Забор патологического материала для диагностики микозов и его микроскопическое исследование. Лабораторная диагностика микозов Методы микробиологической диагностики и профилактики микозов

Содержание

Выявить поражение и определить возбудителя при поражении грибка на первых этапах крайне сложно. Диагностирование осложнено тем, что патология сразу никак не проявляется или имеет разнообразную симптоматику. Для определения возбудителя берут биоматериал с того участка, который поразила патогенная микрофлора: мокроту, часть кожи, зараженный ноготь, кровь, биопсию лимфоузлов или внутренних органов.

Что такое грибковые заболевания

Как выглядит

Причиной обращения к дерматологу становятся, как правило, первые патологические проявления болезни. Клинические признаки будут отличаться в зависимости от места заражения, возбудителя грибкового заболевания. Выделяют следующие типы патогенных микроорганизмов:

• грибок Кандида (Candida) – вызывает кандидозные инфекции;
• Трихофитии (Trichophyton) – провоцирует инфекционные патологии ногтей, кожи, слизистых оболочек;
• Криптококкоз – атакует внутренние органы, легкие;
• Аспергиллез – грибковое заболевание, вызванное снижением иммунитета.

При диагностике может быть определена одна из 2 групп инфекции по локализации:

Проникает патогенная микрофлора через ранки на поверхности эпидермиса, микротравмы, причиной заболевания может стать любая царапина, которая спровоцирует микоз гладкой кожи. Не справляется организм с атакой возбудителя при снижении защитных функций. При диагностике часто определяют заражение родом трихофитон или Кандида. Последние вызывают такие заболевания:

• молочница;
• кандидоз у мужчин;
• кандидоз ротовой полости.

Существует более нескольких десятков возбудителей, их делят по методу поражения тканей. При диагностике могут выявить следующие виды грибковых микроорганизмов:

• глубокие системные микозы провоцирует Histoplasma capsulatum;
• субкутанные подкожные микозы вызывает Sportrichum schenckii;
• эпидермомикозы развиваются из-за Epidermophyton floccosum;
• отрубевидный лишай, поверхностный микоз - Malassezia furfur;
• оппортунистические грибковые заболевания - Candida albicans.

Классификация микозов

Общее название всех болезней этого типа скрывает под собой разные виды поражения организма человека грибами. При диагностике врачи разделяют заболевания кожи на 4 группы:

1. Кератомикозы. Местом локализации становится роговой слой эпидермиса, в других слоях кожи воспалительные явления отсутствуют (пьедра, разноцветный лишай, парша, споротрихоз). Вызывают эту разновидность патологии следующие грибы: Sporotrichium, Trichosporon, Piedraia, Exophiala, Pityrosporum.
2. Дерматомикозы. Характеризуются выраженным воспалительным процессом, локализуются на коже, волосистой части головы, на ногтях (фаус, трихофития, эпидермофития, микроспория). Провоцируют патологии следующие штаммы грибов: Epidermophyton, Microsporum, Trichophyton.
3. Кандидамикозы. Затрагивает этот вид грибков слизистые оболочки, кожу и ее придатки. Часто объектом атаки грибков рода Кандида становятся внутренние органы.
4. Глубокие микозы. Провоцируют тяжелые заражения всех слоев кожи, внутренних органов, слизистых оболочек, костей, мышц (мукороз, пенициллиоз, аспергиллез).

Выделяют отдельно псевдомикозы (актиномикоз, эритразма), которые не являются заболеваниями грибкового типа, но по симптомам схожи с истинными микозами. В этих случаях обязательно нужна дифференциальная диагностика. Диагностика в таких случаях очень важна, потому что помогает определить тип грибкового поражения или исключить его. От этого зависит назначения схемы лечения, ее длительность и эффективность.

Дерматомикозы

Грибки-дерматофиты глубокого проникаются в кожу, провоцируют дерматомикозы, к примеру, следующие известные патологии:

• микроспория;
• трихофития;
• эпидермофития;
• руброфития;
• фавус.

Относят этот вид патологии к разным болезням, которые создают рубцовые изменения, деформацию кистей рук, ногтей стоп, изменение структуры и выпадение волос. Поражают возбудители верхние, глубокие слои кожи, что приводит к появлению фурункулоподобных узлов, пустулезных высыпаний, обширных очагов воспаления. Для развития благоприятным условием становится нарушение гигиены стоп. Сначала грибок растет на коже ног, в межпальцевых промежутках, затем переходит на ногти.

Кандидозы

Патогенные микроорганизмы поражают глубокие и поверхностные слои кожи, распространяются на ногти, волосы, внутренние органы. Вызывают болезни грибы рода Кандида, болезни относятся к группе кандидамикозов. Выделяют следующие типы этих недугов:

• генерализованные;
• поверхностные;
• висцеральные.

Относятся грибы Candida к условно-патогенным. Дрожжеподобные возбудители можно обнаружить при диагностике в кишечнике, ротовой полости и у здорового человека. Сдерживает распространение патогенных микроорганизмов сильный иммунитет, а при его ослаблении начинается активное размножение кандид, что приводит к поражению кожного покрова туловища, ступней, головы, кистей. Клинические изменения отмечаются при всех типах кандидамикозов. Лечение зависит от тяжести течения, вида поражения.

Глубокий микоз

Это вид заболеваний, которые затрагивают глубокие слои кожи, внутренние органы. Болезни развиваются при сильном снижении защитных сил организма, изменении гормонального фона, нарушении обмена веществ. Относят следующие патологии к глубоким микозам:

• кокцидиоидоз;
• хромомикоз;
• риноспоридиоз;
• гистоплазмоз;
• споротрихоз;
• бластомикоз;
• мукороз;
• цефалоспориоз;
• мицетома;
• кладоспориоз;
• мадурская стопа;
• аспергиллез.

Кератомикоз

Это группа патологий, которые локализуются только на кутикулах волос, роговом, поверхностном слое кожи. Характерным признаком кератомикоза становится отсутствие воспалительных явлений. Возбудителями болезни являются плесневелые, дрожжеподобные грибы, дерматофиты (около 70 видов патогенов). Провоцируют они следующие заболевания:

• шимбери;
• белый лишай;
• черный лишай;
• черепицеобразный микоз;
• тропический белый и желтый лишай;
• узловатая трихоспория;
• пьедра;
• разноцветный (отрубевидный) лишай.

Как диагностировать грибок

Далее начинается визуальный осмотр, который помогает определить масштабность поражения, какие участки поверглись воздействию грибков. Врач должен обратить внимание на наличие иммунодефицитного состояния пациента. Для определения типа возбудителя необходимо сделать забор материала, который отправляют на лабораторное исследование. Опытный врач может при первичном осмотре поставить диагноз, но для составления схемы терапии нужно все равно провести изучение биоматериала. Для диагностики грибковых заболеваний применяют следующие методы:

• микроскопия – исследование под микроскопом биоматериала, распространенный и простой метод диагностики;
• исследование под лампой Вуда – специальный спектр ультрафиолетового освещения (люминесценция) помогает заметить грибковые поражения;
• бактериологический посев – точный способ диагностики, но проведение его занимает 2-3 недели, пока не вырастет колония на питательной среде;
• ПЦР-диагностика – самый точный способ определения вида патогенной микрофлоры, но для точного диагноза может потребоваться проведение нескольких анализов, что требует траты денег.

Лабораторные методы

Только своевременный точно поставленный диагноз поможет назначить эффективную схему терапии и сократить длительность курса. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний является самым эффективным методом для определения типа возбудителя. Для выявления используют такие варианты исследования:

• бактериологический посев;
• гистологический анализ;
• ПЦР-диагностирование;
• иммунологическое исследование;
• микробиологические исследования;
• культкуральное исследование.

Дифференциальная диагностика микозов

Постановку точного диагноза затрудняет то, что при разных видах микоза появляются различные симптомы. В таких случаях используют дифференциальный метод диагностики, сравнивают с другими дерматологическими патологиями микоз. Часто признаки микоза путают с псориазом, но при соскабливании чешуек грибковая патология не будет кровоточить. Схожая симптоматика наблюдается и с парапсориазом.

Врач должен исключить вероятность развития нуммулярной экземы. Это особый вид патологии, который можно выявить только при лабораторной диагностике. Часто признаки грибка принимают за полиморфный фотодерматоз, который может развиваться только у взрослого человека и никогда не встречается у ребенка. Лабораторная и дифференциальная диагностика обязательна для постановки точного диагноза, назначения грамотного лечения.

Микробиологическая диагностика микозов

Это самый простой и распространенный метод выявления микоза на коже и в крови. Для точного диагноза необходимо собрать материал для исследования. При поражении волосистой части головы нужно при помощи пинцета собрать пораженные волосы, а с кожи сделать соскоб поврежденного участка. Лабораторные исследования при грибковых заболеваниях по микробиологическому методу проводятся при помещении биоматериала в раствор гидроксида калия 30%, потом на предметное стекло.

Анализ поможет вывить, где расположен грибок (снаружи или внутри кожи, волоса), его размеры. Если забор материала провести неверно, то анализ может дать ошибочный результат. Используют для диагностики следующие методы микробиологической диагностики:

• микроскопия с нативными и неокрашенными препаратами;
• микроскопия с окрашенными препаратами.

Методы исследования

При диагностике специалист должен учитывать структуру мицелия (строение гиф, их септированность, цвет), особенности строения спор, кондиев, учитывается их цвет, форма и размер, строение клеточной стенки и т.д. Для исследования готовят нативные, окрашенные препараты. Последние требуют обработки материала разными способами:

1. PAS-окрашивание. Окраска такого типа помогает определить в стенках микроорганизмов нейтральные полисахариды. К ним относится глюкан-маннановый комплекс, который находится в клеточной стенке многих эумицетов. Он и провоцирует процесс окрашивания.
2. PAS-реакция. Используется для диагностики грибковой инфекции тканевой формы. В лаборатории применяют для этого исследования разные модификации, к примеру, окраска по Гридли или реакция Бауэра.
3. Метод Грама. Окраска этим способом помогает выявить наличие сопутствующих микрорганизмов.
4. Окраска по Циль-Нильсону. Помогает определить кислотоустойчивые микроорганизмы. Если биоматериал жидкий, то готовят специальный неокрашенный мазок в просветляющих жидкостях для микроскопии: в равных пропорциях смешивают глицерин и спирт.

Культуральное исследование на грибы

Помещают посев биоматериала на питательную среду (выращивание), чтобы выделить чистую культуру при комнатной температуре. Диморфные грибы в таких условиях образуют мицелий, при росте до 37 градусов начинают формироваться дрожжеподобные клетки. Среда Сабуро применяется для дерматофитов и грибов Candida, для плесневелых (гифальных) необходима среда Чапека. Часто добавляют в состав антибиотик. Глубокие микозы могут определить только в клинико-лабораторных центрах из-за высокой контагиозности.

Люминесцентная диагностика грибковых заболеваний

Для определения пораженных участков кожи патогенной микрофлорой рода Микроспорум используют ультрафиолетовую лампу. Это вариант экспресс-диагностики, которая применяется при необходимости подтвердить наличие кожной инфекции, симптомы лишайных заболеваний. Ультрафиолетовое излучение не является главным способом определения грибка, это вспомогательный метод, поэтому выполнять его не обязательно.

Для осмотра больного используют лампу Вуда, они испускает УФ излучения, под их действием продукты жизнедеятельности грибка светятся ярким светом. Цвет зависит от того, какой вид возбудителя поразил пациента:

• зеленоватый – лишай волосистой части головы;
• голубой – красная волчанка на губах;
• желтоватый – плоские лишайные образования.

Иммунологический ферментный анализ крови на грибок

Для обнаружения микозов, поразивших кожные покровы, внутренние органы (гистоплазмоз, кокцидиоидоз) используют иммунологический ферментный анализ крови на грибковые заболевания. Часто используют эту методику в случае, если взять биопсию тканей для изучения по определенным причинам не получается. Основывается методика на поиск титра антител к конкретному типу грибкового заболевания.

Для этих целей используют определение IgG к аспергиллезу, кандидозу. Точность анализа составляет около 80%, в редких случаях можно получить ложноположительный результат при отсутствии глубоких микозов. Случается это при наличии у больного грибка слизистой оболочки рта или запущенной формы молочницы. Для ИФА требуется забор венозной крови, берут его утром рано или, спустя 4 часа после последнего приема пищи. Другой подготовки для проведения анализа не требуется.

Ответ на анализ будет через несколько суток после забора биоматериала. Редко длительность ожидания превышает 5 дней. Влияет на скорость проведения исследования качество оборудования в лаборатории, если есть причины провести дополнительное изучение образцов крови. Пациенту выдают по завершении процедуры заключение, где будет указано одно из значений:

• при подтверждении наличия грибка будет написано «положительный результат»;
• при отсутствии полной уверенности, что был обнаружен грибок в крови, пишут «сомнительный результат»;
• при отсутствии патогенной микрофлоры в образце биоматериала пишут «отрицательный результат»;
• при наличии хорошего оборудования при исследовании крови могут определить концентрацию клеток микоза и указать показатель в заключение.

ПЦР-диагностика грибковых заболеваний

Самым точным и достоверным способом диагностики грибка и других инфекционных заболеваний является полиразмерная цепная реакция. Обладает метод диагностики следующими преимуществами:

• низкая стоимость анализа;
• высокая точность;
• исследование биоматериала проводится быстро;
• для анализа можно собрать любой образец тканей (частичку кожи, слизистой, соскоб с подошвы стоп, пальцев рук, поверхности ногтей, волосы, кровь).

Главный недостаток этого исследования – узкая направленность. Чтобы диагностировать микоз, нужно точно знать, где он поразил организм человека. ПЦР определяет тип возбудителя, концентрацию в организме больного. Результаты будут известны через сутки, в некоторых случаях (при отсутствии неблагоприятных условий), ответы приходят в день сдачи (через 5-6 часов). Скорость выполнения исследования зависит от правильности забора образца, опытности медперсонала, загруженности работой лаборатории.

Как определить грибок в домашних условиях

При умении распознать симптоматику микозных патологий и применении домашних методов диагностирования, можно определить вид патогена. Пациент должен правильно оценить течение болезни, можно на первых этапах грибковое заболевание спутать с псориазом или лишаем. Чтобы этого избежать, нужно знать основные признаки микоза, которые отличают его от других недугов. Симптомы поражения грибком:

• ногти становятся желтого цвета, начинают слоиться;
• изменение формы ногтевой пластины;
• нет периодов ремиссии и обострения, начинается полное отслоение пластины, что не происходит при кожных патологиях и псориазе;
• место поражения имеет неприятный запах, болит при прикосновенно, появляется зуд, шелушение, могут образовываться бляшки на поверхности кожи;
• поражает грибок, как правило, межпальцевые промежутки на одной или обеих ногах, затем недуг распространяется на ноготь и остальную ступню.

Диагностика грибка ногтей на ногах с помощью перманганата калия

Если вы заметили, что ногти на руках, ногах начали видоизменяться, появился неприятный запах, то можно прямо дома проверить наличие или отсутствие инфекции. Вам понадобится для проведения анализа марганец, теплая вода и емкость. Процедура проводится следующим образом:

• при наличии признаков кожного заболевания нанести тонким слоем йод на этот участок;
• подождите 2 минуты;
• если проблема есть, то очаги поражения примут насыщенный окрас;
• здоровые участки кожи выделять не будут.

Сколько стоит диагностика грибковых заболеваний в клиниках Москвы

Видео

Внимание! Информация, представленная в статье, носит ознакомительный характер. Материалы статьи не призывают к самостоятельному лечению. Только квалифицированный врач может поставить диагноз и дать рекомендации по лечению, исходя из индивидуальных особенностей конкретного пациента.

4402 0

К сожалению, и в настоящее время можно констатировать, что диагностика грибковых заболеваний нередко бывает несвоевременной (зоны поредения волос, шелушение часто принимаются за «перхоть», «сухость»). При этом субьективные ощущения (зуд, боль и др.) в очагах поражения зачастую не бывают, и больные в силу этого долгое время не обращаются на прием к специалисту.

Изменения ногтей (уродливые, крошатся, истонченные) расцениваются как «ониходистрофии» после ушиба, отморожений и др. В то же время (даже изолированные поражения, в т.ч.ногтей) могут вести к формированию аллергической перестройки организма, влиять на кровеносные и лимфатические сосуды и др. Больные при этом неопределенно долго остаются источником распространения грибковой инфекции. В связи со сказанным неизменно актуальной является своевременная лабораторная диагностика микозов, проведение возможно раннего лечения.

Разнообразие клинических вариантов грибковых заболеваний, преимущественно встречающихся у человека, а также особенности микробиологии, морфоструктуры, иммунологических и иных параметров различных видов(и родов) грибов обусловило наличие значительного количества методов диагностики микозов; следует отметить, что имеющиеся методы непрерывно совершенствуются и (сравнительно недавно) имеют своеобразный уклон в сторону иммунологических и молекулярно-генетических тестов.

С другой стороны, культуральные исследования и до сих пор «находятся в разряде стандартов, близких к золотым» и применяются для подтверждения сомнительных результатов иных исследований; существует мнение, что сочетание культурального и молекулярно-генетического методов при «сомнительных» в диагностическом плане формах микозов (особенно диссеминированных, на фоне иммуносупрессии любого генеза, с поражением внутренних органов и др.) является одним из наиболее достоверных способов регистрации микотической природы процесса.

Не следует, однако, пренебрегать «старыми» методиками, в частности бактериоскопией (особенно припервичном обследовании), тем более, что в повседневной практике микроскопическая «верификация» микоза во многих дерматологических учреждениях применяется наиболее широко в сравнении с иными тестами.

С учетом значительного роста количества аллергических проявлений на коже (а иногда и висцеральных) — при длительном, хроническом, периодически обостряющемся течении микоза (кожи, ногтей и др.) целесообразна постановка аллергологических тестов, позволяющих выявить степень сенсибилизации организма, в т.ч, при сочетанной грибково-бактериальной инфекции; данный факт может повлиять на специфику лечения у конкретного больного — например, определить рациональное назначение антимикотиков и десенсибилизирующих средств и др.

Традиционно, предположительный диагноз грибкового заболевания ставится на основании клинических проявлений и подтверждается лабораторными исследованиями.

В данном разделе книги мы кратко приводим базовые методы регистрации микозов (независимо от их локализации), учитывая «тип исследования и взятый материал». Следует отметить, что полиморфизм клинических проявлений микозов (в т.ч. с аллергическим компонентом) обусловливает разнообразие патологического материала, подлежащего исследованию. При этом успех поиска элементов гриба зависит от правильного взятия его.

Так, периферическая зона эритемато-сквамозных, часто фигурных высыпаний более богата мицелием, спорами гриба; на волосистых участках поражения берутся скрюченные, белесоватые, обесцвеченные, тусклые волосы или их обломки — «пеньки» (забор волос целесообразно контролировать с помощью лампы Вуда). Определенных навыков требует забор материала (с помощью иглы) из т.н. «черных точек» — темных роговых конусов в устьях фолликулов.

В повседневной практике обычно исследуются чешуйки кожи(собираются путем соскоба, мазка, с использованием липкой ленты), соскоб измененных ногтей, зона подногтевого гиперкератоза, а также отделяемое слизистых оболочек. По показаниям исследуют мокроту, лаважную жидкость, мочу (у пациентов с некатетеризированным мочевым пузырем); моча из мочеприемников, подкладных суден не может быть взята для исследования.

Диагностическое значение имеет также кровь (для культурального исследования, а также ИФА, ПЦР), ликвор и иные биожидкости организма (плевральная, внутрисуставная, внутрибрюшинная — в т.ч. собранные методом аспирации или дренирования); в отдельных случаях (в зависимости от топического диагноза) имеют значение желчь, фекалии, пунктаты подкожных абсцессов, отделяемое свищей (особенно при глубоких микозах). Даже несложные диагностические тесты требуют точного соблюдения ряда условий.

Для диагностики грибковых заболеваний в настоящее время применяются методы:
- микроскопия; основана на обнаружении возбудителя в исследуемом материале, в т.ч. в тканях человека;
- культуральное исследование с последующим микроскопическим изучением культуры гриба;
- гистологическое исследование (г.о. при глубоких микозах);
- иммунные и молекулярные методы.

Микроскопическая диагностика

Микроскопическая диагностика предполагает изучение неокрашенных (нативных) и окрашенных препаратов. Данный метод, как отмечалось, более всего распространен в дерматологической практике ввиду сравнительной несложности и дешевизны, но, с другой стороны, бывает недостаточно чувствительным, требует в части Случаев повторных анализов, подтверждения иными методиками.

Так, при исследовании неокрашенных препаратов помимо элементов гриба, можно обнаружить эпителиоциты, клетки крови,различные загрязнения из внешней среды, что затрудняет поиск возбудителя микоза, требует дополнительной «подготовки» материала — т.н. «просветления» его (мацерации), концентрирования, разведения и т.п.

Все же прямая микроскопия нативных препаратов позволяет достаточно быстро поставить диагноз микоза, определить, на какие питательные среды (при необходимости) следует засевать материал, существует мнение, что положительный результат ее может оставаться единственным лабораторным подтверждением микоза при отрицательном ответе в культуре (А.Ю.Сергеев, Ю.В.Сергеев, 2003).

Среди различных вариантов «просветления» препаратов наиболее распространенным является добавление к исследуемому материалу КОН или NаОН (чаще используется для обнаружения грибов в чешуйках кожи, волосах, а также ряда возбудителей глубоких микозов в мокроте, биоптатах).

Для мацерации измельченных и помещенных на предметное стекло чешуек проводится 10-20% раствором едкого натра (или калия) — 1-3 капли, в течение 10-20 мин; препарат слегка придавливают покровным стеклом, для более скорой мацерации — подогревают на пламени до появления паров. Просмотр ведут сначала под малым увеличением, затем — под большим (сухая система).

Правильно приготовленный препарат, не подвергшийся грубым механическим, термическим и химическим воздействиям, представляет картину гомогенной массы, состоящей из эпителиоцитов, продуктов клеточного распада элементов гриба — нитей мицелия и спор.

Измененные волосы помещают на предметное стекло с 10-30% щелочью и обрабатывают тем же способом, но более длительно - от 20 мин до 3-4 ч. При обильном содержании пигмента рекомендуют предварительно обесцветить волосы 5% раствором перекиси водорода. Придают значение обнаружению элементов гриба, а также расположению их по отношению к волосу.

Подготовка материала из патологически измененных ногтей (лучше тонкий порошок, полученный соскобом из глубины очага) проводится аналогично, но с использованием 30% едкого натра, обязательным осторожным подогреванием на пламени до легких паров и экспозицией около 1ч (иногда до нескольких часов). Обработанные щелочью препараты не следует хранить более 1,5-2ч ввиду их «порчи» (кристаллизация реагента, снижение диагностической достоверности определяемой микроскопической картиной).

Вместо КОН или №ОН можно использовать: а)раствор смесь КОН с 15% ДМСО; б) смесь фенола (2 части) с хлоралгидратом (2 части) и молочной кислотой (1 часть); в) калькофлюоровый белый, имеющий сродства к хиги-ну и целлюлозе; для исследования необходим люминесцентный микроскоп (наблюдается голубое или зеленое свечение, что зависит от применяющегося фильтра). При исследовании ликвора (при подозрении на криптококкоз) часто использовалась окраска с тушью.

Кулага В.В., Романенко И.М., Афонин С.Л., Кулага С.М.

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами : обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами : обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами : выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами : выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах

Вероятный инвазивный микоз диагностируют при совокупности следующих критериев:
один признак из категории микробиологических критериев;
один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.

Возможный инвазивный микоз диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.

Понятие «возможный инвазивный микоз » не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Выделение дрожжевых грибов из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35-50 %.
Проведение повторных посевов крови повышает вероятность получения положительных результатов.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40-60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

Критерии инвазивного микоза

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов - только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.

Идентификация грибов до вида , особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре - определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты - как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови - 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации - 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90-99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60-70 % и 80-90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весь­ма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы иссле­дования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из не­скольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным иссле­дованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы че­ловека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диа­гностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков орга­нов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или не­дель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих раство­ров или даже индифферентных средств может помешать ис­следованию. Непосредственно перед забором патологическо­го материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов по­ражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с пе­риферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы поражен­ные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогну­тые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необ­ходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но ста­новятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помеща­ют в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл пи­тательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области ве­нечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического мате­риала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем са­мым делают грибы доступными для исследования.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раство­ром КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих тем­но-синих чернил фирмы Паркер (Parker"sSuperchromeBlue-BlackInk). При этой окраске гифы и споры окрашива­ются в голубой цвет.

Для диагностики микозов могут быть использованы микроскопические, микологические (культуральные), аллергические, серологические, биологические и гистологические методы исследования. В зависимости от патогенеза материалом для исследования могут быть гной, мокрота, пораженные волосы, ногти, чешуйки кожи, пунктаты костного мозга, лимфатических узлов, внутренних органов, кровь, желчь, испражнения, биоптаты тканей и т. п.

Микроскопическое исследование включает микроскопию на-тивных (неокрашенных) и окрашенных мазков. Для приготовления нативных препаратов волосы, соскобы кожи, ногтей просветляют в 10.30 % растворах КОН или NaOH. Обработанный щелочью материал помещают на предметное стекло в каплю глицерина, накрывают покровным стеклом и микроскопируют (можно использовать фазово-контрастную микроскопию), что дает возможность изучить строение гриба, расположение спор, но окончательное заключение о видовой принадлежности гриба можно сделать только после культуральных исследований.

Для окраски мазков чаще всего используют методы Грама, Циля.Нильсена, Романовского-Гимзы. Для окраски дерматофитов применяют также методы Сабуро, Адамсона и др.

Культуральное (микологическое) исследование проводят для выделения чистой культуры гриба и ее идентификации. Используют плотные и жидкие питательные среды (Сабуро, сусло-агар, Чапека и др.). Инкубация в термостате (22.28ºС) длительная (3.4 нед). Чистую культуру гриба идентифицируют по совокупности признаков: форме колоний, их цвету, консистенции, микроскопической картине (характер мицелия, расположение спор, конидиеносцев) и другим признакам.Серологические реакции для диагностики грибковых заболеваний проводят с грибковыми антигенами по общепринятым методикам, как и для диагностики других инфекционных заболеваний (РА, РП, РСК, РНГА, РИФ и др.).

Аллергические пробы можно проводить по общепринятым методикам внутрикожным введением соответствующих аллергенов (полисахаридные и белковые фракции из клеток или клеточных оболочек, взвесь клеток убитых грибов, фильтраты культур). Для выявления ГНТ можно использовать тест дегрануляции тканевых и сывороточных базофилов, а для выявления ГЗТ – реакции торможения миграции фагоцитов, бластной трансформации лимфоцитов.

Биологическое исследование проводят на лабораторных моделях (мыши, крысы, морские свинки, кролики, собаки, кошки). Биологическую модель микоза используют для выявления патогенности возбудителя, выделения чистой культуры, изучения новых антимикотиков. Гистологическое исследование дает возможность обнаружить гриб в тканях, изучить его морфологию и особенности патологического процесса, вызванного им в организме.