность атомов, они, тем не менее, являются разными веществами, что выражается в невозможности сопоставления их пространственных моделей, что обусловлено наличием тетраэдрического центра асимметрии - атома углерода, имеющего четыре различных заместителя.

Очевидно, что в данном случае лишь одна из молекул энантиомеров может быть лигандом для активного центра молекулярной мишени (рисунок 6), так как вторая молекула энантиомера не будет взаимодействовать с соответствующими участками связывания.

Рисунок 6. Проекция энантиомеров на плоскость.

Действительно, огромное число молекулярных структур человеческого организма обладает сродством к молекулам с определенной хиральностью. Так, в природе преобладают аминокислоты и сахариды только одной конфигурации, а образование их антиподов подавлено. L-аминокислоты являются естественными для человеческого организма, в то время как D-аминокислоты ускоренно метаболизируются при помощи D-оксидаз.

В некоторых случаях разные энантиомеры можно различить и без всяких приборов -- когда они по-разному взаимодействует с асимметрическими рецепторами в нашем организме.

Яркий пример -- аминокислота лейцин: ее правовращающий изомер сладкий, а левовращающий -- горький. Немного отдалившись от темы курсовой работы можно также добавить, что (+)-энантиомер нооткатона имеет в 2200 раз более интенсивный горький грейпфрутовый вкус и характерный запах, чем (-)-энантиомер, а природный (3S, 3aS, 7aR)-изомер винного лактона имеет в 25000000 более интенсивный сладкий запах с кокосовым оттенком, чем соответствующий (3R, 3aR, 7aS)-изомер .

3.1 Влияние оптической изомерии на биологическую активность

Феномен хиральности (стереоизомерия) столь обычен в биологии, что больше половины всех лекарственных соединений являются хиральными молекулами, т. е. имеют пары энантиомеров.

Часто один из энантиомеров (эвтомер) значительно более активен по сравнению с другим, действующим слабее или не действующим вообще (дистомер). Отношение активности эвтомера к дистомеру называется эвдисмическим и является мерой стереоизбирательности данного соединения. Чем больше данное отношение, тем сильнее биологическая активность лишь одного оптического изомера. Особенно отчетливо это видно тогда, когда центр оптической асимметрии находится в том месте молекулы, которое отвечает за ее взаимодействие с рецептором (так называемое правило Пфейффера) .

Изучение активности стереоизомеров на изолированных тканях исключает влияние проникновения и распределения и позволяет оценить эффективность стереоизомерных веществ в их реакции с рецептором. Взаимодействие асимметричной, достаточно сложной молекулы лекарственного вещества с еще более сложной структурой активного центра рецептора, осуществляемое по типу ключ-замок, определяется, несомненно, их контактом в целом ряде точек. При этом в структурах вещества и рецептора могут существовать как точки связи, так и точки взаимного отталкивания. Очевидно, что существование первых обусловливает сродство вещества к рецептору. Наличие вторых может влиять на сродство, поскольку взаимное отталкивание каких-то групп вещества и рецептора может способствовать специфическому изменению конформации последнего.

Если представить себе, что основные силы взаимодействия асимметрично построенной молекулы лекарственного вещества с активным участком рецептора (или фермента) сосредоточены минимум в трех точках, то два оптических антипода вещества могут одинаково ориентировать в отношении данной поверхности только две из трех групп, участвующих в процессе.

Различная ориентация третьей группы лучше всего может объяснить различие в биологической активности оптических изомеров, причем в зависимости от степени участия этой группы в процессе взаимодействия с рецептором влияние оптической изомерии будет выражено в большей или меньшей степени.

Если вещество взаимодействует с рецептором лишь в двух точках, то разницы в биологической активности его оптических изомеров ожидать не приходится. Однако если третья группа в одном изомере пространственно препятствует контакту вещества с рецептором в двух других точках, то и в этом случае различие между оптическими антиподами должно иметь место. Например, из двух оптических изомеров адреналина только у одного все три группы ориентированы таким образом, что они могут соединяться с соответствующими группами рецептора. В этом случае будет наблюдаться максимальная фармакологическая активность, соответствующая D-(-)-адреналину. У L-(+)-адреналина спиртовая гидроксильная группа ориентирована неправильно по отношению к поверхности рецептора, и данная молекула может взаимодействовать с рецептором только в двух точках. Поэтому природный D-(-)-адреналин обладает в десятки раз большей фармакологической активностью, чем синтезированный искусственно L-(+)-изомер .

Биологически активное вещество с двумя асимметричными центрами имеют четыре диастереомера, как например б-блокатор лабеталол. В большинстве случаев один из этих энантиомеров будет более эффективен, чем его зеркальный энантиомер, что связано с лучшей «подгонкой» к рецепторной молекуле. Например, 5(+)-энантиомер парасимпатомиметического лекарственного средства метахолина более чем в 250 раз активнее R(-)-энантиомера. Если представить рецептор в виде перчатки, в которую должна войти молекула лиганда, чтобы вызвать эффект, становится ясно, почему «левосторонние» лиганды будут более эффективны при связывании с рецептором для «левой руки», чем их «правосторонние» энантиомеры.

Более активный энантиомер для одного типа рецепторов может быть менее активным для другого типа рецепторов, например для рецепторов, ответственных за некоторые нежелательные эффекты. Карведилол -- лекарство, взаимодействующее с адренорецепторами, имеет один хиральный центр и, следовательно, два энантиомера. Один из этих энантиомеров, 5(-)-изомер, является активным в-блокатором. R(+)-изомер в 100 раз слабее действует на рецептор. Кетамин относится к внутривенным анестетикам. Его (+)-энантиомер -- более активный и менее токсичный анестетик, чем (-)-энантиомер. Тем не менее в качестве лекарственного средства до сих пор используют рацемическую смесь.

Наконец, в связи с тем, что ферменты обычно стереоселективны, один энантиомер часто имеет большее сродство к ферменту, метаболизирующему лекарственное вещество, чем другой. В результате энантимомеры могут весьма отличаться друг от друга по длительности действия.

К сожалению, большинство исследований клинической эффективности и элиминации лекарственных соединений у человека выполнено с применением рацемических смесей лекарств, а не их раздельных энантиомеров. В настоящее время только около 45 % хиральных ЛС, используемых в клинике, доступны как активные энантиомеры -- остальные продаются только как рацемические смеси. В результате многие больные получают дозы веществ, которые на 50 % или более неактивны или даже токсичны. Однако отмечается повышение интереса, как на научном, так и на законодательном уровнях, к производству хиральных ЛС в виде их активных энантиомеров.

Тем не менее, ряд соединений присутствует на современном фармацевтическом рынке Республики Беларусь в качестве рацематов.

Рисунок 7. S- и R-изомеры ибупрофена.

Так, например, широкораспространенное нестероидное противовоспалительное лекарственное средство ибупрофен (рисунок 7) присутствует в смеси двух изомеров, один из которых ((S)-(+)-ибупрофен) обладает целевой активностью и проявляет себя как анальгетик, антипиретик и оказывает противовосполительное действие, в то время как R-изомер токсичен и может накапливаться в жировых отложения в виде эфира с глицерином. В связи с этим стало коммерчески доступно аналогичное лекарственное средство, представляющее собой энантиомерно чистый (S)-(+)-ибупрофен, т. н. дексибупрофен. В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что в организме человека присутствует изомераза, способная превращать неактивный (R)-(-)-ибупрофен в активный (S)-(+)-ибупрофен .

Рисунок 8. R- и S-изомеры напроксена.

Напроксен - нестероидное противовоспалительное лекарственное средство, производное пропионовой кислоты, также присутствует на рынке в виде рацемической смеси, несмотря на то, что только S-изомер обладает терапевтической активностью, а R-изомер имеет ярко выраженную гепатотоксичность .

S-амлодипин уже более 20 лет используется в лечении артериальной гипертензии (АГ) и стенокардии, в то время как большинство амлодипинсодержащих лекарственных средств представлены рацемической смесью его S- и R-энантиомеров. Установлено, что способность блокировать медленные каналы L-типа в гладкомышечных клетках сосудов, лежащая в основе терапевтического действия данного препарата, присуща только его S-энантиомеру, в то время как его R-энантиомер в этом плане в 1000 раз менее активен, то есть практически лишен таких свойств . В то же время R-изомер не является фармакологически инертным, поскольку, в отличие от S-изомера, способен стимулировать синтез NO эндотелиальными клетками через кининзависимый механизм . Установлено, что чрезмерная дилатация прекапиллярно-артериолярного звена сосудов нижних конечностей, обусловленная избыточным образованием NO, нивелирует реализацию важного физиологического механизма, предупреждающего развитие отеков тканей нижних конечностей при нахождении тела в вертикальном положении - так называемого прекапиллярного постурального вазоконстрикторного рефлекса .

Именно это обстоятельство лежит в основе побочного действия традиционного рацемического амлодипина в виде периферических отеков, развивающихся в дозозависимом порядке по различным данным у 9-32% получающих его пациентов, чаще пожилых . В сравнительном рандомизированном исследовании S-амлодипина и оригинального рацемического амлодипина, выполненном в Украине, частота отеков на фоне 12-недельного лечения в вышеуказанных группах составила 1,6 и 7,8% соответственно, то есть терапия асомексом (торговая марка S-амлодипина, производимая Actavis Group) снижала риск их возникновения в 4,8 раза . Частота появления периферических отеков на фоне лечения S-амлодипином в двух крупных постмаркетинговых исследованиях составила всего 0,75% (14 из 1859 наблюдавшихся) и 0,84% (14 из 1669). При этом по данным 4-недельного наблюдения, антигипертензивная активность S-амлодипина в дозах 2,5 и 5 мг/сут оказалась эквивалентной таковой для амлодипина-рацемата, принимаемого вдвое большими суточными дозами - 5 и 10 мг.

Тем не менее, некоторые лекарственные средства выпускаются в виде оптически чистых соединений. Их получают тремя методами: разделением рацемических смесей, модификацией природных оптически активных соединений (к ним относятся углеводы, аминокислоты, терпены, молочная и винная кислоты и др.) и прямым синтезом. Последний также требует хиральных источников, поскольку любые другие традиционные методы синтеза дают рацемат. Это одна из причин высокой стоимости некоторых ЛС, и не удивительно, что из множества синтетических хиральных препаратов, выпускаемых во всем мире, лишь небольшую часть составляют оптически чистые, остальные -- рацематы.

Возможно также, что каждый энантиомер обладает своим специфическим действием. Так, левовращающий S-тироксин (лекарственное средство левотроид) -- это природный гормон щитовидной железы. А правовращающий R-тироксин («декстроид») понижает содержание холестерина в крови. Некоторые производители придумывают для подобных случаев торговые названия-палиндромы, например «Darvon» для наркотического анальгетика и «Novrad» для противокашлевого препарата.

Как уже отмечалось на примере аминокислоты лейцина, человек -- существо хиральное.

И это относится не только к его внешнему виду. Энантиомерные ЛС, взаимодействуя с хиральными молекулами в организме, например с ферментами, могут действовать по-разному. «Правильное» лекарственное средство подходит к своему рецептору, как ключ к замку, и запускает желаемую биохимическую реакцию. Антиаритмическое средство S-анаприлин действует в сто раз сильнее, чем R-форма. У антигельминтного средства левамизола активен в основном в S-изомер, тогда как его R-антипод вызывает тошноту, поэтому в свое время рацемический левамизол был заменен одним из энантиомеров. В 60-е годы одним из предшественников адреналина в организме -- диоксифенилаланином (L-ДОФА) пытались лечить паркинсонизм.

При этом выяснилось, что это вещество, а также родственные ему дофамин и метилдофа эффективны только в виде S-изомера. В то же время R-ДОФА вызывает серьезные побочные эффекты, в том числе заболевание крови. Фирма «Merck» разработала способ производства гипотензивного препарата метилдофа, включающий самопроизвольную кристаллизацию только нужного энантиомера путем введения в раствор небольшой затравки этого изомера.

Пеницилламин (3,3-диметилцистеин) -- довольно простое производное аминокислоты цистеина. Это вещество применяют при острых и хронических отравлениях медью, ртутью, свинцом, другими тяжелыми металлами, так как оно дает прочные комплексы с ионами этих металлов, и эти комплексы удаляются почками.

Применяют пеницилламин также при различных формах ревматоидного артрита, при системной склеродермии, в ряде других случаев. При этом применяют только S-форму препарата, так как R-изомер токсичен и может привести к слепоте. Недаром на обложке июньского номера американского журнала «Journal of Chemical Education» за 1996 год был помещен вот такой необычный рисунок. Название статьи о лекарственных средствах-антиподах было не менее красноречивым: «Когда молекула смотрится в зеркало» .

4. Геометрическая изомерия

4.1 Общая характеристика

Рисунок 9. Цис- и транс-дихлорэтен.

лекарственный препарат фармакология изомерия

Стереоизомерами называют вещества, имеющие одинаковые химические формулы, молекулы которых различаются только расположением атомов друг относительно друга. В отличие от структурных изомеров, в молекулах стереоизомеров характер и последовательность химических связей совпадают. Важнейшими типами стереомеров являются цис-транс изомеры (E-Z-изомеры), энантиомеры, диастереомеры и конформеры. Последний случай относится к большим молекулам, например белкам, которые при одной и той же первичной структуре могут иметь различные конформации.

Цис-транс изомерия относится к расположению различных атомов или групп относительно выделенной связи, например двойной. В цис-изомере эти атомы находятся по одну сторону от выделенной связи, а в транс-изомере - по разные. Простейшим примером цис-транс изомерии являются соединения типа дихлорэтена (рисунок 10). В более сложных случаях для описания такого рода стереоизомерии используют предложенную ЮПАК номенклатуру: у Z-изомеров группы с наибольшими весами находятся по одну сторону связи, а у E-изомеров - по разные.

4.2 Влияние геометрической изомерии на биологическую активность

Рисунок 10. Иллюстрация заторможенности вращения относительно пептидной связи в белках.

Цис-транс изомеры могут быть образованы и энантиомерами хиральных соединений. Важный пример - пептидная связь в белках, образованная остатками L-аминокислот. Эта связь имеет характер частично двойной связи, поэтому атомы скелета пептидной группы (-C б -C?-N-C б -) расположены в одной плоскости и группа может находиться либо в цис-, либо в транс-конформации (рисунок 11).

Хотя в развернутой полипептидной цепи происходит свободная изомеризация и пептидные группы принимают обе конформации, в нативном белке только одна из 1000 групп имеет цис-конформацию (остальные находятся в транс-конформации). Транс-конформация пептидных групп задается при их синтезе на рибосомах и сохраняется в дальнейшем. Однако если в состав пептидной группы входит остаток пролина (рисунок 12), что в обычных белках бывает редко, то соотношение транс/цис становится равным 3/1. Это значит, что в таком случае изомеризация происходит гораздо быстрее (хотя все равно очень медленно, с постоянной времени около 20, при комнатной температуре), чем в пептидной связи, образованной другими аминокислотными остатками.

Рисунок 11. Молекула L-пролина

При синтезе белка процесс сворачивания полипептидной цепи с образованием нативной конформации (фолдинг) происходит в тысячи раз быстрее цис-транс изомеризации, тем не менее иногда образуется пептидная группа в цис-конформации. В этом случае процесс фолдинга останавливается до тех пор, пока не возникнет правильная конформация, либо прекращается вовсе. Бывает и наоборот, когда для активной формы белка необходима не транс-конформация, которая образуется при синтезе, а цис-конформация, тогда приходится ждать, пока она не образуется. В обоих случаях на помощь приходит специальный фермент - пептидилпролилизомераза, который существенно ускоряет процесс изомеризации, в результате чего синтез таких белков идет без задержек.

Рисунок 12. Молекула серотонина

Не так давно было обнаружено, что цис-транс изомеризация не просто влияет на структуру белка, но такое изменение структуры может играть важную роль в регуляции биохимических процессов. Одним из важнейших нейромедиаторов, ответственных за регуляцию очень большого числа процессов у различных организмов - от нематоды до человека, - является серотонин (5-гидрокситриптамин, рисунок 13). У человека 80-90% серотонина обнаруживается в специальных клетках кишечника, где он используется для регуляции перистальтики. Остальная часть серотонина синтезируется в серотонергических нейронах в центральной нервной системе, где он участвует в регуляции аппетита, сна, хорошего настроения и агрессии. Кроме того, он стимулирует рост клеток, в частности в процессе восстановелния печени после повреждения, регулирует рост и рассасывание костей. Вырабатывается серотонин и у растений и грибов, его содержат некоторые овощи и фрукты.

Разнообразие регуляторных функций серотонина обусловлено наличием в разных клетках различных рецепторов серотонина, которые образуют так называемое суперсемейство серотониновых рецепторов (5-HT-рецепторов). Недостаточная или избыточная продукция серотонина приводит к различным психическим расстройствам. Так, при недостатке серотонина (или дефектах его рецепторов) у человека возникает депрессия. Поэтому многие лаборатории занимаются изучением серотониновой регуляции, в частности механизмов взаимодействия серотонина с различными рецепторами.

Все рецепторы серотонина, кроме 5-HT 3 , работают посредством активации G-белков, которые затем вызывают каскад биохимических реакций, приводящих к определенному результату. Рецептор 5-HT 3 - единственный, который относится к типу управляемых ионных каналов (его ближайший структурный аналог - никотиновый рецептор ацетилхолина). Этот рецептор представляет собой белок, пять раз пронизывающий клеточную мембрану нервной клетки, в котором при связывании с серотонином образуется пора, пропускающая катионы натрия, калия и кальция. Прохождение ионов по открывшемуся каналу приводит к возбуждению нейрона и генерации нервного импульса.

Однако как открывается канал в мембране, было неизвестно. Недавно было установлено, что инициатором структурных перестроек в рецепторе 5-HT 3 является изомеризация одного остатка пролина, находящегося в ключевом для этого типа рецепторов месте (вершина цистеиновой петли). Если пролин находится в транс-конформации, то канал закрыт. Связывание серотонина вызывает изомеризацию пролина, и канал открывается. Пожалуй, это первый случай, когда экспериментально показано, что переключение ионного канала между открытым и закрытым состояниями обусловлено стереоизомеризацией всего одного звена в полипептидной цепи .

Несмотря на меньшую (в сравнении с оптической изомерией) значимость цис-транс изомерии для фармации, надо признать, что свою нишу она, все же, имеет.

Ярким примером различий в свойствах биологически активных соединений в контексте геометрической изомерии является линолевая кислота, представляющая собой одноосновную карбоновую кислоту с двумя изолированными связями - CH 3 (CH 2) 3 -(CH 2 CH=CH) 2 (CH 2) 7 COOH.

Рисунок 13. Линолевая кислота.

Линолевая кислота относится к семейству омега-6 полиненасыщенных жирных кислот и в организме осуществляет регуляцию свойств клеточных и субклеточных мембран. Примечательно то, что только цис-изомер линолевой кислоты может использоваться организмом для синтеза арахидоновой кислоты , в то время как транс-изомеры малоактивены и могут накапливаться в органах и тканях. Линолевая кислота входит во множество лекарственных средств и биологически активных добавок, реализуемых на территории Республики Беларусь. Так, например, линолевая кислота является одним из основных компонентов ЛС «Эссенциале» и «Эссенциале форте Н» (Санофи Авентис), «Эссенцикапс» (МинскИнтерКапс), «Акулайв» (Lysi HF), «Фосфоглиф» (Фармстандарт-Лексредства) и других.

Вместе с тем, далеко не всегда транс-изомеры жирных кислот являются индифферентными. В начале 90-х годов прошлого века появился ряд публикаций, указывающих на связь потребления транс-жиров и риском развития сердечно-сосудистых заболеваний . В дальнейшем ВОЗ рекомендовала сократить потребление транс-жиров до следовых количеств , так как появились сведения, подтверждающие влияние транс-изомеров жирных кислот на возникновение рака, диабета, болезни Альцгеймера и иных, не менее малоприятных заболеваний.

Однако, не только изомеры естественного происхождения проявляют различную биологическую активность. Так, например, цисплатин (цис-, цис-дихлородиамминплатина(II) является алкилирующим цитотоксическим лекарственным средством, представленным, как ясно из названия, цис-изомером. Цисплатин оказывает терапевтическое действие путем связывания с молекулой ДНК и образованием координационного соединения между атомом платины и двумя азотистыми основаниями, что приводит к невозможности дальнейшего считывания и воспроизведения наследственной информации. Исследование показало , что комплекс цисплатин - ДНК более стабилен, чем аналогичный ему комплекс, содержащий транс-изомер. Таким образом обеспечивается развитие более длительного терапевтического эффекта, что, очевидно, и определило вывод на рынок именно цис-изомера. Вместе с тем, существуют исследования , указывающие на наличие комплексных соединений платины, пребывающих в транс-форме, и обладающих активностью, сравнимой с цисплатином. В таком контексте становится очевидно, что рассматривать отдельно взятое соединение без изучение его взаимодействия с молекулярной мишенью не представляется оптимальным.

Обсуждая вопросы геометрической изомерии, нельзя не упомянуть о наших соотечественниках, ведущих разработки ЛС на основе комплексов палладия (II) с N-замещенными тетразолами (Белорусский государственный университет), которые являются эффективными цитостатиками, проявляющими антипрофилеративную активность как в ряду цис-, так и в ряду транс-изомеров .

Заключение

Подводя итоги, можно отметить, что пространственное строение лекарственного соединения во многом определяет его фармакологическую активность. Выраженность биологического эффекта и его направленность зависит от строения лиганда, взаимодействующего с молекулярной мишенью.

На современном этапе развития фармацевтической индустрии огромное внимание уделяется методам компьютерного конструирования лекарственных соединений, что диктуется как экономическими факторами (значительно сокращается время и стоимость разработки), так и этическими факторами - существующие алгоритмы позволяют предсказать возможную токсичность исследуемого соединения и предотвратить трагедии, аналогичные талидомидовой.

На мой взгляд, одним из наиболее примечательных аспектов влияния пространственного строения лекарственного вещества на фармакологическую активность и фармакокинетику является изучение взаимодействия лиганда и рецептора. Изучение структуры биомолекулы, воссоздание ее нативного строения дает возможность получить информацию об активном центре, что в дальнейшем, при использовании докинга, позволяет подобрать именно такую структуру, которая будет производить оптимальный эффект.

Следующим любопытным фактом для меня было существование молекулярных дескрипторов строения - специальных математических параметров, которые могут обобщить пространственное расположение атомов до некоторой исчисляемой величины. Молекулярные дескрипторы в дальнейшем могут использоваться для построения моделей, в которые «закладываются» имеющиеся сведения относительно исследуемого соединения, а в качестве результата «получается» интересующий нас параметр - фармакологическая активность.

Изучение материалов при подготовке курсовой работы было очень интересным, пусть и сложным, ведь адекватное понимание действия лекарственных веществ невозможно без изучения тех механизмов, которые оказываются задействованы при его проникновении в организм. Было приятно узнать, что работы по получению новых лекарственных соединений ведутся не только в абстрактном «зарубежье», но и учеными из стран СНГ, а также Беларуси - в частности, НАН РБ долго и вполне успешно работает над проблемой молекулярного дизайна лигандов к ферментам микросомального окисления.

Так или иначе, проделанная работа показалась мне полезной, быть может не столько для моего профессионального роста как провизора-рецептара, сколько для формирования широкого кругозора и углубленного понимания роли фармацевтической химии как науки.

Литература

1. MedUniver [Электронный ресурс] / Фармакология. - Режим доступа: http://meduniver.com/Medical/farmacologia/25.html. - Дата доступа: 01.05.2013.

2. Клиническая фармакология. Национальное руководство. Под редакцией Ю.Б. Белоусова, В.Г. Кукеса, В.К. Лепахина, В.И. Петрова-М: «ГЭОТАР -Медиа», 2009-965с.

3. Википедия [Электронный ресурс] / Агонист. - Режим доступа: http://ru.wikipedia.org/wiki/Агонист. - Дата доступа: 01.05.2013.

4. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С.Северина. - 3-е изд., испр. - М.: Гэотар-Медиа, 2005. - 784 с.

5. Химическая энциклопедия [Электронный ресурс] / Фумаратгидратаза. - Режим доступа: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4963.html. - Дата доступа: 01.05.2013.

6. Солдатенков А.Т. Основы органической химии лекарственных веществ / А.Т. Солдатенков. -- М.: Химия, 2001.-- 192 с.

7. Tracy, T. S. Metabolic inversion of (R)-ibuprofen. Epimerization and hydrolysis of ibuprofenyl-coenzyme A / T.S. Tracy, S.D. Hall // Drug Metab. Dispos. -- 1992. -- V.20. -- №2. -- P. 322-327.

8. Летучие природные органические соединения [Электронные ресурс] / Режим доступа: http://fen.nsu.ru/posob/pochki/Tkachev.pdf. - Дата доступа: 01.05.2013.

9. Burges, R.A. Calcium channel blocking properties of amlodipine in vascular smooth muscle and cardiac muscle in vitro: evidence for voltage modulation of vascular dihydropyridine receptors / R.A. Burges // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1987; 9 (1):110-119.

10. Laufen, H. Enantioselective disposition of oral amlodipine in healthy volunteer / H. Laufen, M. Leitold // Chirality. - 1994. - V. 6 (7). - P. 531-536.

11. Cogolludo, A. New insights in the pharmacological therapy of arterial hypertension / A. Cogolludo, F. Perez-Vizacaino, J. Tumargo // Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. - 2005. - V.14. - P. 423-427.

12. Perna G.P. Efficacy and tolerability of amlodipine in patients with stable angina pectoris. Results of multicenter study / G.P. Perna // Clin. Drug. Invest. - 1997. - V. 13. - P. 149-155.

13. Бобров, В.А. Применение S-амлодипина в лечении больных с мягкой и умеренной артериальной гипертензией / В.А. Бобров [и др.] // Здоров"я України. - 2007. - № 12/1. - С. 1-4.

14. Леенсон, И.А. Левое или правое / И.А. Леенсон // М.: Химия и жизнь. - №5. - 2009. - С. 20-23.

15. Алексеев, В.В. Оптическая изомерия и фармакологическая активность лекарственных препаратов // Соросовский образовательный журнал, 1998, №1, с. 49-55.

16. Яницкий, П.К. Многообразие строения и форм молекул органических соединений / П.К. Яницкий, В. Реверский, В. Гумулка // Новости фармации и медицины. 1991. № 4/5. C. 98-104.

17. Биология [Электронный ресурс] / Роль стереоизометрии в биохимической регуляции. Режим доступа: http://bio.1september.ru/view_article.php?ID=200901701. - Дата доступа: 01.05.2013.

18. Биохимия: Учебник для ВУЗов / Под ред. Е. С. Северина. -- ГЭОТАР-Медиа, 2003. -- С. 371-374

19. Intake of trans fatty acids and risk of coronary heart disease among women / Walter C . - The Lancet. - V. 341. - P. 581--585.

20. Willett, W.C. Trans fatty acids: are the effects only marginal? / W.C. Willet, A. Ascherio American Journal of Public Health. - V. 84 (3). - 1994. - P. 722-724.

21. WHO Scientific Update on trans fatty acids: summary and conclusions / R Uauy // European Journal of Clinical Nutrition. - № 63. - 2009. - Р. 68-75.

22. Nafisi, S. A comparative study on the interaction of cis- and trans-platin with DNA and RNA. / S. Nafisi, Z. Norouzi. // DNA Cell Biol. - V. 28(9). - 2009. - P. 469-477.

23. МГУ им. Ломоносова [Электронный ресурс] / Противоопухолевая активность ацетоксимных и гидроксиламиновых комплексов платины(II). Режим доступа: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2007/23/Chemistry/kukushkin_nv.doc.pdf. - Дата доступа: 01.05.2013.

24. Синтез и строение новых комплексных соединений палладия(ii) с n-замещенными тетразолами / Т.В. Серебрянская [и др.] // Минск, «Свиридовские чтения», 2008. - С. 45-53.

25. Todeschini, R. Molecular Descriptors for Chemoinformatics / R. Todeschini, V. Consonni. - Willey-VCH, 2009. - 1265 c.

26. Quantitative Structure-Activity Relationships: Fundamentals and Application of the Hansch Analysis / International Union of Pure and Applied Chemistry. Brasil, 2006. - Mode of access: http://iupac.org/publications/cd/medicinal_chemistry. - Date of access: 20.04.2013.

27. Todeschini, R. Handbook of Molecular Descriptors / R. Todeschini, V. Consonni. - Wiley-VCH, 2000. - 688 с.

Подобные документы

Исследование основных особенностей воспалительного процесса. Характеристика фармакологического действия лекарственных препаратов нестероидных противовоспалительных средств. Изучение показаний и способа применения, противопоказаний, побочных действий.

курсовая работа , добавлен 10.03.2014

Основные показания и фармакологические данные по использованию нестероидных противовоспалительных лекарственных средств. Случаи запрещения их использования. Характеристика основных представителей нестероидных противовоспалительных лекарственных средств.

реферат , добавлен 23.03.2011

Цифровое кодирование лекарственных средств. Влияние различных факторов на потребительные свойства и качество лекарств, способы защиты товаров по этапам жизненного цикла. Фармакологическое действие, показания лекарственных препаратов на основе чаги.

курсовая работа , добавлен 28.12.2011

Характеристика препаратов, применяемых при нарушении секреторной функции желудка, 12-перстной кишки и поджелудочной железы. Анализ групп лекарственных препаратов: их фармакологическое действие, дозы, применение и формы выпуска, нежелательные реакции.

курсовая работа , добавлен 30.10.2011

Место нестероидных противовоспалительных препаратов среди "симптоматических" лекарственных средств при лечении ревматических болезней. Особенности механизма действия, показания к применению и дозирование, побочные эффекты препаратов данной группы.

курсовая работа , добавлен 21.08.2011

Понятие биологической доступности лекарственных средств. Фармако-технологические методы оценки распадаемости, растворения и высвобождения лекарственного вещества из лекарственных препаратов различных форм. Прохождение лекарственных веществ через мембраны.

курсовая работа , добавлен 02.10.2012

Особенности фармацевтического рынка России. Характеристика группы нестероидных противовоспалительных средств. Товароведческий анализ лекарственного препарата на основе лекарственного средства. Маркетинговые исследования продукта, стратегия продвижения.

курсовая работа , добавлен 30.11.2010

Государственное регулирование в сфере обращения лекарственных средств. Фальсификация лекарственных препаратов как важная проблем сегодняшнего фармацевтического рынка. Анализ состояния контроля качества лекарственных препаратов на современном этапе.

курсовая работа , добавлен 07.04.2016

Особенности применения нестероидных противовоспалительных средств при ревматоидном артрите. Лечебный эффект от использования лекарственных препаратов, возможность развития побочных действий, индивидуализация выбора. Факторы риска гастротоксичности.

презентация , добавлен 21.12.2014

Основные задачи фармакологии: создание лекарственных препаратов; изучение механизмов действия лекарственных средств; исследование фармакодинамики и фармакокинетики препаратов в эксперименте и клинической практике. Фармакология синаптотропных средств.

ятии:

Носители генетической информации у микроорганизмов.
Формы проявления изменчивости микроорганизмов. Модификации. Мутации, их классификация. R-S диссоциации. Практическое значение изменчивости микроорганизмов.
Мутагены, классификация, механизм действия мутагенов на геном микроорганизмов.
Роль цитоплазматических генетических структур в изменчивости микроорганизмов.
Генетические рекомбинации.
Трансформация, стадии процесса трансформации.
Трансдукция, специфическая и неспецифическая трансдукция.
Конъюгация, стадии процесса конъюгации.

1. Указать правильные ответы в тестовых заданиях.

1. Просмотр и зарисовка демонстрационных препаратов:

А) R-S диссоциация бактерий.

Контрольные вопросы:

Что является материальной основой наследственности микроорганизмов?
Какие существуют формы проявления изменчивости микроорганизмов?

Каково практическое значение изменчивости микроорганизмов?
Что такое модификации?
Что такое мутации?
Какая существует классификация мутаций?
Что такое мутагены?
Каков механизм действия мутагенов на геном микроорганизмов?

Какова роль цитоплазматических генетических структур в изменчивости микроорганизмов?
Что такое генетические рекомбинации?
Что такое трансформация? Какие стадии выделяют в этом процессе?
Что такое трансдукция?
Что такое конъюгация? Какие стадии выделяют в этом процессе?

ТЕСТОВЫЕ З АДАНИЯ

Указать правильные отв еты:

1. Что относят к внехромосомным генетическим структурам?

А) рибосомы

Б) полисомы

В) плазмиды

Г) мезосомы

Д) транспозоны

2. Что такое мутагены?

А) гены, обеспечивающие мутацию

Б) факторы, вызывающие мутацию

В) факторы, передающие генетическую информацию

Г) факторы, восстанавливающие ДНК

3. Что такое экзон?

А) вирулентный бактериофаг

Б) профаг

В) участок гена, несущий определенную генетическую информацию

Г) умеренный бактериофаг

4. Что такое инверсия?

А) способ генетической рекомбинации

Б) исправление поврежденных участков ДНК

В) хромосомная мутация

Г) точковая мутация

5. Что такое модификация?

Б) фенотипические изменения, не затрагивающие генома клетки

В) передача генетического материала при помощи бактериофага

Г) наследственное скачкообразное изменение признака

6. Для конъюгации характерно:

А) передача генетического материала при помощи бактериофага

Б) необходим контакт клеток донора и реципиента

В) передача генетического материала с помощью РНК

Г) передача генетического материала с помощью полового фактора

7. Что такое репарация?

А) лизогения

Б) восстановление поврежденной ДНК

В) способ передачи генетической информации

Г) виропексис

8. Чем характеризуется «минус» цепь РНК?

А) обладает инфекционной активностью

Б) несет наследственную функцию

В) способна встраиваться в хромосому клетки

Г) не обладает функцией информационной РНК

9. У каких микроорганизмов материальной основой наследственности является РНК?

А) у бактерий

Б) у спирохет

Д) у микоплазм

10. Что такое мутации?

А) исправление поврежденных участков ДНК

Б) передача генетического материала при помощи бактериофага

В) наследственное скачкообразное изменение признака

Г) процесс образования бактериального потомства, содержащего признаки донора и реципиента

11. Что такое трансформация?

А) восстановление поврежденной ДНК

Б) передача генетической информации при контакте бактериальных клеток разной «половой» направленности

В) передача генетической информации с помощью фрагмента ДНК

Г) передача генетической информации от клетки донора клетке реципиента с помощью бактериофага

ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТ ЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

Постановка опыта трансформации

Реципиент - штамм Bacillus subtilis Str (сенная палочка, чувствительная к стрептомицину); донор - ДНК, выделенная из штамма В. Subtilis Str (устойчивого к стрептомицину). Селективная среда для отбора рекомби-нантов (трансформантов) питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина.

К 1 мл бульонной культуры В. Subtilis добавляют 1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдерживают в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансформантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида натрия готовят 10-кратные разведения до 10 -5 -10 -6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют, при 37 0 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципи-ентного штамма в разведении 10 -5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл неразведенной смеси - 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170 х 10 5 жизнеспособных клеток, а в 1 мл - 170 х 10 6 , или 1,7 х 10 8 . В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинантных клеток, а в 1 мл - 680, или 6,8 х 10 2 .

Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:

Постановка опыта специфической трансдукции

Реципиент - штамм Е. coli lac - , лишенный 3-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг - фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена (3-галактозидазным опе-роном Е. coli. Он является дефектным, т. е. не способен вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в геноме бактериального оперона gal. Селективная среда - среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного штамма приобретают красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 10 6 - 10 7 частиц в 1 мл. Смесь инкубируют в течение 60 мин при 37 0 С, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчитываемого количества колоний. Из пробирки с разведением 10 -6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды.

Посевы инкубируют в течение 1 суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (транс-дуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.

Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в разведении 10 -6 на 3 чашках со средой Эндо выросло соответственно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках - 5 и 1 колонии трансдуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, кот орый содержит ген leu , контролирующий синтез лейцина.

Донор - штамм Е. coli K12 Hfr leu Str S ; реципиент - штамм Е. Coli K12 F - leu + Str R . Hfr - обозначение состояния, для которого характерна высокая частота рекомбинации. Селективная среда для выделения рекомбинантов -минимальная глюкозосолевая среда: КН 2 РО 4 - 6,5 г, MgSO 4 - 0,1 г, (NH 4)2SO 4 - 1 г, Ca(NO 3)2 - 0,001 г, FeSO 4 - 0,0005 г, глюкозы - 2 г, стрептомицина - 200 ЕД/мл, дистиллированной воды - 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10 -2 -10 3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорский и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, т. к. первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Кроме того, культуру донорского штамма высевают на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма - на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют при 37 0 С до следующего дня. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Например, после посева 0,1 мл смеси донорских и реципиентных культур в разведении 10 -2 выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10 -6 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:

УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА №7

Т е м а: Бактериологический метод ди агностики

инфекционных заболеваний. Питание бактерий. Принципы культивирования микроорганизмов. Питательные среды. Методы стерилизации

Учебная цель: Освоить бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Изучить типы питания бактерий, принципы культивирования микроорганизмов, классификацию питательных сред и методы стерилизации.

Необходимый исходный уровень знаний: Физиология микроорганизмов.

Практические знания и умения, которые должен получить студент на занятии:

Знать	Уметь
1. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний, его цель и этапы	1. Приготовить питательные среды
2. Типы питания бактерий	2. Оценить эффективность стерилизации и дезинфекции
3. Принципы культивирования микроорганизмов
4. Питательные среды, требования, предъявляемые к питательным средам
5. Классификация питательных сред, состав и приготовление
6. Методы стерилизации
7. Механизм действия стерилизующих факторов на молекулярную структуру микроорганизмов
8. Отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики
9. Классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия
10. Современные технологии стерилизации и аппаратура
11. Способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции

Вопросы, рассматриваемые на зан ятии:

Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний, его цель и этапы.
Типы питания бактерий.
Принципы культивирования микроорганизмов.

Питательные среды; требования, предъявляемые к питательным средам.
Классификация питательных сред, их состав и приготовление.
Методы стерилизации: физические, химические, биологические и механические.
Микроб как объект стерилизации и дезинфекции. Связь со строением микробной клетки. Основные мишени молекулярной структуры микроорганизмов при стерилизующих и дезинфицирующих воздействиях.
Отличия понятий контаминации и деконтаминации, дезинфекции и стерилизации, асептики и антисептики.
Классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия для стерилизации и дезинфекции.

Современные технологии стерилизации и аппаратура.
Способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции.

Самостоятельная работа студентов:

1. Опыт по определению действия высокой температуры (80°С) на спорообразующие (антракоид) и аспорогенные (кишечная палочка и стафилококк) микроорганизмы.

Преподаватель разъясняет опыт:

А) на каждый стол даётся взвесь стафилококка, кишечной палочки и споровой палочки (антракоида);

Б) делается посев каждой взвеси на косой агар до прогревания;

В) исследуемые взвеси помещаются на водяную баню при температуре 80 0 С на 20 минут;

Г) делается посев каждой взвеси на косой агар после прогревания;

Д) заполняется протокол по форме:

Вегетативные формы патогенных микроорганизмов погибают при 50-60 0 С в течении 30 минут, а при температуре 70 0 С в течении 5-10 минут. Споры бактерий обладают большей устойчивостью к высоким температурам, что объясняется содержанием в них воды в связанном состоянии, большим содержанием солей кальция, липидов и плотностью, многослойностью оболочки. Следовательно, стафилококк и кишечная палочка после прогревания погибают, а споры антракоида выживают. Это и надо учитывать в оценке результатов посева.

2. Заполнить самостоятельно таблицу:

№	Способ стерилизации	Аппарат	Надёжность	Стерилизуемый материал
1.	Стерилизация в пламени
2.	Плазменная Стерилизация
3.	Сухой жар
4.	Паром под давлением
5.	Текучим паром
6.	Тиндализация
7.	Фильтрование
8.	Физические факторы (УФЛ, гамма-лучи, ультразвук)
9.	Газовая стерилизация
10.	Пастеризация

3. Указать правильные ответы в тестовых заданиях.

Практическая работа студентов:

1. Просмотр демонстрационных препаратов и приборов:

А) питательных сред (МПБ, МПА, кровяной агар, сывороточный агар, среды Гисса, среда Эндо, среда Плоскирева);

Б) печи Пастера, автоклава.

Контрольные в опросы:

Какие цели и этапы бактериологического метода диагностики инфекционных заболеваний?
Что такое питание бактерий?
Какие существуют типы питания бактерий?
Каковы принципы культивирования микроорганизмов?
Что такое питательные среды?
Какие требования предъявляются к питательным средам?
Какая существует классификация питательных сред?
Как готовятся питательные среды?
Что такое стерилизация?
Какие существуют методы стерилизации?
В чем разница между понятиями контаминация и деконтаминация, дезинфекция и стерилизация, асептика и антисептика?
На какие клеточные структуры микроорганизмов действуют стерилизующие и дезинфицирующие факторы?
Какая существует классификация инструментов, приборов, способов обработки и видов воздействия для стерилизации и дезинфекции?
Какие известны современные технологии стерилизации и аппаратура?
Какие используются способы контроля эффективности стерилизации и дезинфекции?

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

Укажите правильные ответы:

1. Какие питательные среды являются простыми?

А) среда Эндо

В) кровяной агар

Д) пептонная вода

2. Что такое стерилизация?

А) полное обеспложивание объектов от всех видов микробов и их спор

Б) уничтожение патогенных микроорганизмов

В) уничтожение вегетативных форм микроорганизмов

Г) предотвращение попадания микроорганизмов в рану

Д) уничтожение на объектах конкретных видов микробов

3. Какие факторы используются при автоклавировании?

А) температура

Б) фильтры

Г) давление

4. Какие факторы используются в печи Пастера?

А) давление

В) сухой жар

Г) антибиотики

5. Питательные среды по назначению делятся на:

А) простые

Б) элективные

В) жидкие

Г) дифференциально-диагностические

Д) транспортные

6. По отношению к факторам роста микроорганизмы делятся на:

А) аутотрофы

Б) гетеротрофы

В) ауксотрофы

Г) литотрофы

Д) прототрофы

Е) органотрофы

7. Оптимальной температурой для выращивания большинства патогенных микроорганизмов является:

8. К физическим методам стерилизации относятся:

А) ультразвук

Б) ультрафиолетовые лучи

В) антибиотики

Г) фильтрование

Д) паровая стерилизация

Е) сухожаровая стерилизация

9. На рост бактерий влияют следующие условия культивирования:

Б) рН среды

В) температура

Г) влажность среды

Д) факторы роста

Е) все ответы неправильные

10. Плотность питательных сред зависит от содержания в них:

А) хлорида натрия

Б) пептона

В) агар-агара

Г) сахарозы

Д) сыворотки крови

11. Микробы, использующие неорганические источники углерода и окислительно-восстановительные реакции для получения энергии, называются:

А) хемоорганотрофами

Б) фотоорганотрофами

В) хемолитотрофами

Г) хемоаутотрофами

Д) хемоауксотрофами

12. Перечислите способы стерилизации, освобождающие объект от споровых форм микробов:

А) облучение ультрафиолетом

Б) автоклавирование

В) пастеризация

Г) сухим жаром

Д) гамма-облучение

13. Расположите в правильной последовательности процессы обработки лабораторного инстументария:

А) предстерилизационная очисткастерилизация

Б) предстерилизационная очисткастерилизациядезинфекция

В) предстерилизационная очисткадезинфекция-стерилизация

Г) дезинфекцияпредстерилизационная очисткастерилизация

14. Комплекс мероприятий, направленных на уничтожение патогенных микроорганизмов, называется:

А) асептика

Б) антисептика

В) дезинфекция

Г) стерилизация

Д) тиндализация

ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

Микробиологическое исследование проводится с целью выделения чистых культур микроорганизмов, культивирование и изучения их свойств. Оно необходимо при диагностике инфекционных болезней, для определения видовой принадлежности микробов, в исследовательской работе, для получения продуктов жизнедеятельности микробов (токсинов, антибиотиков, вакцин и т. п.). Для выращивания микроорганизмов в искусственных условиях необходимы особые субстраты - питательные среды. Они являются основой микробиологической работы и определяют результаты всего исследования. Среды должны создавать оптимальные условия для жизнедеятельности микробов.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕД ЬЯВЛЯЕМЫЕ К СРЕДАМ:

Должны быть питательными, т. е. содержать в легкоусвояемом виде все вещества, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей микроорганизмов.
Иметь оптимальную концентрацию водородных ионов.
Быть изотоничными для микробной клетки.
Быть стерильными.
Быть влажными.
Обладать определённым окислительно-восстановительным потенциалом.
Быть по возможности унифицированными.

Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор той или иной среды влияют цели исследования.

Группа классификации	Класс	Примеры
По составу	Простые	Жидкие - МПБ, пептон-ная вода Пло тные - МПА
	Сложные	Жидкие - сахарный бул ьон Плотные - сахарный агар, кровяной агар
По происхожде нию	Естественные	Молоко, свёрнутая сыв оротка, срез сырого картофеля
	Искусственные	Молочно-солевой агар С ывороточный агар Асцит-агар Кровяной агар
	Синтетические	Среда Игла, среда 199
По назначе нию	Селективные (элективные) -для стафилококка: -для грам(-) кокков и дифтероидов: -для энтеробактерий: -для холерного вибриона: -для лактобацилл и грибов	Молочно-солевой агар, жел-точно-солевой агар Сывороточные среды Среды с солями теллура Среды с солями желчных кислот Пептонный бульон и ще лочной агар Томат-агар, рисовый агар, агар Сабуро
По консисте нции	Дифференциально-диагностические Универсальные Среды обогащения Консервирую щие Жидкие Полужидкие Плотные	Эндо, Плоскирева, Левина, Ресселя, Гисса МПБ, МПА, кровяной агар Среда Мюллера Среды с глицерином МПБ, пептонная вода, сахарный МПБ МПЖеле, желати новая МПА, кровяной агар

Для эффективного функционирования многоклеточного организма необходимо точное координированное взаимодействие между различными биологическими молекулами, надмолекулярными и субклеточными структурами, клетками и органами, которые представляют собой функционально единую целостную систему. Физиологические функции органа, системы органов и организма в целом невыполнимы обособленными специализированными клетками и, тем более, субклеточными образованиями. Одним из ключевых этапов эволюции живого явилось приобретение способности макромолекул к обратимому, специфическому межмолекулярному взаимодействию, приводящему к изменению их функциональной активности, что в итоге предопределило регулируемость физиологических процессов на различных уровнях организации биологической системы - молекулярном, надмолекулярном, субклеточном, клеточном, органном и, наконец, в организме в целом. Биохимические процессы внутри клеток многоклеточного организма согласованы и, одновременно, адекватны возможностям отдельной клетки, ее способности участвовать в работе целостного организма. Подобный характер клеточного поведения в многоклеточном организме обусловлен способностью клеток вступать в регулируемые как со стороны клетки, так и со стороны организма, межклеточные, матрикс-клеточные и гуморально-клеточные взаимодействия посредством специализированных структур пептидной природы - рецепторов. Посредством межклеточных, матрикс-клеточных и гуморально-клеточных взаимодействий из клеток различной физиологической специализации, в которых осуществляется согласованная регуляция метаболической активности, позволяющая им выполнять физиологические функции, присущие органу/системе органов формируется функционально единая структура ткани, органа, организма в целом.

Структуры цитоплазматической мембраны многоклеточного организма в ходе эволюции формировались на основе уже существующих внутриклеточных структур пептидной природы 1 . Модификация соответствующих генов и эволюционный отбор обеспечили как сохранение определенных доменов белковой молекулы, получивших название эволюционно-консервативных, так и способствовали появлению новых, призванных выполнять специализированные функции. Наличие эволюционно-консервативных доменов в молекулах пептидной природы различного функционального назначения значимо, в числе прочего, для регуляции их функциональной активности по единым принципам, едиными воздействиями.

Домены молекул пептидной природы , обогащенных остатками серы в составе цистеина, принадлежат к эволюционно-консервативным компонентам молекулярной структуры. Обогащенные цистеином эволюционно-консервативные домены обнаружены в составе внеклеточных и внутриклеточных транспортных, регулирующих, сенсорных, исполнительных, структурных и других, по функциональному назначению, молекул пептидной природы

Рецепторные тирозинкиназы имеют эволюционно консервативный внеклеточный домен, обогащенный остатками цистеина. Сульфгидрильные группы остатков цистеина в составе поверхностно-клеточных доменов рецепторов чувствительны к действию окисляющих реагентов, приводящих к образованию внутримолекулярных и межмолекулярных дисульфидных сшивок (связей) , изменяющих функциональный статус поверхностно-клеточного домена (например, повышение тропности и/или специфичности в отношении агониста или агонистов) и/или инициирующих активность рецепторной тирозинкиназы 2 .

Остатки серы в составе цистеина эволюционно-консервативных доменов молекул пептидной природы являются одними из важнейших точек приложения факторов, влияющих на конформацию молекул пептидной природы 3 4 .

Возможность обратимого, регулируемого изменения конформации внеклеточных и внутриклеточных молекул пептидной природы (включая рецепторы, мембранные транспортеры, ионные каналы, ферменты и другие специализированные молекулы пептидной природы ), сопряженная с их способностью к выполнению физиологических функций, сделала конформационные перестройки на уровне третичной и четвертичной структур одним из эффективных универсальных механизмов воздействия на активность различных белков, включая молекулы, ответственные за межклеточные, матрикс-клеточные, гуморально-клеточные взаимодействия, обмен ионами и субстратами, организацию структуры клетки и ее метаболическую активность 5 6 7

Регуляторное воздействие на остатки серы в составе цистеина эволюционно-консервативных доменов структурных и функциональных молекул пептидной природы внеклеточного и внутриклеточного пространств определяется, в числе прочего, окислительно-восстановительным (редокс) окружением. Редокс-окружение отражает уровень соотношения взаимопревращаемых окисленной и восстановленной специфической редокс-пары. Редокс-окружение, образуемое взаимосвязанными редокс-парами в биологических жидкостях внеклеточного пространства, цитозоля и органелл клеток определяется суммированием в них восстановительного потенциала и восстановительной емкостью этих редокс пар.

Восстанавливающие эквиваленты преобладают как во внутриклеточном пространстве, так и вне клетки, но величина их отношения к окисляющим формам вне клетки и в ряде органелл несколько ниже внутриклеточного значения в цитозоле. Вследствие этого окружающая клетки среда и среда ряда внутриклеточных органелл характеризуется большей окисляющей способностью в сравнении с цитозолем 8 9 10

Функционально-активные конформации молекул внутриклеточного и внеклеточного пространства адаптированы к эволюционно сложившимся особенностям окислительно-восстановительных условий. Как отмечалось выше, остатки серы в составе цистеина структурных и регуляторных молекул пептидной природы являются одними из важнейших точек приложения эффекторных молекул, осуществляющих редокс-модуляцию. Цистеин сосредоточен в эволюционно-консервативных доменах структурных и функциональных молекул пептидной природы. Остатки цистеина эволюционно консервативных доменов регуляторных, структурных, каталитических молекул пептидной природы , редокс-модуляция связи серы которых приводит к изменению конформации и/или функциональной активности, получили обозначение «горячих цистеинов». Сульфгидрильные группы цистеина принимают участие в большинстве реакций в виде меркаптидного иона RS?. Меркаптидные ионы белков более реакционоспособны и легче подвержены окислению, чем недиссоциированные сульфгидрильные группы. Значение рК а (константы ионизации) у SH-групп белков варьирует в широких пределах и в значительной степени определяется их взаимодействием с соседними функциональными группами в молекуле. Наличие положительно заряженной группы в непосредственной близости от SH-группы понижает ее константу ионизации. Значение рК а большинства SH-групп в активных центрах ферментов составляет приблизительно 8,5 11 12 . Следовательно, при физиологическом значении рН в клеточном микроокружении и клетке (~7,4) существующие сульфгидрильные группы большинства молекул пептидной природы остаются неионизированными из-за высокого значения рК а, поэтому они устойчивы к окислению. «Горячие цистеины» эволюционно консервативных доменов окружены близлежащими положительно заряженными группами, вследствие чего их рК а колеблется от 4,7 до 5,4. Таким образом, сульфгидрильная группа в их составе ионизирована даже при физиологическом значении рН и легко подвергается окислительной модификации. Функционально активная конформация основной массы внутриклеточных молекул пептидной природы формируется при восстановлении остатков серы в составе «горячих цистеинов» до сульфгидрильных групп 13 14 15 16 . Напротив, функционально активная конформация основной массы внеклеточных молекул пептидной природы формируется при образовании дисульфидной связи между остатками серы «горячих цистеинов» 17 18 19 20 .

Восстановленный (GSH) и окисленный глутатион (GSSG) представляют одну из основных биохимических пар биологических пространств, значение соотношения которых (GSH/GSSG) определяет величину окислительно-восстановительного потенциала соответствующего физиологического пространства 21 22 . Физиологически необходимое значение соотношения GSH/GSSG регулируется и формируется соответствующими биохимическими системами, отслеживается молекулярными редокс-сенсорами в структуре поверхностно-клеточных рецепторов, ионных каналов, биорегуляторов, ферментов, транспортеров цитоплазматической мембраны и других молекул пептидной природы внутриклеточного и внеклеточного пространств 23 24 . Следствием реакции молекулярного редокс-сенсора на изменение величины редокс-потенциала является формирование регуляторного сигнала, влияющего на биохимические процессы или процесс, клеточную реакцию или реакции 25 26 , определяющие, с одной стороны, клеточный ответ, с другой - восстановление физиологически адекватной величины редокс-потенциала. В этой связи, факторы, влияющие на величину соотношения между восстановленным и окисленным глутатионом (активные формы кислорода 27 , активные формы азота 28 29 30 , монооксид углерода 31 , органические перекиси 32 ), способны модулировать биохимические процессы и клеточные реакции посредством изменения величины редокс потенциала и величины соотношения в системе восстановленный/окисленный глутатион.

Рисунки 2 и 3 на примере биорегуляторов и их рецепторов иллюстрируют принцип молекулярного механизма участия сульфгидрильных групп эволюционно консервативных цистеин-содержащих доменов, восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона в контроле функциональной активности молекул пептидной природы внеклеточного пространства.

Рис.2. Воздействие с участием восстановленного глутатиона (GSH) на дисульфидные сшивки (связи) в структуре функционально активных внеклеточных и/или их поверхностно-клеточных рецепторов приводит к формированию пула молекул, конформация которых ограничивает их физиологически адекватные взаимодействия.

Рис.3. Воздействие на сульфгидрильные (SH) группы в структуре функционально неактивных внеклеточных биорегуляторов пептидной природы и/или их поверхностно-клеточных рецепторов, обусловленное снижением величины редокс-потенциала вследствие увеличения количества окисленного глутатиона (GSSG), приводит к формированию пула молекул, конформация которых адекватна характеру ситуационно обусловленных физиологических взаимодействий.

Необходимо отметить, что активные формы кислорода, активные формы азота, органические перекиси способны непосредственно осуществлять окислительную модификацию сульфгидрильных групп до сульфенатов. Однако, физиологический характер такого воздействия будет реализован, если после образования сульфената с участием GSH образуется смешанный дисульфид с глутатионом (реакция глутатионилирования) и далее будет осуществлен упорядоченный ферментативный процесс формирования правильной дисульфидной сшивки или восстановления остатка серы в составе цистеина 33 . В противном случае может произойти необратимое окисление остатка серы в составе цистеина до цистин-сульфоновой кислоты (Cys-SO 3 H) и, как следствие, утрата возможности регулировать функцию белка.