Современные проблемы науки и образования. Методы оценки апоптоза Маркеры апоптоза

Обследовано 45 детей в возрасте 3–15 лет. Целью исследования явилось определение готовности к апоптозу лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови с помощью определения маркеров апоптоза – CD95, CD95L, BSL2. При оценке апоптоза иммунокомпетентных клеток установлено снижение готовности к программированной клеточной гибели лимфоцитов и увеличение – нейтрофильных гранулоцитов. Наиболее выраженные изменения регистрируются в возрастной группе 7–15 лет со стажем заболевания более 3-х лет. Полученные данные могут быть признаком подавления программированной гибели аутореактивных лимфоцитов в ткани поджелудочной железы, что способствует пролонгации иммунного ответа. Увеличение доли лейкоцитарных клеток, экспрессирующих CD95L, может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.

апоптоз нейтрофилов

апоптоз лимфоцитов

сахарный диабет 1 типа

1. Пекарева Е. В. Маркеры апоптоза у больных сахарным диабетом 1 типа в дебюте заболевания / Е. В. Пекарева и др. // Сахарный диабет. – 2009. – № 4. – С. 86-89.

2. Пекарева Е. В. Роль апоптоза в патогенезе сахарного диабета 1 типа / Е. В. Пекарева, Т. В. Никонова, О. М. Смирнова // Сахарный диабет. – 2010. – № 1. – С.45-48.

3. Adeghate E. An update on the etiology and epidemiology of diabetes mellitus / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. – Vol. 1084. – P. 1–29.

4. Clinical significance of neutrophil apoptosis in peripheral blood of patients with type 2 diabetes mellitus / С. Sudo et al. // Lab Hematol. 2007; 13(3):108-12 (снижена).

5. Filep J. G. Neutrophil apoptosis: a target for enhancing the resolution of inflammation / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. – 2009. – Vol. 108. – P. 1039–1046.

6. Human polymorphonuclear neutrophil responses to Burkholderia pseudomallei in healthy and diabetic subjects / S. Chanchamroen et al. // Infect Immun. – 2009. – Vol. 77. – P. 456–463 (снижен апоптоз).

7. Impact of Lymphocyte Apoptosis in Diabetes mellitus / K. А. Awadhesh et al. // Asian Journal of Medical Sciences. – 2011. – № 2. – P. 1-6.

8. Inflammation is more persistent in type 1 diabetic mice / D. T. Graves et al. // J. Dent. Res., 2005. – Vol. 84. – P. 324–328.

9. Juliana C. Alves Infections in patients with diabetes mellitus: A review of pathogenesis / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – 2012 March. – Supp l1. – № 16. – P. 27–36.

10. Luo H. R. Constitutive neutrophil apoptosis: mechanisms and regulation / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. – 2008. – Vol. 83. – P. 288–295.

Введение

Сахарный диабет 1 типа (СД1) является полигенным, мультифакторным заболеванием, связанным с образованием аутоантител и аутореактивных Т-лимфоцитов к β-клеткам поджелудочной железы .

Ведущими звеньями в патогенезе аутоиммунных поражений являются дисрегуляция иммунитета и программированной гибели клеток .

Контролируемый апоптоз рассматривается сегодня как главный механизм поддержания оптимального баланса клеток в очаге воспаления , ограничивающий экспансию активированных клонов и препятствующий развитию аутоиммунных реакций . При возникновении дефекта в его реализации активированные иммунные клетки могут аккумулироваться, что ведет к возникновению аутоиммунных заболеваний.

Цель исследования : изучение активационных маркеров апоптоза CD95, CD95L, Bsl2 на лимфоцитах и нейтрофилах периферической крови при сахарном диабете 1 типа у детей.

Материал и методы исследования

Выполнено обследование 45 детей c сахарным диабетом 1 типа в возрасте 3-15 лет. В группу I вошли 20 детей в возрасте 3-6 лет (дошкольники), в группу II - 12 детей в возрасте 7-15 лет (школьники) с длительностью заболевания менее 3-х лет, в группу III - 13 детей 7-15 лет (школьники) со стажем заболевания более 3-х лет. Контрольную группу составили 30 здоровых детей 3-6 (15) и 7-15 (15) лет. Исследование проведено на базе эндокринологического отделения ДГКБ им. Г. К. Филиппского г. Ставрополя.

Для оценки программируемой клеточной гибели выявляли количество лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, экспрессирующих маркеры апоптоза. Лимфоциты выделяли на градиенте плотности Ficoll-Paque, нейтрофилы - на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque и фиколл-урографин (GE Healthcare, Швеция). Суспензию клеток трижды отмывали в среде RPMI-1640 (Вектор-Бест, Россия). В культурах лимфоцитов и нейтрофилов оценивали количество клеток, экспрессирующих CD95, CD95L, Bsl2 методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (Invitrogen, США).

Для статистического анализа данных использовали пакет программ «Primer of Biostat 4,0», Attestat 10.5.1.». Для оценки межгрупповых различий применяли дисперсионный анализ повторных измерений с вычислением критериев Ньюмена - Кейлса, Данна.

Количественные значения характеризовались ненормальным распределением и были представлены в виде медианы и интерквантильного (25 и 75 процентили) размаха (Me (Q1-Q)). Достоверными считали различия при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

В работе было установлено уменьшение количества лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецепторы (CD95) у пациентов всех групп по сравнению со здоровыми детьми (табл. 1). Минимальные показатели отмечены у детей 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет (табл. 1).

Таблица 1

Показатели апоптоза лимфоцитов у детей с сахарным диабетом 1 типа

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой

При оценке уровня экспрессии антиапоптотических маркеров (Bsl2) выявлено его увеличение на лимфоцитах детей всех групп, более выраженное у школьников с длительностью заболевания более 3-х лет, что также свидетельствует о нарушении Fas-зависимого апоптоза у детей с сахарным диабетом 1 типа, приводящего к замедлению процессов клеточной смерти аутореактивных форм лимфоцитов .

Полученные нами результаты могут быть косвенным признаком подавления программированной гибели активированных лимфоцитов в ткани поджелудочной железы, что способствует пролонгации иммунного ответа.

Уровень апоптотической готовности лимфоидных клеток зависит от длительности заболевания и уменьшается у детей со стажем СД1 более 3-х лет.

Ранее было показано, что при сахарном диабете выявляется резистентность лимфоцитов к апоптозу, что, возможно, объясняет характер и продолжительность аутоиммунного ответа .

В культуре лимфоцитов детей, больных сахарным диабетом, установлено увеличение процентной доли лимфоцитов, экспрессирующих CD95L, (табл. 1), по сравнению с группой здоровых детей. Наиболее высокие показатели определялись у детей 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет (табл. 1).

Известно, что при СД1 островки поджелудочной железы инфильтрированы иммунными клетками, продуцирующими широкий спектр цитокинов, что сопровождается аберрантной экспрессией мембранных рецепторов. Под влиянием повышенной концентрации глюкозы и цитокинов β-клетки начинают экспрессировать CD95 на своей поверхности, практически отсутствующий в норме .

Повышение экспрессии CD95L на лимфоидных клетках возможно обусловливает более выраженный апоптотический процесс в β-клетках поджелудочной железы и их последующее удаление.

В последние годы показано, что нейтрофильные гранулоциты принимают активное участие в формировании аутоиммунного воспаления. Реакция нейтрофилов, направленная на локализацию и элиминацию аутоантигенов во многом зависит от силы и длительности антигенного воздействия на иммунную систему, а также исходного уровня функциональной активности клеток.

Нами установлено, что течение сахарного диабета у детей сопровождается увеличением процента нейтрофилов, экспрессирующих маркеры апоптоза (CD95), и уменьшением доли клеток, имеющих на своей поверхности антиапоптотические белки Bsl2 (табл. 2).

Таблица 2

Показатели апоптоза нейтрофилов у детей с сахарным диабетом 1 типа

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (критерий Ньюмена - Кейлса, критерий Данна).

При сравнительной межгрупповой характеристике максимальные показатели CD95 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

Выявлено увеличение процента полиморфноядерных лейкоцитов, имеющих на своей поверхности CD95L. Наиболее высокие показатели отмечены у детей школьников со стажем заболевания более 3-х лет.

Результаты исследования апоптоза ПМЯЛ при сахарном диабете, представленные в литературных источниках, носят противоречивый характер. Существуют данные об увеличении скорости апоптоза нейтрофилов периферической крови при СД1 и СД2 .

Однако в ряде исследований установлено снижение апоптоза нейтрофильных гранулоцитов у больных с СД1 , особенно в условиях гипергликемии, что вероятно инициирует процессы хронического воспаления с повреждением тканей, а также предрасполагает к затяжным бактериальным инфекциям у больных сахарным диабетом 1 типа .

Полученные нами результаты позволяют считать, что у больных СД1 отмечается повышенная предрасположенность ПМЯЛ к апоптозу, что может быть проявлением защитной реакции, направленной на устранение «излишка» активных нейтрофилов, формирование которого усиливает повреждение тканей.

Увеличение апоптотического потенциала нейтрофильных гранулоцитов является отражением активного вовлечения ПМЯЛ в иммунопатогенез заболевания.

Повышение экспрессии CD95L на нейтрофильных гранулоцитах у больных сахарным диабетом, вероятно, может способствовать элиминации не только клеток поджелудочной железы, но и собственных лейкоцитарных клеток.

Таким образом, при оценке апоптоза иммунокомпетентных клеток у детей, больных сахарным диабетом 1 типа, установлено снижение готовности к программированной клеточной гибели лимфоцитов и увеличение - полиморфноядерных лейкоцитов.

Наиболее выраженные изменения регистрируются в возрастной группе 7-15 лет со стажем заболевания более 3-х лет. У детей всех групп выявлено увеличение доли лейкоцитарных клеток, экспрессирующих на своей поверхности CD95L.

Известно, что ПМЯЛ являются связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом и выполняют главенствующую роль в антибактериальной защите.

Повышение их апоптотической активности может становиться причиной низкой возрастной устойчивости ребенка, его подверженности инфекционным заболеваниям.

Снижение количества лимфоидных клеток, чувствительных к индукции апоптоза, является косвенным признаком подавления программированной клеточной гибели и нарушения элиминации активированных форм лимфоцитов.

Выводы

1. У детей, страдающих сахарным диабетом 1 типа, отмечается снижение готовности к апоптозу лимфоцитов периферической крови, повышение - нейтрофильных гранулоцитов, что сопровождается изменением экспрессии CD95 и Bsl2 и зависит от стажа заболевания.

2. Увеличение экспрессии CD95L на лимфоцитах и нейтрофильных гранулоцитах при СД1 может способствовать усилению процессов запрограммированной клеточной гибели в островковых β-клетках поджелудочной железы, инфильтрированных иммунокомпетентными клетками.

Рецензенты:

Щетинин Е.В., д.м.н., профессор, проректор по научной и инновационной работе СтГМУ, заведующий кафедрой ГБО ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Ставрополь.

Голубева М.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой детских инфекционных болезней ГБО ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, г.Ставрополь.

Библиографическая ссылка

Апоптоз – это программируемая, генетически опосредованная форма клеточной гибели, при которой внешние или внутренние сигналы дают импульс клетке к образованию или активации ферментов, приводящих ее к самоуничтожению. Морфологически апоптоз характеризуется сморщиванием клетки, конденсацией и фрагментацией ядра, разрушением цитоскелета и буллезным выпячиванием клеточной мембраны. Особенностью апоптоза является то, что умирающая клетка сохраняет целостность своей мембраны до полного завершения процесса, и только тогда разрушение ее оболочки является сигналом для расположенных вблизи фагоцитов к поглощению оставшихся фрагментов и завершению процесса клеточной деградации. Апоптотические клетки, не подвергшиеся немедленному фагоцитозу, превращаются в мелкие, связанные с мембраной фрагменты, называемые «апоптотическими телами». Важной чертой апоптоза является то, что удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления.

Апоптоз играет важную роль в физиологических процессах: органогенезе, эмбриональном развитии, регуляции состава и численности клеточных популяций в тканях взрослого организма, различного рода гормональных перестройках организма. Важна роль апоптоза и при различных патологических процессах. Наиболее полно она изучена при опухолевом росте.

Процесс апоптоза может быть разделен на две фазы:

· формирование и проведение апоптотических сигналов – фаза принятия решения;

· демонтаж клеточных структур – эффекторная фаза.

Реализация механизмов апоптоза связана с активацией эндогенных клеточных ферментов - цистеиновых протеаз (каспаз). Каспазы находятся в клетках в неактивном состоянии (прокаспазы). Активация происходит путем их протеолитического расщепления и последующей димерезацией с образованием активных субъединиц. Мишенями для каспаз являются белки, отвечающие за различные жизненные функции клетки. В настоящее время описано 14 видов каспаз, которые по функциональным особенностям можно разделить на 3 группы:

· активаторы цитокинов (каспазы 1, 4, 5, 13)

· каспазы - индукторы активации эффекторных каспаз (каспазы 2, 8, 9, 10)

· эффекторные каспазы - исполнители апоптоза (3, 6, 7)

Одним из мембранных клеточных рецепторов, ответственных за механизмы апоптоза, является белок, получивший название Fas-рецептора (CD95/АРО1). Лигандом для Fas-рецептора является белок - Fas-лиганд (Fas-L), который принадлежит к семейству опухольнекротических факторов и может быть представлен как в форме мембранного белка, так и в растворимой форме. Связывание Fas-рецептора с Fas-лигандом приводит к включению механизмов апоптоза с активацией каспаз-индукторов. При последующей активации эффекторных каспаз начинается цепь протеолитических реакций, целью которых является апоптотический «демонтаж» клетки: фрагментация ДНК, прямое расщепление структурных белков клетки, нарушение регуляции белкового синтеза. Таким образом, участие эффекторных каспаз в апоптозе приводит к разрыву апоптотической клетки с окружающими клетками, реорганизации цитоскелета, снижению возможностей репарации и репликации ДНК, разрыв ядерной мембраны и разрушение ДНК, выбросу сигналов, маркирующих клетку для апоптоза, расчленению клетки на апоптотические тельца. Не случайно эффекторные каспазы получили название «каспаз-палачей».

Методы исследования апоптоза достаточно разнообразны. Первоначально наиболее распространенным способом определения апоптоза был электрофорез экстрагируемой фракции ДНК, который позволяет выявить дискретность низкомолекулярной ДНК по мол. массе (как результат межнуклеосомной деградации ДНК). В морфологических исследованиях для выявления разрывов ДНК используют TUNEL-метод, основанный на формировании вставок меченых олигонуклеотидов в участках разрывов ДНК, образование которых катализируется ферментом TdT.

В настоящее время для регистрации апоптоза лимфоцитов все шире применяют методы, основанные на проточной цитофлуориметрии. К этой группе относится метод, основанный на выявлении потери клетками части ДНК (гиподиплоидных клеток) с помощью флуоресцентного красителя - пропидиума йодида, который описан ниже. Для определения апоптоза используются и другие методы, основанные на проточной цитофлуориметрии. Апоптоз лимфоцитов можно обнаружить уже на ранних этапах с помощью меченого флуорохромом аннексина V, который связывается с фосфатидилсерином, появляющимся на мембране клеток, подвергающихся апоптозу. Ориентировочное представление о «склонности» лимфоцитов к развитию апоптоза можно получить, определяя экспрессию на их поверхности Fas-рецептора (CD95) и в митохондриях – протонкогена bcl-2.

Клиническая значимость оценки апоптоза при клинико-иммунологическом обследовании больных несомненна, поскольку с его нарушением связан целый ряд заболеваний. Ослаблением апоптоза обусловлено формирование аутоиммунных заболеваний (вследствие нарушения процесса выбраковки аутоспецифических клонов лимфоцитов). Поэтому регистрация ослабления апоптоза может служить источником информации о патогенетических механизмах таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, а также аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, основой которого является мутация генов, детерминирующих рецепторы апоптотических сигналов. Нарушение апоптоза является важным механизмом развития злокачественных процессов. В опухолевых клетках часто выявляется мутация гена р53, кодирующего белок, который воспринимает сигнал о наличии нерепарированных разрывов в ДНК и хромосомных мутациях, приводящий к развитию апоптоза. В результате генетически дефектные клетки не выбраковываются и становятся источником формирования опухолей.

При ряде других заболеваний отмечается, наоборот, усиление апоптоза. Это имеет место при инфекционных процессах (причиной массового апоптоза Т-клеток часто являются микробные суперантигены), сепсисе, различных вирусных заболеваниях, в том числе СПИД. Апоптоз усилен при ряде заболеваний крови и первичных иммунодефицитов, когда его причиной является недостаточная выработка факторов выживания клеток, роль которых выполняют цитокины. Так, при одной из форм тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с мутацией гена ИЛ-7 или общей γ-цепи цитокиновых рецепторов, является гибель лимфоидных предшественников вследствие дефицита ИЛ-7.

Однако наиболее общезначимой является оценка «активационного апоптоза», которому подвергаются лимфоциты при их стимуляции митогенами. Дело в том, что апоптоз, наряду с пролиферацией, является формой ответа лимфоцитов на активационные стимулы. На ранних этапах дифференцировки преобладает апоптотический ответ, и его результатом является формирование толерантности к индукторному антигену. Зрелые лимфоциты отвечают на стимуляцию преимущественно пролиферацией (что служит начальным этапом и предпосылкой развития иммунного ответа), но определенная вероятность их вступления в активационный апоптоз сохраняется. Поскольку апоптоз при этом выступает в качестве процесса, альтернативного пролиферации, их соотношение может служить мерой результативности ответа клеток на активирующие сигналы. Чем выше вклад апоптоза в ответ лимфоцитов на митоген, тем менее эффективной будет антигенспецифическая иммунная защита. Таким образом, определение апоптоза при активации лимфоцитов митогенами является наиболее информативным при условии параллельной оценки пролиферативного ответа клеток на тот же стимул.

В процессе апоптоза в клетке происходит сложная цепь реакций на молекулярном уровне, приводящих к изменению обменных процессов и фенотипической характеристики клеток. Эти изменения могут быть определены биохимическим, микроскопическим или цитометрическим методами и используются в качестве маркеров апоптоза.

Одним из ранних маркеров апоптоза является появление на цитоплазматической мембране клетки рецепторов к аннексину . В апоптотических клетках фосфолипид фосфатилдисерин (ФС) переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны. Локализация ФС на поверхности мембраны наблюдается начиная с
ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Рекомбинант-
ный аннексин V-белок (35-36 кД), обладающий высокой аффинно-
стью к ФС в присутствии ионов Са +2 . Связываясь с ФС на поверхно-
сти клетки аннексин V, конъюгированный с флуорохромом, служит
маркером апоптоза. Обычно аннексин V используется в комбинации с
пропидием иодидом (PI), что позволяет одновременно распознавать
интактные клетки (отрицательные и по аннексину V, и по PI), клетки,
находящиеся в «раннем» апоптозе (положительные по аннексину V,
отрицательные по PI), и клетки, находящиеся в позднем апоптозе или
в некрозе (положительная и по аннексину V и по PI).

СD95 Fas, или APO-1,- трансмембранный гликопротеин (45 кД), являющийся членом семьи рецепторов к фактору некроза опухолей (TNF-α). CD95 антиген экспрессируется в значительном количестве на тимоцитах, CD4 + , CD8 + лимфоцитах периферической крови, в меньшей степени на В-лимфоцитах и NК-клетках. Этот антиген экспрессируется также на гранулоцитах и моноцитах, но его экспрессия не обнаружена на тромбоцитах и эритроцитах. Рецептор CD95 наблюдается также на клетках нормальных тканей и опухолей. Связывание CD95 Fas-лигандом (Fas-L, CD95L) индуцирует апоптоз в клетках, его экспрессирующих. Моноклональные антитела к CD95 позволяют с использованием метода проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии выявить популяцию клеток, готовых к апоптозу.

CD95L (Fas-L) – называемый Fas-лигандом, является мембранным белком (40кД). Существует также растворимая форма CD95L (sFas-L), которая представляет собой белок (26 кД) из семьи рецепторов (TNF-α). Этот антиген экспрессируется цитотоксическими Е-лимфоцитами и NК-клетками, а также выявлен на многих опухолевых клетках. Связывание Fas-L с рецептором CD95 индуцирует процесс апоптоза в клетках-мишенях. Моноклональные антитела к CD95L позволяют с использованием метода проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии выявить популяцию клеток, готовых к апоптозу.

Bcl-2 – белок (26 кД), оверэкспрессия которого блокирует апоптоз. Bcl-2 – внутриклеточный белок, локализующийся на митохондриях, поэтому для его определения с помощью моноклональных антител необходимо провести предварительную пермеабилизацию мембраны клетки.

Конец работы -

Эта тема принадлежит разделу:

Методы оценки иммунного статуса учебное пособие для студентов лечебного, педиатрического и медико-профилактического факультетов

Курский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.. кафедра клинической иммунологии и аллергологии..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ:

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Иммунный статус и методы его оценки
Иммунный статус (ИС)– совокупность лабораторных показателей, характеризующих количественную и функциональную активность клеток иммунной системы. Показатели ИС отличаются большим ра

Объекты и методы иммунологических исследований
Объекты изучения Методы изучения Фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток Проточная цитофлуорометрия Имм

Лимфоциты
В составе клеток иммунной системы истинными иммуноцитами являются все варианты лимфоцитов. Другие типы лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты), макрофаги, тромбоциты, тучные клетки

Клетки МФС
Моноциты периферической крови и тканевые макрофаги происходят из полипотентной стволовой клетки. Попав в кровяное русло, моноциты в течение 2-3 суток расселяются в ткани, где они превращаются в тка

Антимикробная кислородзависимая система
кислородзависимые механизмы бактерицидности глюкоза + НАДФ+ → Пентозофосфат + НАДФН Цитохром b245 НАДФ + О2 ͛

Медиаторные клетки
Гранулоциты - это полиморфноядерные лейкоциты, циркулирующие в крови и возникающие, как и моноцитарно-макрофагальные клетки, из миелоидной стволовой клетки в костном мозге. Различают три типа грану

Методы иммунофенотипирования лимфоцитов
При изучении лимфоцитов оценивают их количество в периферической крови и функциональную активность. Определение количества клеток проводят с учетом дифференцировочных антигенов на и

Выделение фракции мононуклеаров
Метод выделения мононуклеаров основан на разной плавучести различных форменных элементов крови. Применение градиента определенной плотности позволяет отделить мононуклеары (лимфоциты, моноциты, бла

Проточная цитофлуорометрия
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный свето

Метод непрямой иммунофлуоресценции
Непрямая иммунофлуоресценции – метод, основанный на использовании моноклональных антител, меченных флюорохромом, с оценкой результатов по учету специфического свечения клеток при люминесцентной мик

Иммуноцитохимический метод
Иммуноцитохимические методы основаны на использовании таких ферментов, как пероксидаза и щелочная фосфатаза. В настоящее время наиболее часто используются метод ПА (пероксидаза-антипероксидаза), ст

Методы исследования функциональной активности лимфоцитов
Функциональную активность лимфоцитов оценивают по следующим эффектам: способность к распознаванию антигенов, активации, пролиферации и дифференцировке клеток. Способность лимфоцитов распоз

Реакция бласттрансформации лимфоцитов
Контакт лимфоцита с чужеродным антигеном или неспецифическим митогеном сопровождается активацией и реакцией бласттрансформации (РБТЛ), т.е. пролиферацией клетки с переходом малых лимфоцитов в бласт

Смешанная культура лимфоцитов
Совместное культивирование лимфоцитов, имеющих молекулы МНС-II разного гаплотипа, вызывает их бласттрансформацию и пролиферацию. Реагирующие клетки относятся к Т-лимфоцитам и стимулируются чужеродн

Белки плазмы крови
В плазме человека присутствует более двухсот белков, большая часть из которых выделена и описана структурно и функционально. Белки плазмы преимущественно представлены гликопротеинами. При электрофо

Глобулины
α1-антитрипсин - это α1-глобулин, на долю которого приходится более 80% антипротеазной активности сыворотки, является основным компонентом α-полосы. В сыворотке соде

Глобулины
Гаптоглобин - период полужизни 2-4 дня. Содержание в сыворотке гаптоглобина в норме 0,3 - 2,0 г/л. Его основное функциональное значение - связывать свободный гемоглобин в сыворотке

Методы электрофореза белков
Электрофорезшироко используется для полуколичественного определения белков сыворотки крови и для выявления парапротеинов. Электрофорез проводится с сывороткой, а не с плазмой, так

Иммуноглобулины
Иммуноглобулины (Ig) – это специфические белки, которые вырабатываются иммунной системой в результате реакции на чужеродные антигены и накапливаются в сыворотке крови и других биологических жидкост

Иммуноглобулинов человека
Свойство IgM IgG IgA IgD IgE Молекулярная форма Пентамер

Методы определения иммуноглобулинов
Для количественного определения содержания Ig различных классов в сыворотке крови и других биологических жидкостях широкое применение нашли различные варианты постановки реакции преципитации в геле

Парапротеины
Парапротеины - это иммуноглобулины или их фрагменты, вырабатываемые плазматическими клетками, образующимися из одной специфической клеточной линии В-лимфоцитов (моноклон). Парапротеины часто не спо

Криоглобулины
Криоглобулины - патологические белки плазмы (10-80 мг/мл), обладающие свойством превращения в желеобразное состояние при температуре ниже 37°С. Большинство криоглобулинов - это комплексы поликлонал

Методы определения иммунных комплексов
Связывание Ig с антигеном представляет собой физиологический процесс, приводящий к образованию иммунных комплексов (ИК), направленный на элиминацию антигена из организма. Однако при определенных ус

Определение аутоантител при диагностике системных заболеваний соединительной ткани
По современным представлениям аутоиммунитетом называют такие состояния, при которых в организме появляются антитела или сенсибилизированные лимфоциты против нормальных антигенов собственных тканей.

Основные серологические маркеры аутоиммунных заболеваний
Антиген Оригинальное название Молекулярная структура Функция Диагностическое значение

Определение ANA в реакции непрямой иммунофлуоресценции
При осуществлении типичного теста сыворотку пациента инкубируют с антигенными субстратами (ткань печени или почек животных, культура клеток Нер-2) для осуществления специфического связывания имеющи

Непрямой иммунофлуоресценции
Характер свечения Антигенная специфичность Клиническое значение Периферическое или краевое dsDNA, l

Определение ANA и ENA методом твердофазного ИФА
Тест-система для ИФА ANA (UBI MAGIWELL) - для скринингового анализа на антиядерные антитела обеспечивает полуколичественное определение широкого спектра антител к сорбированному в лунках комплексу

Аутоиммунных заболеваний
Тип патологии Результаты иммунологического исследования. Тип антител и частота их встречаемости (%)

Система цитокинов
Цитокины - это класс растворимых пептидных медиаторов иммунной системы, необходимых для ее развития, функционирования и взаимодействия с другими системами организма. Они определяют

Интерлейкины
ИЛ-1- иммунорегуляторный медиатор, выделяемый при воспалительных реакциях, тканевых поражениях и инфекциях (провоспалительный цитокин). ИЛ-1 стимулирует пролиферацию и дифференциро

Интерфероны
Интерферон (ИФН) был обнаружен как белок, обладающий противовирусной активностью. Противовирусное действие ИФН обусловлено его способностью препятствовать внутриклеточной репликации вируса на этапе

Факторы некроза опухоли
Фактор некроза опухоли (ФНО) - основной медиатор, вырабатываемый организмом в ответ на грамотрицательные бактерии. Активным веществом грамотрицательных бактерий является ЛПС компонент клеточной сте

Колониестимулирующие факторы
Ряд цитокинов, образующихся в ходе развития иммунной реакции, обладают стимулирующим действием на дифференцировку костномозговых предшественников. Такие цитокины получили название колониестимулирую

Факторы роста
Трансформирующий фактор роста(ТФРβ) - это семейство родственных пептидов с множественными эффектами на общие процессы регуляции роста и морфогенеза. ТФРβ - основной циток

Методы определения цитокинов
Определение содержания цитокинов в различных биологических жидкостях имеет большое значение в оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток и регуляции иммунного ответа. В отдельных сл

Система комплемента
Система комплемента представляет собой комплекс белков сыворотки крови, способных к самоорганизации и опосредованию реакций гуморального иммунитета и фагоцитоза. В настоящее время известно, что сис

Методы определения активности комплемента
Общая активность (титр) комплемента определяется в реакции гемолиза с использованием эритроцитов барана. Комплемент, содержащийся в исследуемой сыворотке, вызывает гемолиз сенсибилизированных баран

Титра комплемента в 50% HE
Гемолиз,% К Гемолиз,% К Гемолиз,% К Гемолиз,% К

Определение компонентов комплемента
Для определения компонентов комплемента используются ИФА и турбидиметрический метод, проведение которых описано в инструкциях, прилагаемых к диагностическим тест-системам. В клинической практике на

Компонентов комплемента
Компонент комплемента Клинические проявления Дефицит С1 Обычно не вызывает клинически выраженных расстройств, так как ест

Методы исследования фагоцитарной активности гранулоцитов
Важнейшей характеристикой функции гранулоцитов является оценка их фагоцитарной активности. Ее снижение может быть результатом как недостаточности опсонирующих факторов сыворотки (антител, комплемен

НСТ-тест
Тест с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) используется для выявления так называемых активированных гранулоцитов и моноцитов. В основе активации фагоци­тов лежит резкое усиление окислительных реакций

Методика исследования
Необходимые реактивы и материалы: КН 42 ОРО 44 0, Na 42 ОРО 44 0, NaCI, глюкоза, нитросиний тетразолий, гепарин, метиловый спирт, 1% водный раствор метиленового зеленого (в случае

Определение миелопероксидазы
Миелопероксидаза окисляет ряд субстратов (бензидин, ортофенилепдиамин) в присутствии перекиси водорода, что сопровождает­ся цветной реакцией. Миелопероксидаза - фермент, содержащийся в гранулах фаг

Хемилюминесценция
Спонтанное свечение, возникающее при химических реакциях за счет энергии реагирующих веществ, называется хемилюминесценцией (ХЛ). Она присуща всем тканям и клеткам живого организма, пока в них прои

Определение содержания IgE
Среди иммунологических методов оценки неспецифических параметров иммунного статуса при большинстве атопических заболеваний наибольшее значение имеет определение количества общего IgE. Однако соглас

Тест дегрануляции базофилов
У больных аллергией значительная часть IgE связывается различными лейкоцитами через их Fc-рецепторы. Наличие клеток, несущих антитела, указывает на сенсибилизацию их к соответствующему аллергену. Б

Тест клеточной антигенной стимуляции базофилов - CAST
В случае IgE-опосредованных аллергических реакций пусковой механизм начинается со связывания аллергена со специфическими молекулами IgE на поверхности базофилов или тучных клеток. Э

Реакция торможения миграции лейкоцитов
Реакция ставится с целью выявления лимфоцитов, сенсибилизированных к предполагаемому аллергену. Сенсибилизированные лимфоциты при взаимодействии со специфическим аллергеном выделяют медиаторы (ФПМЛ

Задача № 1
Больной, 23 лет, предъявляет жалобы на рецидивирующие фурункулы, локализующиеся на лице, ногах. Отмечает частые простудные заболевания (до 7-8 раз в год), герпетические высыпания на губах.

Задача № 2
Больная Н., 22 лет, обратилась к иммунологу с жалобами на рецидивирующие ОРВИ (до 7 раз в год), часто сопровождающиеся обострением хронического обструктивного бронхита. Проводимая антибактериальная

Задача № 3
Больной Т., 27 лет, неоднократно обращался к врачу по поводу рецидивирующих ОРВИ, трахеобронхита, слабости, недомогания. Из анамнеза установлено, что в течение года шесть раз переболел ОРВИ, дважды

Задача № 4
Больной К, 45 лет. Дагноз: системная красная волчанка. При иммунологическом исследовании выявлено: Лейкоциты - 5,5 х 109/л Лимфоциты –37%, абс. 2,03 х 109

Задача № 5
Ребенок, 5 лет, относится к группе часто и длительно болеющих детей, рецидивы ОРВИ 1 раз в месяц, очаги хронической инфекции (хронический гайморит, аденоидит), увеличение шейных лимфатических узлов

При иммунологическом обследовании
Тесты первого уровня Общее количество лейкоцитов. Лейкоформула Т-лимфоциты В-лимфоциты

Общий анализ крови
Норма Единицы СИ Гемоглобин М Ж 130,0-160,0 120,0-140,0 г/л

Основные CD маркеры клеток иммунной системы
СD-маркер Популяция клеток % клеток CD2 Т- и NK-клетки

Субпопуляция лимфоцитов у детей
лимфоциты 4-5 дн.- 3 месяца 4-8 месяцев 1-2 года 2-5 лет старше 5 лет вс

Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови взрослых
IgМ IgG IgА IgЕ 1,3 – 1,7 г/л 12 – 14 г/л 2,1 – 2,9 г/л

Аллергологическая MAST-панель (множественный аллергосорбентный тест) для выявления специфических иммуноглобулинов к аллергенам различных групп
Пищевая панель Ig E Российская расширенная панель Ig E Пищевая панель Ig G Российская универсальная панель Ig E

Словарь терминов
Авидность - прочность связывания антигена с антителом, которая определяется аффинностью и валентностью антител. Агглютинация - агрегация к

Список сокращений и условных обозначений
АГ – антиген АОК – антителообразующая клетка АПК – антигенпрезентирующая клетка АТ – антитело ВЛС – выносящий лимфатический сосуд ЗВК – зараженная вирус

Маркова А.А. 1 Кашкина Е.И. 1 Рубцов В.С. 1 Лякишева Р.В. 1

1 Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского, Саратов

Проведен анализ экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации у 61 больного неспецифическим язвенным колитом в зависимости от длительности, степени тяжести заболевания, локализации воспалительного процесса в толстой кишке. Группу сравнения составили 15 практически здоровых человек. Обследование пациентов проводилось с использованием клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических методов. В биоптатах слизистой оболочки толстой кишки определяли экспрессию иммуногистохимических маркеров Ki-67, P53, BAX и РЭА. В процессе исследования выявлено статистически значимое снижение показателей пролиферативной активности слизистой оболочки толстой кишки у больных неспецифическим язвенным колитом по сравнению с группой здоровых лиц, а также снижение процессов пролиферации и повышение экспрессии маркеров апоптоза по мере увеличения длительности и усугубления тяжести клинических проявлений заболевания.

неспецифический язвенный колит

маркеры апоптоза и пролиферации

1. Аруин Л.И., Капуллер Л.Л., Исаков В.А. Морфологическая диагностика болезней желудка и кишечника. – М.: Триада-Х, 1998. – 496 с.

2. Гастроэнтерология и гепатология: диагностика и лечение: руководство для врачей / под ред. А.В. Калинина, А.Ф. Логинова, А.И. Хазанова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2011. – 864 с.: ил.

3. Brown D. Gatter K. Monoclonal antibody Ki-67: its use in histopathology // Histopathology. – 1990. – № 17. –

4. Bruno S., Darynkiewich Z. Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibody in HL-60 cells // Cell. Prolif. – 1992. – № 25. –

5. A comparison of proliferation markers (BrdUrd, Ki-67, PCNA) determined at each cell position in the crypts of normal human colonic mucosa / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

et al. // Eur. J. Histochem. – 1996. – Vol. 40. – P. 89–100.

6. Holt P.R., Moss S.F., Kapetanakis A.M. Is Ki-67 a better proliferative marker in the colon then proliferating cell nuclear antigen? Cancer. Epidimiol // Biomarkers. Prev. – 1997. –

№ 6. – P. 131–135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. et al. Detection of the Ki-67 antigen in fixed and wax- embedded section with the monoclonal antibody MIB-1 // Histopathology. – 1993. –

№ 22. – P. 355–360.

8. Reed J. C. Bcl-2 and regulation of programmed cell death // J. Cell. Biol. – 1994. – Vol. 124. – P. 1–6.

Неспецифический язвенный колит (НЯК) является одним из наиболее тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, приводящим к инвалидности и смерти пациентов .

В последние десятилетия в различных странах мира отмечается рост заболеваемости НЯК, что, в значительной мере, связано с улучшением диагностики этого патологического процесса.

В настоящее время в диагностике НЯК используется комплексный подход с применением рентгенологического, эндоскопического, гистологического методов исследования. Одним из перспективных способов оценки состояния слизистой оболочки толстой кишки является иммуногистохимия с определением маркеров пролиферации и апоптоза .

Среди методов иммуногистохимического исследования наиболее широкое применение нашли маркеры апоптоза bcl и p53 . Известно, что белки семейства bcl относятся или к индукторам апоптоза (Bad, Bax, Bak и др.) или к ингибиторам апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, BOO и др.) . Следует отметить, что белок p53 выявляется во многих трансформированных клетках. Его функции направлены на предупреждение переноса поврежденной генетической информации от одного поколения клеток другому, в том числе за счет инициации апоптоза. Высокое содержание p53 приводит к повышению концентрации в клетке Вах и уменьшению концентрации bcl-2, что способствует гибели клетки путем апоптоза .

В качестве маркеров пролиферации используются несколько антигенов. Ядерный антиген пролиферирующих клеток (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (PCNA) участвует не только в пролиферации клеток, но и в репарации ДНК после ее повреждения , что делает данный антиген условно специфичным к клеточному циклу, так как восстановление ДНК может осуществляться в фазе покоя . Другим антигеном, достоверно ассоциированным с фазами клеточного цикла, является Ki-67. Экспрессия этого белка наступает во время пресинтетической фазы, нарастает в течение клеточного цикла и резко уменьшается в фазе митоза . Этот белок, в отличие от PCNA, не участвует в репарации ДНК . Экспрессия Ki-67 дает возможность идентифицировать клетки, находящиеся во всех фазах клеточного цикла, кроме фазы покоя .

Цель исследования - провести анализ экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации у больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от длительности, степени тяжести заболевания, локализации воспалительного процесса.

Материалы и методы исследования

Основную группу составил 61 пациент с НЯК в возрасте от 19 до 66 лет (27 женщин и 34 мужчины), группу сравнения - 15 практически здоровых людей. Обследование пациентов проводилось с использованием клинических, лабораторных, эндоскопических, морфологических методов, а также с помощью иммуногистохимического исследования биоптатов слизистой оболочки толстой кишки.

Пациенты с НЯК были разделены на группы в зависимости от степени тяжести клинических проявлений, длительности заболевания, локализации воспалительного процесса.

Пролиферативную активность клеток определяли по пролиферативному показателю Ki-67 по формуле:

где X - количество ядер в поле зрения микроскопа. Подсчет производился не менее чем в 10 полях зрения.

Об апоптозе судили по экспрессии белков p53 и BAX в поверхностном и железистом эпителии толстой кишки. Для оценки регенеративных процессов в слизистой оболочке толстой кишки при НЯК определялась экспрессия ракового эмбрионального антигена (РЭА).

Результаты исследования и их обсуждение

При иммуногистохимическом исследовании определялась зависимость экспрессии указанных маркеров от длительности НЯК, тяжести его клинических проявлений и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке.

При статистической обработке полученных данных после проведения тестов на равенство дисперсий и нормальность распределения было доказано, что выборка не соответствует закону нормального распределения, поэтому для сравнения групп применялись непараметрические критерии. Для описания количественных признаков использовались медиана, верхний и нижний квартили.

Так, у здоровых лиц ИП Ki-67 составил 54 (46;67), что говорит о высокой пролиферативной активности клеток толстой кишки (таблица).

Индекс пролиферации Ki-67 клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки (%) у здоровых людей и больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от его длительности, тяжести течения и локализации

Примечания:

• р 0 - достоверность различий с группой контроля;
• р 1 - достоверность различий с длительностью заболевания менее 1 года;
• р 2 - достоверность различий с легким течением заболевания;
• р 3 - достоверность различий с дистальной локализацией заболевания.

Экспрессия BAX у здоровых лиц отсутствовала в 80 % случаев, а в 20 % отмечалась низкая экспрессия маркера. Экспрессия РЭА отмечалась в 50 % случаев и также была низкой.

Все пациенты в зависимости от длительности заболевания были разделены на 3 группы: 1-я с НЯК длительностью до 1 года, 2-я с продолжительностью от 1 до 5 лет и 3-я - более 5 лет.

Как следует из таблицы, повышение ИП Ki-67 в группе больных с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет по сравнению с 1 группой (р ≤ 0,02), можно объяснить повышенной пролиферативной активностью клеток, отражающей репаративные процессы в слизистой оболочке толстой кишки. Низкий ИП Ki-67 в группе пациентов с язвенным колитом длительностью до 1 года, составляющий 31(25;36), может свидетельствовать о выраженном снижении пролиферативных процессов в слизистой оболочке кишки в дебюте заболевания.

При исследовании показателя p53 в зависимости от длительности заболевания, закономерности экспрессии этого белка не выявлено, однако имеется различие в экспрессии этого маркера между группой здоровых лиц и группой больных с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет (р ≤ 0,05) и более 5 лет (р ≤ 0,03).

Экспрессия BAX определялась как в поверхностном, так и железистом эпителии толстой кишки. Было установлено, что экспрессия данного маркера в поверхностном эпителии и в эпителии желез практически одинакова в каждом отдельном случае. Экспрессию BAX у больных НЯК выявляли в 100 % случаев, статистически значимые различия в экспрессии маркера были выявлены между группой сравнения и больными НЯК (р ≤ 0,01).

При сравнении интенсивности экспрессии РЭА отмечалось значительное ее повышение при увеличении длительности заболевания. В группе сравнения экспрессия РЭА проявлялась лишь в единичных случаях (р ≤ 0,003).

В зависимости от тяжести клинических проявлений НЯК также было выявлено изменение ИП Ki-67 (см. таблицу). ИП Ki-67 уменьшался у больных со среднетяжелой формой заболевания (р ≤ 0,05) и тяжелой формой (р ≤ 0,02) по сравнению с пациентами с легким течением, также имелось различие между группой здоровых лиц и пациентами с НЯК любой степени тяжести (р ≤ 0,004).

Изменение экспрессии маркера p53 зависело от тяжести течения обострения (12,5 % при легком течении; 35,7 % при средней степени тяжести и 50 % при тяжелом). Статистически значимые различия получены между группами здоровых лиц и пациентов с НЯК средней и тяжелой формами заболевания (р ≤ 0,03).

BAX и РЭА экспрессировали в 100 % случаев, однако, зависимости интенсивности экспрессии данных маркеров от степени тяжести клинических проявлений НЯК не выявлено. Установлены различия в экспрессии маркеров между группой сравнения и пациентами с НЯК независимо от тяжести клинических проявлений (р≤0,01).

При анализе зависимости ИП Ki-67 от локализации воспалительного процесса было выявлено значительное повышение экспрессии маркера в группе больных НЯК по сравнению со здоровыми людьми (р ≤ 0,002), однако при сравнительном анализе внутри основной группы статистически значимых различий между экспрессией маркера и различной локализацией процесса не получено (р ≥ 0,05).

Экспрессия р53 выявлялась не у всех пациентов. У больных с дистальным колитом положительный результат был получен только в 20 % случаев, с левосторонним у 18 % больных. При тотальном поражении кишечника экспрессия р53 обнаруживалась в 100 % случаев (р ≤ 0,03 по сравнению с дистальным колитом). Следует отметить, что экспрессия была наиболее интенсивна в участках с признаками метаплазии эпителия.

Интенсивность экспрессии BAX в группе с тотальным колитом была значительно выше, чем при дистальном колите (р ≤ 0,03).

Экспрессия РЭА не зависела от локализации воспалительного процесса, однако она была достоверно выше у больных НЯК по сравнению с группой сравнения (р ≤ 0,03).

При неспецифическом язвенном колите пролиферативная активность клеток эпителия слизистой оболочки толстой кишки значительно ниже, а показатели апоптоза выше, чем при отсутствии ее воспалительных изменений.

Увеличение длительности неспеци-фического язвенного колита сопровождается низкой пролиферативной активностью эпителия слизистой оболочки толстой кишки, что может ухудшать ее репарацию.

С нарастанием тяжести клинических проявлений неспецифического язвенного колита отмечается не только уменьшение степени пролиферативной активности клеток эпителия толстой кишки, но и увеличение показателей активации апоптоза.

При распространении воспалительного процесса на проксимальные отделы толстой кишки выявлено увеличение показателей апоптоза.

Рецензенты:

Шварц Ю.Г., д.м.н., профессор, зав. кафедрой факультетской терапии ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ имени В.И. Разу-мовского» Минздравсоцразвития России, г. Саратов;

Федорина Т.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой общей и клинической патологии: патологическая анатомия, патологическая физиология ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Самара.

Работа поступила в редакцию 09.12.2011.

Библиографическая ссылка

CAD (caspase activated DNase) на фрагменты размером, кратным 180-200 нуклеотидам . В результате апоптоза происходит образование апоптичних телец - мембранных везикул , содержащих целостные органеллы и фрагменты ядерного хроматина . Эти тельца поглощаются соседними клетками или макрофагами в результате фагоцитоза . Так как внеклеточный матрикс не поражается клеточными ферментами , даже при большом количестве апоптозных клеток, воспаление не наблюдается.

Процесс апоптоза является необходимым для физиологического регулирования количества клеток организма, для уничтожения старых клеток, для формирования лимфоцитов , которые не являются реактивными к своим антигенов (аутоантигенов), для осеннего опадения листьев растений , для цитотоксического действия Т-лимфоцитов киллеров, для эмбрионального развития организма (исчезновение кожных перепонок между пальцами у эмбрионов птиц) и других.

Нарушение нормального апоптоза клеток приводит к неконтролируемому размножению клетки и появления опухоли.

1. Значение апоптоза

Апоптоз - неотъемлемая часть жизнедеятельности большинства многоклеточных организмов. Особенно важную роль он играет в процессах развития. Например конечности четвероногих закладываются как лопатообразные вырасти, а формирование пальцев происходит благодаря гибели клеток между ними. Также подлежат апоптоза больше не нужны клетки, таким образом частности разрушается хвост у головастиков при метаморфозу. В нервной ткани позвоночных во время эмбрионального развития более половины нейронов погибают путем апоптоза сразу же после образования .

Также апоптоз является частью системы контроля за "качеством" клеток, он позволяет разрушать те из них, которые неправильно расположены, поврежденные, нефункциональные или потенциально опасные для организма. Примером могут служить и B-лимфоциты , которые погибают, если не несут полезных антиген -специфических рецепторов или несут автореактивни. Путем апоптоза также умирает большинство лимфоцитов аткивованих при инфекции после его преодоления .

У взрослых организмов одновременная регуляция пролиферации клеток и апоптоза позволяет поддерживать стали размеры целой особи и ее отдельных органов. Например, после вживавання препарата фенобарбитал , что стимулирует пролиферацию гепатоцитов, у крыс увеличивается печень . Однако, сразу же после прекращения действия этого вещества все лишние клетки подлежат апоптоза, в результате чего размер печени возвращается к нормальному .

Также апоптоз происходит, когда клетка "чувствует" большое количество внутренних повреждений, которые она не может репаруваты. Например, в случае повреждения ДНК клетка может трансформироваться в раковую, чтобы этого не произошло она, при нормальных условиях, "кончает жизнь самоубийством". Также погибает путем апоптоза большое количество клеток инфицированных вирусами .

2. Маркеры апоптических клеток

Маркеры апоптоза

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках методом TUNEL Препарат ткани печени мыши, ядро апоптичнои клетки имеет коричневую окраску, оптическая микроскопия.

Выявление фрагментации ДНК в апоптичних клетках с помощью электрофореза в агарозном геле. Слева: ДНК выделенной из апоптических клеток - видно "лесенку ДНК"; посередине: маркеры; дело: контрольный образец ДНК из необработанных клеток. Клеточная линия H4IIE (гепатома крыс), индуктором апоптоза - паракват, визуализация с помощью етидий бромида.

Сверху: выявление конденсации и фрагментации хроматина путем закрашивания флуоресцентным красителем (Hoechst 34580). Посередине: выявление транслокации фосфадидилсерину в наружный листок плазмалемме путем закрашивания аннексином V. Снизу: Микрофотография апоптических клеток в светлом поле. Клеточная линия - Jurkat, индуктор апоптоза - TRAIL, конфокальной и свитлопильна оптическая микроскопия .

Клетки, погибают путем апоптоза, можно распознать по ряду морфологических признаков. Они становятся меньше и более плотными (пикноз), округляются и теряют псевдоподии , в них разрушается цитоскелет , распадается ядерная мембрана , хроматин конденсируется и фрагментируется. На поверхности клеток появляется большое количество пузырьков, если клетки достаточно велики, то они распадаются на окружены мембранами фрагменты - апоптические тельца .

В апоптичних клетках кроме морфологических происходит также большое количество биохимических изменений. Частности ДНК разрезается специальными нуклеазами в линкерних участках между нуклеосомы на фрагменты равной длины. Поэтому при разделении всей ДНК апоптичнои клетки с помощью электрофореза можно наблюдать характерную "лесенку". Другой метод выявления фрагментации ДНК - метки ее свободных концов с помощью метода TUNEL ( T erminal deoxynucleotidyl transferase d U TP n ick e nd l abeling ) .

Изменения претерпевает также и плазматическая мембрана апоптичних клеток. При нормальных условиях отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин содержится только в ее внутреннем (возвращенном к цитозоля) слое, однако во время апоптоза он "перескакивает" в наружный листок. Эта молекула служит сигналом "съешь меня" для ближних фагоцитов . Фосфатидилсерин-индуцированное поглощение апоптических клеток, в отличие от других типов фагоцитоза, не приводит к выделению медиаторов воспаление . Описанная изменение плазмалемме лежит в основе еще ​​одного метода выявления клеток, погибающих путем апоптоза - окрашивание анексином V, специфически связывается с фосфатидилсерина .

3. Каспаз - медиаторы апоптоза

Клеточные системы, которые обеспечивают прохождение апоптоза, аналогичные у всех животных, центральное место в них занимает семья белков каспаз. Каспаз - это протеазы , имеющие в активном центре остаток цистеина , и разрезают свои субстраты по специфическому остатка аспарагиновой кислоты (отсюда название: c от cysteine и asp от aspartic acid ). Каспазы синтезируются в клетке в виде неактивных прокаспаз, которые могут становиться субстратами для других, уже активированных каспаз, что режут их в одном или двух местах по остатку аспартата. Два образованы фрагменты - больший и меньший - соединяются между собой, формируя димер, что ассоциирует с таким же диммером. Сформированный таким образом тетрамер и является активной протеазой, что может разрезать белки-субстраты. Кроме участков, соответствующих большей и меньшей субъединиц, прокаспазы иногда также содержат ингибиторные продомены, которые деградируют после отщепления.

В результате расщепления и активации одних каспаз другими формируется протеалитичний каскад, который существенно усиливает сигнал и делает апоптоз с определенного момента необратимым процессом. Те прокаспазы, которые начинают этот каскад называются инициаторным, а их сусбтраты - эффекторными. После аткивации эффекторные каспазы могут расщеплять другие эффекторные прокаспазы или белки-мишени. До мишеней эффекторных каспаз, которые разрушаются во время апоптоза относятся в частности белки ядерной ламины, розщелення которых приводит к распаду этой структуры. Также деградирует белок, при нормальных условиях подавляет эндонуклеазы CAD, вследствие этого начинается фрагментация ДНК. Расщепляются каспаз и белки цитоскелета и межклеточной адгезии , вследствие чего апоптические клетки округляются и отсоединяются от соседних клеток, и таким образом становятся легче мишенью для фагоцитов .

Набор каспаз, необходимый для прохождения апоптоза зависит от типа ткани и пути, по которому активируется клеточная смерть. Например у мышей при "выключении" гена, кодирующие эффекторные каспазы-3, апоптоз не происходит в мозге, однако нормально протекающей в других тканях .

Гены прокаспаз активны в здоровых клетках, а следовательно белки необходимы для протекания апоптоза постоянно присутствующие, нужна лишь их активация для запуска клеточного суицида. В состав инициаторных прокаспаз входит длинный продомен, содержащий CARD ( caspase recruitment domain , Домен привлечения каспаз). CARD позволяет инициаторным прокаспазы присоединяться к адаптерных белков образуя активационные комплексы, когда клетка получает сигнал, что стимулирует апоптоз. В активационных комплексах несколько молекул прокаспаз оказываются непосредственно вблизи друг друга, чего достаточно для их перехода в активное состояние, после чего они разрезают друг друга .

Два лучше изучены сигнальные пути активации каскада каспаз в клетках млекопитающих называются внешний и внутренний (митохондриальный), каждый из них использует собственные инициаторным прокаспазы .

4. Пути активации апоптоза

4.1. Внешний путь

Клетка может получать сигнал, индуцирующего апоптоз, извне, например, от цитотоксических лимфоцитов. В таком случае активируется так называемый внешний путь ( extrinsic pathway ), Начинающийся с рецепторов смерти. Рецепторы смерти - это трансмембранные белки , принадлежащие к семейству рецепторов фактора некроза опухолей (ФНО), например сам рецептор ФНО и рецептор смерти Fas. Они формируют гомотримеры, в которых каждый мономер имеет внеклеточный лиганд-Связной домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен смерти, через адаптерные белки привлекает и активирует прокаспазы .

Лиганды рецепторов смерти также гомотримерамы. Они родственны между собой и принадлежат к семейству сигнальных молекул фактора некроза опухолей. Например, цитотоксические лимфоциты несут на своей поверхности лиганды Fas, которые могут присоединяться к рецепторам смерти Fas на плазмалемме клеток-мишеней. В таком случае внутриклеточные домены этих рецепторов соединяются с адаптерного белка ( FADD, Fas-associated death domain ), А те в свою очередь привлекают инициаторным прокаспазы 8 и / или 10. Вследствие этой серии событий формируется сигнальный комплекс, индуцирующего смерть, - DISC ( death inducing signaling complex ). После активации в этом комплексе инициаторным каспазы разрезают эффекторные прокаспазы и запускают апоптичнои каскад .

Многие клетки синтезируют молекулы, в определенной степени защищают их от активации внешнего пути апоптоза. Примером такой защиты может быть экспрессия так называемых рецепторов-приманок ( decoy receptors ), Имеющих внеклеточные домены связывания лигандов, однако не цитоплазматических доменов сметри, а следовательно не могут запускать апоптоза и конкурируют с обычными рецепторами смерти за лиганды. Клетки также могут продуцировать белки, блокирующие внешний путь апоптоза, например FLIP, похожий по структуре прокаспаз 8 и 10, однако не протеалитичнои активности. Он подавляет связывание инициаторных прокаспаз с комплексом DISC .

4.2. Внутренний путь

Апоптосома

Апоптоз также может запускаться изнутри клетки, например в случае ее травмирования, повреждения ДНК, недостатка кислорода , питательных веществ или внеклеточных сигналов выживания. У позвоночных этот сигнальный путь называется внутренним ( intrinsic pathway ) Или митохондриальной, ключевым событием в нем является высвобождение определенных молекул с межмембранном пространстве митохондрий. До таких молекул зокрема належить цитхром c, що за звичайних умов входить до електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, проте у цитоплазмі виконує іншу функцію - приєднується до адаптерного білка Apaf ( apoptotic protease actiuating factor-l ), Вызывая его олигомеризации в колесоподибну семичленну структуру, которая называется апоптосома. Апоптосома привлекает и активирует инициаторным прокаспазу-9, которая затем может активировать инициаторным прокаспазы .

В некоторых клетках внешний путь апоптоза должен активировать внутренний для того чтобы эффективно уничтожить клетку. Внутренний путь строго регулируется белками семьи Bcl-2 .

4.2.1. Регуляция внутреннего пути белками семьи Bcl-2

К семейству Bcl-2 относятся эволюционно консервативны белки, главной функцией которых является регуляция высвобождения цитохрома c и других молекул с мижмебранного пространства митохондрий. Среди них есть про-апоптические и анти-апоптические молекулы, которые могут взаимодействовать между собой в различных комбинациях, подавляя друг друга, баланс между их активностью и определять судьбу клетки .

Сейчас известно около 20 белков из этой семьи, все они содержат хотя бы один из четырех альфа-спиральных доменов гомологии Bcl2, называемых BH1-4 ( bcl2 homology ). Антиапоптични белки семьи Bcl2 содержат все четыре домены, к ним относятся сам Bcl-2, а также Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 и A1. Проапоптични белки делятся на две группы, члены первой из которых содержат три BH-домены (BH1-3), это в частности Bak, Bax и Bok (последний экспрессируется только в тканях репродуктивных органов). Наиболее многочисленной среди семьи Bcl-2 является вторая группа проапоптичних белков, которые содержат только домен BH3 (BH3-only), к ней относятся Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma .

При нормальных условиях (т.е. когда клетка не проходит апоптоза) антиапоптични белки, такие как Bcl-2 и Bcl-X L, связываются с проапоптичнимы белками BH123 (Bax и Bak) и не позволяют им полимеризоваться во внешней мембране митохондрий образуя поры. В результате действия определенного апоптичнои стимула в клетке активируются или начинают синтезироваться проапоптични белки, содержащие только домен BH3. Они в свою очередь ингибируют антиапоптични белки, снимая угнетающее действие на Bak и Bax, либо напрямую взаимодействуют с последними и способствуют их олигомеризации и образованию пор. Вследствие пермеабилизации наружной мембраны в цитозоль попадает цитохром c , а также другие медиаторы апоптоза, такие как AIF (англ. apoptosis inducing factor ).

Например, при недостатке сигналов выживания в клетке при посредничестве MAP-киназы JNK активируется экспрессия BH3 белка Bim, запускающий внутренний путь апоптоза. В случае повреждения ДНК происходит накопление супрессора опухолей p53 , который стимулирует транскрипцию генов, кодирующих BH3 белки Puma и Noxa, которые также обеспечивают прохождение апоптоза. Еще один BH3 белок - Bid обеспечивает связь между внешним и внутренним путями апоптоза. После активации рецепторов смерти и, как следствие, каспазы-8, последняя разрезает Bid с образованием усеченной формы tBid (truncated Bid), которая перемещается в митохонрий, где подавляет Bcl-2 .