Glavni ciljevi molekularne strukture pod utjecajima. Molekularne mete

Članak daje osnovnu ideju o tome kako nastaju lijekovi u suvremenom svijetu. Razmotrena je povijest dizajna draga, osnovni pojmovi, termini i tehnologije koje se koriste u ovom području. Posebna pozornost posvećena je ulozi računalne tehnologije u ovom procesu koji zahtijeva veliko znanje. Opisuju se metode pretraživanja i validacije bioloških meta za lijekove, visokoučinkoviti probir, procesi kliničkog i pretkliničkog testiranja lijekova te uporaba računalnih algoritama.

Drag dizajn: povijest

Industrija ciljanog dizajna novih lijekova, ili, kako se ovaj proces naziva, prevođenjem s engleskog u nedostatku jednako kratkog i prikladnog ruskog izraza, drag dizajn ( droga- medicinski proizvod, oblikovati- dizajn, konstrukcija) je relativno mlada disciplina, ali još uvijek ne tako mlada kao što se obično vjeruje.

Slika 1. Paul Ehrlich, koji je prvi postavio hipotezu o postojanju kemoreceptora i njihovoj mogućoj upotrebi u medicini.

Nacionalna medicinska knjižnica SAD-a

Do kraja devetnaestog stoljeća kemija je dosegla značajan stupanj zrelosti. Otkriven je periodni sustav elemenata, razvijena teorija kemijske valencije, teorija kiselina i baza te teorija aromatskih spojeva. Taj nedvojbeni napredak dao je poticaj medicini. Novi kemijski proizvodi - sintetičke boje, derivati ​​smola, počeli su se koristiti u medicini za diferencijalno bojenje bioloških tkiva. Godine 1872.–1874. u Strasbourgu, u laboratoriju poznatog anatoma Wilhelma Waldeera, student medicine Paul Ehrlich (slika 1), koji je proučavao selektivno bojenje tkiva, prvi je iznio hipotezu o postojanju kemoreceptora - posebnih struktura tkiva koje specifično djeluju na kemikalije, te je pretpostavio mogućnost korištenja ovog fenomena u liječenju raznih bolesti. Kasnije, 1905. godine, ovaj koncept je proširio J. Langley, koji je predložio model receptora kao generatora unutarstaničnih bioloških impulsa, koji se aktivira agonistima i inaktivira antagonistima.

Taj se trenutak može smatrati rođenjem kemoterapije i novom revolucijom u farmakologiji, au 20. stoljeću doveo je do neviđenog uspjeha u kliničkoj medicini. Jedno od najpoznatijih dostignuća farmaceutske industrije 20. stoljeća s pravom se može nazvati penicilinom, antibiotikom koji je 1929. godine otkrio Alexander Fleming, a kasnije su ga proučavali Cheyne i Florey. Penicilin, koji ima antibakterijski učinak, poslužio je čovječanstvu s nezamjenjivom uslugom tijekom Drugog svjetskog rata, spasivši živote milijuna ranjenika.

Zadivljene uspjehom penicilina, mnoge su farmaceutske tvrtke otvorile vlastite mikrobiološke odjele, polažući nade u njih da će otkriti nove antibiotike i druge lijekove. Naknadni napredak u biokemiji doveo je do činjenice da je postalo moguće teorijski predvidjeti uspješne mete za terapijsku intervenciju, kao i modifikacije u kemijskim strukturama lijekova, dajući nove spojeve s novim svojstvima. Tako je antibiotik sulfanilamid, kao rezultat niza istraživanja, iznjedrio čitave obitelji hipoglikemijskih, diuretičkih i antihipertenzivnih lijekova. Drag dizajn je porastao na kvalitativno novu razinu kada razvoj novih medicinskih spojeva nije postao samo plod mašte kemičara, već rezultat znanstvenog dijaloga između biologa i kemičara.

Novo otkriće povezano je s razvojem molekularne biologije, koja je omogućila uključivanje informacija o genomu u razvoj, kloniranje gena koji kodiraju terapeutski važne biološke mete i ekspresiju njihovih proteinskih produkata.

Završetak projekta “ljudski genom”, koji je označio početak novog milenija, a rezultat kojeg su očitane cjelokupne informacije sadržane u ljudskoj DNK, bio je pravi trijumf za granu biološke znanosti zvanu “genomika”. Genomika pruža potpuno novi pristup traženju novih terapeutski važnih ciljeva, dopuštajući njihovo pretraživanje izravno u nukleotidnom tekstu genoma.

Ljudski genom sadrži 12 000–14 000 gena koji kodiraju izlučene proteine. Trenutno se u farmaceutskoj industriji ne koristi više od 500 meta. Postoje studije koje govore da su mnoge bolesti “multifaktorijalne”, odnosno da su uzrokovane disfunkcijom ne jednog proteina ili gena, već 5-10 međusobno povezanih proteina i gena koji ih kodiraju. Na temelju ovih razmatranja možemo zaključiti da bi se broj ciljeva koji se proučavaju trebao povećati najmanje 5 puta.

Biokemijska klasifikacija trenutno proučavanih bioloških ciljeva i njihov numerički omjer prikazani su na slici 2. Treba posebno napomenuti da najveći (>60%) udio receptora čine membranski G-protein spregnuti receptori ( GPCR, G-protein spregnuti receptori), a ukupna prodaja lijekova usmjerenih na interakciju s njima iznosi 65 milijardi dolara godišnje i nastavlja rasti.

Osnovni koncepti

Slika 3. Tri tipa utjecaja liganada na stanični odgovor: povećanje odziva ( pozitivni agonist), postojanost odgovora, ali natjecanje za vezanje s drugim ligandima ( neutralni agonist) i smanjenje odgovora ( antagonista).

Osnovni koncepti koji se koriste u drag dizajnu su cilj I lijek. Meta je makromolekularna biološka struktura, vjerojatno povezana s određenom funkcijom, čije kršenje dovodi do bolesti i na koju se mora izvršiti određeni utjecaj. Najčešće mete su receptori i enzimi. Lijek je kemijski spoj (obično niske molekularne težine) koji specifično djeluje s metom i na ovaj ili onaj način modificira stanični odgovor koji stvara meta.

Ako je meta receptor, tada će lijek najvjerojatnije biti njegov ligand, odnosno spoj koji specifično djeluje s aktivnim mjestom receptora. U nedostatku liganda, receptor je karakteriziran vlastitom razinom staničnog odgovora - takozvanom bazalnom aktivnošću.

Na temelju vrste modifikacije staničnog odgovora ligandi se dijele u tri skupine (slika 3):

1. Agonisti povećavaju stanični odgovor.
2. Neutralni agonisti vežu se na receptor, ali ne mijenjaju stanični odgovor u usporedbi s bazalnim razinama.
3. Inverzni agonisti ili antagonisti smanjuju stanični odgovor.

Stupanj interakcije liganda s metom mjeri se afinitetom, odnosno afinitetom. Afinitet je jednak koncentraciji liganda pri kojoj je polovica meta vezana za ligand. Biološka karakteristika liganda je njegova aktivnost, odnosno koncentracija liganda pri kojoj je stanični odgovor jednak polovici maksimuma.

Definicija i provjera cilja

Jedna od najranijih i najvažnijih faza dizajna otpora je odabir prave mete, djelovanjem na koju se mogu specifično regulirati neki biokemijski procesi, a da se po mogućnosti ne utječe na druge. Međutim, kao što je već spomenuto, to nije uvijek moguće: nisu sve bolesti rezultat disfunkcije samo jednog proteina ili gena.

S dolaskom postgenomske ere, mete se identificiraju pomoću metoda komparativne i funkcionalne genomike. Na temelju filogenetske analize u ljudskom se genomu identificiraju geni srodni genima čije su funkcije proteinskih produkata već poznate, te se ti geni mogu klonirati za daljnja proučavanja.

Međutim, mete čije su funkcije samo hipotetski određene ne mogu poslužiti kao polazište za daljnja istraživanja. Potrebna je višestupanjska eksperimentalna validacija, kao rezultat koje se može razumjeti specifična biološka funkcija mete u odnosu na fenotipske manifestacije bolesti koja se proučava.

Postoji nekoliko metoda za validaciju eksperimentalnog cilja:

• genomske metode uključuju suzbijanje ciljne sinteze u testnom sustavu dobivanjem genskih knockout mutanata (u kojima je ciljni gen jednostavno odsutan) ili korištenjem RNA antisense sekvenci koje "isključuju" određeni gen;
• mete se mogu inaktivirati korištenjem monoklonskih protutijela ili ozračivanjem kromoforom modificirane mete laserskim zračenjem;
• mete se mogu inaktivirati uporabom inhibitorskih liganda male molekule;
• Također je moguće izravno potvrditi metu utvrđivanjem njezine interakcije s određenim spojem pomoću metode plazmonske rezonancije.

Razina validacije cilja raste s brojem modelnih životinja (posebnih genetskih linija laboratorijskih životinja) kod kojih modifikacija cilja rezultira željenom fenotipskom ekspresijom. Najviša razina validacije je, naravno, dokazivanje da modifikacija mete (npr. blokiranje ili izbacivanje receptora ili inhibicija enzima) rezultira klinički prepoznatljivim i ponovljivim simptomima kod ljudi, ali to je razumljivo rijetko.

Osim toga, pri odabiru mete ne treba zaboraviti na fenomen polimorfizma – odnosno činjenicu da gen može postojati u različitim izoformama u različitim populacijama ili rasama ljudi, što će dovesti do različitih učinaka lijeka na različite pacijenata.

Kada je cilj već pronađen i ispitan na valjanost, započinje izravno istraživanje koje rezultira brojnim strukturama kemijskih spojeva od kojih je samo nekoliko predodređeno da postanu lijekovi.

Proučavanje svih mogućih liganada s kemijskog gledišta ("kemijski prostor") je nemoguće: jednostavna procjena pokazuje da je moguće najmanje 10 40 različitih liganada, dok je od nastanka svemira prošlo samo ~10 17 sekundi. Stoga se nameću brojna ograničenja na moguću strukturu liganada, što značajno sužava kemijski prostor (ostavljajući ga, međutim, potpuno golemim). Konkretno, da bi se suzio kemijski prostor, nameću se uvjeti sličnosti s lijekom ( sličnost drogi), što se u jednostavnom slučaju može izraziti Lipinskijevim pravilom petice, prema kojem spoj, da bi bio “kao” lijek, mora:

• imaju manje od pet donorskih atoma vodikove veze;
• imaju molekulsku masu manju od 500;
• imaju lipofilnost (log P - koeficijent raspodjele tvari na međupovršini voda-oktanol) manju od 5;
• nemaju ukupno više od 10 atoma dušika i kisika (gruba procjena broja akceptora vodikove veze).

Kao početni set liganada testiranih na njihovu sposobnost vezanja na cilj obično se koriste takozvane biblioteke spojeva, koje komercijalno isporučuju tvrtke specijalizirane za to ili se nalaze u arsenalu farmaceutske tvrtke koja razvija novi lijek ili ga je naručio od treće strane. Takve biblioteke sadrže tisuće i milijune spojeva. To je, naravno, potpuno nedovoljno za testiranje svih mogućih opcija, ali to, u pravilu, nije potrebno. Cilj u ovoj fazi istraživanja je identificirati spojeve koji nakon daljnje modifikacije, optimizacije i testiranja mogu dati spoj “kandidat” namijenjen testiranju na životinjama (pretkliničke studije) i na ljudima (kliničke studije).

Ovaj se korak provodi korištenjem probira visoke propusnosti ( in vitro) ili njegovo računalo ( in silico) analiza - spajanje visokih performansi.

Kombinatorna kemija i probir visoke propusnosti

Probir je optimiziran, cjevovodni postupak u kojem se veliki broj kemijskih spojeva (>10 000) testira na afinitet ili aktivnost u odnosu na poseban ispitni sustav (oponaša biološki). Ovisno o izvedbi, postoje različite vrste pregleda:

• niska propusnost (10 000–50 000 uzoraka);
• srednje propusnost (50 000–100 000 uzoraka);
• visoka propusnost (100 000–5 000 000+ uzoraka).

Za skrining kao "industrijski" postupak, učinkovitost, troškovi i vrijeme utrošeno na operaciju vrlo su kritični. Probir se u pravilu provodi na robotskim instalacijama koje mogu raditi 24 sata dnevno i tijekom cijele godine (slika 4).

Slika 4. Oprema koja se koristi za probir visoke propusnosti. A - Robotska pipeta koja automatski taloži uzorke ispitivanih spojeva na ploču sa sustavom za probiranje u automatskom načinu rada visokih performansi. Tipičan broj udubljenja na matrici je u tisućama. Volumen sustava u jednoj jažici je mikrolitara. Volumen unesenog uzorka je nanolitara. B - Instalacija za visokopropusno skeniranje i očitavanje fluorescentnog signala Mark II Scarina. Radi s matricama koje sadrže 2048 udubljenja (NanoCarrier). Potpuno automatski (radi 24 sata dnevno). Produktivnost - više od 100 000 jažica (uzoraka) dnevno.

Princip pregleda je vrlo jednostavan: robot pipetira ispitne tvari (ili mješavinu tvari) u ploče koje sadrže testni sustav (na primjer, imobilizirana meta ili posebno modificirane cijele stanice), slijedeći zadani program. Štoviše, na jednoj ploči može biti na tisuće “jažica” s ispitnim sustavom, a volumen takve jažice može biti vrlo mali, kao i volumen unesenog uzorka (mikro- ili čak nanolitri).

Zatim se očitaju podaci s ploče, pokazujući u kojoj jažici je biološka aktivnost otkrivena, a u kojoj ne. Ovisno o tehnologiji koja se koristi, detektor može očitati radioaktivni signal, fluorescenciju (ako je sustav izgrađen pomoću fluorescentnih proteina), bioluminiscenciju (ako se koristi sustav luciferin-luciferaza ili njegovi analozi), polarizaciju zračenja i mnoge druge parametre.

Obično probir smanjuje broj testiranih spojeva za 3-4 reda veličine. Spojevi za koje je proces pretraživanja otkrio aktivnost iznad zadane vrijednosti nazivaju se prototipovima. No, treba shvatiti da je takav “uspjeh” još jako, jako daleko od konačnog lijeka. Samo oni koji zadrže svoju aktivnost u modelnim sustavima i zadovolje niz kriterija daju prekursore lijekova koji se koriste za daljnja istraživanja.

Kao što je već spomenuto, čak ni biblioteke koje sadrže više od milijun spojeva ne mogu prikazati cijeli mogući kemijski prostor liganada. Stoga se pri provođenju probira mogu odabrati dvije različite strategije: diverzificirani probir i fokusirani probir. Razlika između njih leži u sastavu korištenih biblioteka spojeva: u diverzifikacijskoj verziji koriste se ligandi koji su što je moguće različitiji kako bi se pokrilo što veće područje kemijskog prostora; u fokusiranoj verziji, na naprotiv, koriste biblioteke srodnih spojeva dobivenih metodama kombinatorne kemije, što omogućuje, poznavajući približnu strukturu liganda, odabir njegove optimalnije varijante. Zdrav razum nalaže da se u velikom projektu stvaranja novog lijeka oba ova pristupa trebaju koristiti uzastopno - prvo diverzifikacija, kako bi se identificirale najrazličitije klase uspješnih spojeva, a zatim fokusirani, s ciljem optimizacije struktura ovih spojeva i dobivanje radnih prototipova.

Ako je takozvani biološki prostor poznat za metu, odnosno bilo koje karakteristike liganada (veličina, hidrofobnost, itd.) koji se na nju mogu vezati, tada se pri sastavljanju biblioteke ispitnih spojeva, ligandi koji spadaju u “ sjecište” biološkog i kemijskog odabrani su prostori, jer to očito povećava učinkovitost postupka.

Strukture prototipa dobivene probirom dalje su podvrgnute raznim optimizacijama koje se provode u modernim istraživanjima, obično u bliskoj suradnji između različitih skupina istraživača: molekularnih biologa, farmakologa, modelara i medicinskih kemičara (slika 5).

Slika 5. Farmakološki ciklus. Skupina za molekularnu biologiju odgovorna je za dobivanje meta mutanata, skupina za farmakologiju odgovorna je za mjerenje podataka o aktivnosti i afinitetu sintetiziranih liganada na metama divljeg tipa i mutanata, skupina za modeliranje je za izradu modela meta, predviđanje njihovih mutacija i predviđanje strukture liganda, skupina medicinske kemije je za sintezu liganda.

Sa svakim okretom ovog "farmakološkog ciklusa", prototip se približava svom prethodniku, a potom i kandidatu koji je već testiran izravno na životinjama (pretklinička ispitivanja) i na ljudima tijekom kliničkih ispitivanja.

Stoga je uloga probira značajno smanjiti (za nekoliko redova veličine) uzorak prototipova (slika 6).

Slika 6. Uloga visokoučinkovitog probira u razvoju novih lijekova. Probir, bilo da je laboratorijski ( in vitro) ili računalo ( in silico) opcija je glavni i resursno najintenzivniji postupak za odabir početnih struktura lijekova (prototipova) iz biblioteka dostupnih spojeva. Rezultat probira često je polazna točka za daljnji proces razvoja lijeka.

Klinička istraživanja

Medicina je područje u kojem nikada ne treba žuriti. Pogotovo kada je u pitanju razvoj novih lijekova. Dovoljno je prisjetiti se priče o lijeku Thalidamid, razvijenom kasnih 50-ih u Njemačkoj, čija je uporaba kod trudnica dovela do rađanja djece s urođenim defektima udova, čak i njihovom potpunom odsutnošću. Ova nuspojava nije otkrivena na vrijeme tijekom kliničkih ispitivanja zbog nedovoljnog testiranja.

Stoga je trenutno postupak testiranja lijekova prilično složen, skup i zahtijeva značajno vrijeme (2-7 godina ispitivanja u klinici i od 100 milijuna dolara po spoju kandidatu, cm. riža. 7).

Slika 7. Proces razvoja novog lijeka traje od 5 do 16 godina. Trošak kliničkog testiranja jednog spoja kandidata iznosi više od 100 milijuna USD. Ukupni troškovi razvoja, uključujući i lijekove koji ne stignu na tržište, često premašuju milijardu dolara.

Prije svega, već prije ulaska u kliniku, lijekovi se testiraju na toksičnost i kancerogenost, a potrebno je provesti i studije uz sustave in vitro, na najmanje dvije vrste laboratorijskih životinja. Otrovni lijekovi, naravno, ne ulaze u kliniku, osim u slučajevima kada su namijenjeni za liječenje posebno teških bolesti i još nemaju manje toksične analoge.

Osim toga, lijekovi se podvrgavaju farmakokinetičkim studijama, odnosno ispituju se fiziološka i biokemijska svojstva kao što su apsorpcija, distribucija, metabolizam i izlučivanje (na engleskom označeno kraticom ADME - Apsorpcija, distribucija, metabolizam i ekstrakcija). Bioraspoloživost je, primjerice, podkarakteristika unošenja lijeka u tijelo, koja karakterizira stupanj do kojeg lijek gubi biološka svojstva kada se unese u tijelo. Dakle, inzulin koji se uzima oralno (na usta) ima nisku bioraspoloživost, budući da ga, budući da je protein, razgrađuju želučani enzimi. Stoga se inzulin primjenjuje supkutano ili intramuskularno. Iz istog razloga često se razvijaju lijekovi koji djeluju slično svojim prirodnim prototipovima, ali nisu proteinske prirode.

Pravno gledano, proces kliničkih ispitivanja novih lijekova ima mnogo nijansi, budući da zahtijevaju veliku količinu popratne dokumentacije (ukupno nekoliko tisuća stranica), dozvole, potvrde itd. Osim toga, mnogi se formalni postupci uvelike razlikuju od zemlje do zemlje zbog različitog zakonodavstva. Stoga za rješavanje ovih brojnih problema postoje posebne tvrtke koje prihvaćaju narudžbe velikih farmaceutskih tvrtki za provođenje kliničkih ispitivanja i preusmjeravaju ih na određene klinike, prateći cijeli proces kompletnom dokumentacijom i pazeći da se ne prekrše nikakve formalnosti.

Uloga računalne tehnologije u dizajnu draga

Trenutno, u dizajnu otpora, kao iu većini drugih znanstveno intenzivnih područja, uloga računalne tehnologije nastavlja rasti. Treba odmah napomenuti da trenutna razina razvoja računalne tehnike ne dopušta razvoj novog lijeka koristeći samo računala. Glavne prednosti koje računalne metode daju u ovom slučaju su smanjenje vremena potrebnog za izlazak novog lijeka na tržište i smanjenje troškova razvoja.

Glavne računalne metode koje se koriste u dizajnu povlačenja su:

• molekularno modeliranje (MM);
• virtualni pregled;
• dizajn novih lijekova de novo;
• procjena svojstava "sličnosti lijeku";
• modeliranje vezanja ligand-cilja.

MM metode temeljene na strukturi liganda

Ako se ništa ne zna o trodimenzionalnoj strukturi mete (što se često događa), pribjegavaju se metodama stvaranja novih spojeva na temelju podataka o strukturi već poznatih liganada i podataka o njihovoj aktivnosti.

Pristup se temelji na općeprihvaćenoj paradigmi u kemiji i biologiji da struktura određuje svojstva. Na temelju analize korelacija između strukture poznatih spojeva i njihovih svojstava moguće je predvidjeti strukturu novog spoja koji ima željena svojstva (ili, obrnuto, predvidjeti svojstva za poznatu strukturu). Štoviše, ovaj se pristup koristi i kada se modificiraju poznate strukture kako bi se poboljšala njihova svojstva i kada se traže novi spojevi korištenjem knjižnica pregleda spojeva.

Metode za određivanje sličnosti molekula (ili metode otisaka prstiju) sastoje se od diskretnog uzimanja u obzir određenih svojstava molekule, nazvanih deskriptori (na primjer, broj donora vodikove veze, broj benzenskih prstenova, prisutnost određenog supstituenta u određeni položaj itd.) i usporedbom dobivenog „otiska prsta“ s otiskom molekule s poznatim svojstvima (koristi se kao uzorak). Stupanj sličnosti izražava se Tanimoto koeficijentom, koji varira u rasponu 0–1. Velika sličnost podrazumijeva slična svojstva molekula koje se uspoređuju i obrnuto.

Metode temeljene na poznatim koordinatama atoma liganda nazivaju se kvantitativne metode odnosa strukture i aktivnosti ( QSAR, Kvantitativni odnos strukture i aktivnosti). Jedna od najčešće korištenih metoda ove skupine je metoda komparativne analize molekularnih polja ( CoMFA, Usporedna analiza molekularnog polja). Ova se metoda sastoji od aproksimacije trodimenzionalne strukture liganda sa skupom molekularnih polja koja zasebno karakteriziraju njegova sterička, elektrostatska, donor-akceptorska i druga svojstva. CoMFA model izgrađen je na temelju višestruke regresijske analize liganada s poznatom aktivnošću i opisuje ligand koji bi se trebao dobro vezati na metu od interesa u smislu molekularnih polja. Rezultirajući skup polja govori na kojem bi mjestu ligand trebao imati glomazni supstituent, a na kojem bi trebao imati mali, na kojem bi trebao biti polaran, a na kojem ne bi trebao biti, na kojem bi trebao biti donor vodikove veze i u kojem bi trebao biti akceptor itd.

Model se može koristiti u zadacima virtualnog pregledavanja biblioteka spojeva, djelujući u ovom slučaju kao analog farmakofora. Glavni nedostatak ove metode je da ima veliku prediktivnu moć samo za bliske klase spojeva; kada pokušavate predvidjeti aktivnost spoja kemijske prirode osim liganada korištenih za izradu modela, rezultat možda neće biti dovoljno pouzdan.

Dijagram mogućeg procesa stvaranja novog lijeka na temelju strukture liganda prikazan je na slici 8.

Slika 8. Primjer molekularnog modeliranja na temelju strukture liganda. Za ciklički peptid urotenzin II ( Dolje lijevo) trodimenzionalna struktura određena je NMR spektroskopijom vodene otopine ( gore lijevo). Prostorni raspored aminokiselinskih ostataka motiva TRP-LYS-TYR, koji je važan za biološku funkciju, korišten je za konstruiranje modela farmakofora ( Gore desno). Kao rezultat virtualnog pregleda, pronađen je novi spoj koji pokazuje biološku aktivnost ( dolje desno).

Očito je da se pouzdanost simulacije, kao i učinkovitost cjelokupnog procesa dizajniranja novog lijeka, može znatno povećati ako se uzmu u obzir podaci ne samo o strukturi liganada, već i o strukturi ciljni protein. Metode koje uzimaju u obzir ove podatke zajedno se nazivaju "drag dizajn temeljen na strukturnim informacijama" ( SBDD, Dizajn lijekova na temelju strukture).

MM metode temeljene na strukturi proteina

Zbog rastućeg potencijala strukturne biologije, sve je više moguće odrediti eksperimentalnu trodimenzionalnu strukturu mete ili konstruirati njen molekularni model na temelju homologije s proteinom čija je trodimenzionalna struktura već određena.

Najčešće korištene metode za određivanje trodimenzionalne strukture biomakromolekula s visokom rezolucijom (Često, kada eksperimentalna struktura cilja još uvijek nije dostupna, pribjegava se modeliranju temeljenom na homologiji - metodi za koju je model koji konstruira pokazalo se da je dovoljno visoke kvalitete ako homologija između strukturnog predloška i modeliranog proteina nije niža od 40%.

Modeliranje homologije posebno se često koristi u razvoju lijekova usmjerenih na G-protein spregnute receptore, jer se oni, kao membranski proteini, vrlo teško kristaliziraju, a tako veliki proteini još nisu dostupni NMR metodi. Za ovu obitelj receptora poznata je struktura samo jednog proteina - goveđeg rodopsina, dobivenog 2000. godine na Stanfordu, koji se koristi kao strukturni obrazac u velikoj većini studija.

Tipično, studije temeljene na strukturnim podacima također uzimaju u obzir podatke o mutagenezi na meti kako bi se odredilo koji su aminokiselinski ostaci najvažniji za funkciju proteina i vezanje liganda. Ova informacija posebno je vrijedna kod optimizacije konstruiranog modela, koji, budući da je samo derivat strukture proteina predloška, ​​ne može uzeti u obzir sve biološke specifičnosti modeliranog objekta.

Trodimenzionalna struktura mete, osim što može objasniti molekularni mehanizam interakcije liganda s proteinom, koristi se u zadacima molekularnog pristajanja, odnosno računalnog modeliranja interakcije liganda s proteinom. Docking kao polaznu informaciju koristi trodimenzionalnu strukturu proteina (u ovoj fazi razvoja tehnologije, u pravilu, konformacijski nepokretan), i strukturu liganda, čija se konformacijska pokretljivost i odnos s receptorom modeliraju tijekom proces pristajanja. Rezultat pristajanja je konformacija liganda koja najbolje stupa u interakciju s mjestom vezanja proteina, u smislu bodovne funkcije pristajanja, koja aproksimira slobodnu energiju vezanja liganda. U stvarnosti, zbog mnogih aproksimacija, funkcija procjene nije uvijek u korelaciji s odgovarajućom eksperimentalnom energijom vezanja.

Docking vam omogućuje smanjenje troškova i vremena izvođenjem postupka sličnog visokopropusnom pregledu na računalnim sustavima. Taj se postupak zove virtualni screening, a glavna mu je prednost što za prave farmakološke testove nije potrebno nabaviti cijelu biblioteku koja se sastoji od milijun spojeva, već samo “virtualne prototipove”. Obično se, kako bi se izbjegle pogreške, screening i docking koriste istovremeno, nadopunjujući jedno drugo (slika 9).

Slika 9. Dvije opcije za kombiniranje probira visoke propusnosti i molekularnog modeliranja. Iznad: sekvencijalni iterativni pregled. Svaki korak postupka koristi relativno mali skup liganada; Na temelju rezultata skrininga izrađuje se model koji objašnjava odnos strukture i aktivnosti. Model se koristi za odabir sljedećeg skupa liganada za testiranje. Dno:“jednokratnog” pregleda. U svakom koraku, model se gradi korištenjem skupa za vježbanje i koristi za izradu predviđanja na skupu za testiranje.

S povećanjem snage računala i dolaskom ispravnijih i fizičkih algoritama, docking će bolje procijeniti energiju vezanja proteina s ligandom te će početi uzimati u obzir pokretljivost proteinskih lanaca i utjecaj otapala. Međutim, ne zna se hoće li virtualni pregled ikada moći potpuno zamijeniti pravi biokemijski eksperiment; ako je tako, onda to očito zahtijeva kvalitativno novu razinu algoritama koji trenutno nisu u stanju apsolutno ispravno opisati interakciju liganda s proteinom.

Jedan od fenomena koji ilustrira nesavršenost algoritama za spajanje je paradoks sličnosti. Ovaj paradoks leži u činjenici da spojevi koji su strukturno vrlo malo različiti mogu imati dramatično različite aktivnosti, au isto vrijeme, sa stajališta algoritama za spajanje, biti praktički nerazlučivi.

Prototipovi lijekova mogu se dobiti ne samo odabirom iz već pripremljene baze podataka spojeva. Ako postoji struktura mete (ili barem trodimenzionalni model farmakofora), moguće je konstruirati ligande de novo korištenjem općih principa međumolekularne interakcije. U ovom pristupu, jedan ili više osnovnih molekularnih fragmenata postavlja se na mjesto vezanja liganda, a ligand se sekvencijalno "povećava" na mjestu vezivanja, podvrgavajući se optimizaciji u svakom koraku algoritma. Rezultirajuće strukture, baš kao i tijekom spajanja, procjenjuju se pomoću empirijskih bodovnih funkcija.

Ograničenja uporabe računalnih metoda

Unatoč svim obećanjima, računalne metode imaju niz ograničenja koja se moraju uzeti u obzir kako bi se ispravno zamislile mogućnosti ovih metoda.

Prije svega iako ideologija in silico uključuje provođenje cjelovitih računalnih eksperimenata, odnosno eksperimenata čiji su rezultati sami po sebi vrijedni i pouzdani, a potrebna je obvezna eksperimentalna provjera dobivenih rezultata. Odnosno, podrazumijeva blisku suradnju znanstvenih skupina koje provode računalni eksperiment s drugim eksperimentalnim skupinama (slika 5).

Osim toga, računalne metode još nisu u stanju uzeti u obzir cjelokupnu raznolikost djelovanja lijeka na ljudski organizam, pa se ovim metodama ne mogu eliminirati, pa čak ni značajno reducirati klinička testiranja koja oduzimaju najveći dio vremena u razvoju. novog lijeka.

Stoga se danas uloga računalnih metoda u dizajnu draga svodi na ubrzavanje i smanjenje troškova istraživanja koja prethode kliničkim ispitivanjima.

Perspektiva drag dizajna

Slika 1. Vrste molekularnih meta za djelovanje lijeka.

Molekularni cilj je molekula ili molekularni sklop koji ima specifično vezno mjesto za biološki aktivan spoj. Molekularni cilj mogu predstavljati membranski proteini koji prepoznaju hormone ili neurotransmitere (receptore), kao i ionske kanale, nukleinske kiseline, molekule nosače ili enzime. Kao što se može vidjeti na slici 2, ne djeluju svi spojevi lijekova na receptore. Većina lijekova mora se vezati na molekularnu metu da bi proizveli učinak, ali postoje iznimke. Već u prvim istraživanjima djelovanja lijekova na životinjska tkiva krajem 19.st. Postalo je jasno da većina PAS ima specifičan učinak u određenim tkivima, tj. spoj koji djeluje na jednu vrstu tkiva ne mora djelovati na drugu; ista tvar može imati potpuno različite učinke na različita tkiva. Na primjer, alkaloid pilokarpin, poput neurotransmitera acetilkolina, uzrokuje kontrakciju glatkih mišića crijeva i inhibira otkucaje srca. S obzirom na te fenomene, Samuel Langley (1852.-1925.) 1878. godine, na temelju proučavanja učinaka alkaloida pilokarpina i atropina na salivaciju, predložio je da "postoje određene receptorske tvari... s kojima oboje mogu tvoriti spojeve." Kasnije, 1905., dok je proučavao učinke nikotina i kurarea na skeletne mišiće, otkrio je da nikotin uzrokuje kontrakcije kada se primijeni na određena mala područja mišića. Langley je zaključio da se "receptorska tvar" za nikotin nalazi na tim mjestima i da kurare djeluje tako da blokira interakciju nikotina s receptorom.

Slika 2. Učinkovitost u odnosu na endogeni agonist.

Stoga je očito da učinak nekih spojeva može biti posljedica ne toliko razvoja biološkog odgovora na vezanje na molekularnu metu, već radije prepreke vezanju endogenog liganda. Doista, ako uzmemo u obzir interakciju liganda i receptora, može se primijetiti da trenutno postojeći spojevi lijekova mogu igrati ulogu i agonista i antagonista. Na slici 3 možete vidjeti detaljniju klasifikaciju liganada u odnosu na učinke koje uzrokuju. Agonisti se razlikuju po snazi ​​i smjeru fiziološkog odgovora koji proizvode. Ova klasifikacija nije povezana s afinitetom liganada i temelji se samo na veličini odgovora receptora. Stoga se mogu razlikovati sljedeće klase agonista:

o Superagonist - spoj sposoban izazvati jači fiziološki odgovor od endogenog agonista.

o Puni agonist—spoj koji proizvodi isti odgovor kao endogeni agonist (npr. izoprenalin, β-adrenergički agonist).

o Ako je odgovor manji, spoj se naziva djelomični agonist (na primjer, aripiprazol je djelomični agonist dopaminskih i serotoninskih receptora).

o Ako receptor ima bazalnu (konstitutivnu) aktivnost, neke tvari – inverzni agonisti – mogu je smanjiti. Konkretno, inverzni agonisti GABA A receptora imaju anksiogene ili spazmogene učinke, ali mogu poboljšati kognitivne sposobnosti.

Razmatrajući mehanizam vezanja između liganda i receptorske molekule, može se vidjeti da je specifičnost i snaga vezanja određena strukturnim značajkama obje komponente. Konkretno, važnu ulogu ima aktivno središte proteina - određeno područje proteinske molekule, obično smješteno u njegovom udubljenju ("džep"), formirano od radikala aminokiselina okupljenih u određenom prostornom području tijekom formiranja tercijarnu strukturu i sposoban se komplementarno vezati na ligand. U linearnom slijedu polipeptidnog lanca, radikali koji tvore aktivno središte mogu se nalaziti na znatnoj udaljenosti jedni od drugih.

Visoka specifičnost vezanja proteina na ligand osigurana je komplementarnošću strukture aktivnog centra proteina sa strukturom liganda. Komplementarnost se odnosi na prostornu i kemijsku podudarnost molekula u interakciji. Ligand mora imati sposobnost ulaska i prostornog podudaranja s konformacijom aktivnog mjesta. Ova podudarnost možda nije potpuna, ali zbog konformacijske labilnosti proteina, aktivni centar je sposoban za male promjene i "prilagođen" je ligandu. Osim toga, između funkcionalnih skupina liganda i aminokiselinskih radikala koji tvore aktivno središte, moraju nastati veze koje drže ligand u aktivnom središtu. Veze između liganda i aktivnog centra proteina mogu biti ili nekovalentne (ionske, vodikove, hidrofobne) ili kovalentne. Aktivno središte proteina je regija relativno izolirana od okoline koja okružuje protein, formirana od aminokiselinskih ostataka. U tom području svaki ostatak, zbog svoje pojedinačne veličine i funkcionalnih skupina, čini “reljef” aktivnog središta.

Kombinacija takvih aminokiselina u jedan funkcionalni kompleks mijenja reaktivnost njihovih radikala, baš kao što se mijenja zvuk glazbenog instrumenta u ansamblu. Stoga se aminokiselinski ostaci koji čine aktivni centar često nazivaju "ansambl" aminokiselina.

Jedinstvena svojstva aktivnog centra ne ovise samo o kemijskim svojstvima aminokiselina koje ga tvore, već i o njihovoj preciznoj relativnoj orijentaciji u prostoru. Stoga čak i manji poremećaji u ukupnoj konformaciji proteina kao rezultat točkastih promjena u njegovoj primarnoj strukturi ili uvjetima okoliša mogu dovesti do promjena u kemijskim i funkcionalnim svojstvima radikala koji tvore aktivno središte, poremetiti vezanje proteina na ligand i njegovu funkciju. Tijekom denaturacije aktivno središte proteina se uništava i gubi se njihova biološka aktivnost.

Često je aktivni centar formiran na takav način da je pristup vode funkcionalnim skupinama njegovih radikala ograničen, tj. stvaraju se uvjeti za vezanje liganda na radikale aminokiselina.

U nekim slučajevima, ligand se veže samo za jedan od atoma koji ima određenu reaktivnost, na primjer, dodatak O 2 željezu mioglobina ili hemoglobina. Međutim, svojstva danog atoma za selektivnu interakciju s O2 određena su svojstvima radikala koji okružuju atom željeza u sastavu. Hem se također nalazi u drugim proteinima, poput citokroma. Međutim, funkcija atoma željeza u citokromima je drugačija; on služi kao posrednik za prijenos elektrona s jedne tvari na drugu, dok željezo postaje ili dvovalentno ili trovalentno.

Vezno mjesto protein-ligand često se nalazi između domena. Na primjer, proteolitički enzim tripsin, koji je uključen u hidrolizu peptidnih veza proteina hrane u crijevima, ima 2 domene odvojene utorom. Unutarnju površinu žlijeba čine radikali aminokiselina ovih domena, smješteni daleko jedan od drugoga u polipeptidnom lancu (Ser 177, His 40, Asp 85).

Različite domene u proteinu mogu se pomicati jedna u odnosu na drugu u interakciji s ligandom, što olakšava daljnje funkcioniranje proteina. Kao primjer možemo uzeti u obzir rad heksokinaze, enzima koji katalizira prijenos fosfornog ostatka s ATP-a na molekulu glukoze (tijekom njezine fosforilacije). Aktivno mjesto heksokinaze nalazi se u pukotini između dviju domena. Kada se heksokinaza veže za glukozu, domene koje je okružuju se približavaju, a supstrat postaje "zarobljen", što olakšava njegovu daljnju fosforilaciju.

Glavno svojstvo proteina koje je u osnovi njihove funkcije je selektivnost vezanja specifičnih liganada na određene dijelove proteinske molekule.

Klasifikacija liganada

· Ligandi mogu biti anorganske (često ioni metala) i organske tvari, niskomolekularne i visokomolekularne tvari;

· postoje ligandi koji mijenjaju svoju kemijsku strukturu kada se vežu za aktivno središte proteina (promjene supstrata u aktivnom središtu enzima);

· postoje ligandi koji se vežu za protein samo u trenutku funkcioniranja (npr. O 2 transportiran hemoglobinom), te ligandi koji su stalno povezani s proteinom i igraju pomoćnu ulogu u funkcioniranju proteina (npr. željezo , koji je dio hemoglobina).

U slučajevima kada aminokiselinski ostaci koji tvore aktivno središte ne mogu osigurati funkcioniranje određenog proteina, neproteinske molekule mogu se pričvrstiti na određena područja aktivnog središta. Dakle, aktivno središte mnogih enzima sadrži metalni ion (kofaktor) ili organsku neproteinsku molekulu (koenzim). Neproteinski dio, čvrsto povezan s aktivnim središtem proteina i neophodan za njegovo funkcioniranje, naziva se "skupina prostate". Mioglobin, hemoglobin i citokromi imaju protetičku skupinu u aktivnom centru - hem, koja sadrži željezo.

Povezivanje protomera u oligomernom proteinu primjer je interakcije liganada velike molekulske mase. Svaki protomer, povezan s drugim protomerima, služi im kao ligand, kao i oni njemu.

Ponekad vezanje liganda mijenja konformaciju proteina, što rezultira stvaranjem veznog mjesta s drugim ligandima. Na primjer, protein kalmodulin, nakon što se veže na četiri iona Ca 2+ u određenim područjima, stječe sposobnost interakcije s određenim enzimima, mijenjajući njihovu aktivnost.

Važan koncept u teoriji interakcije između liganda i aktivnog mjesta biološke mete je "komplementarnost". Aktivno mjesto enzima mora na određeni način odgovarati ligandu, što se odražava u određenim zahtjevima za supstrat.

Slika 3. Shema interakcije između liganda i molekularne mete.

Na primjer, očekuje se da se za uspješnu interakciju veličina aktivnog centra i liganda mora podudarati (vidi poziciju 2 na slici 3), što omogućuje povećanje specifičnosti interakcije i zaštitu aktivnog centra od očito neprikladnih supstrata. . U isto vrijeme, kada se pojavi kompleks "aktivni centar-ligand", moguće su sljedeće vrste interakcija:

· van der Waalsove veze (pozicija 1, slika 3), uzrokovane fluktuacijama elektronskih oblaka oko suprotno polariziranih susjednih atoma;

· elektrostatske interakcije (pozicija 3, slika 3) koje nastaju između suprotno nabijenih skupina;

· hidrofobne interakcije (pozicija 4, slika 3), uzrokovane međusobnim privlačenjem nepolarnih površina;

· vodikove veze (položaj 5, slika 3) koje nastaju između mobilnog atoma vodika i elektronegativnih atoma fluora, dušika ili kisika.

Unatoč relativno niskoj snazi ​​opisanih interakcija (u usporedbi s kovalentnim vezama), ne treba podcjenjivati ​​njihovu važnost koja se ogleda u povećanju afiniteta vezanja.

Rezimirajući gore navedeno, može se primijetiti da je proces vezanja liganda i molekularne mete vrlo specifičan proces kontroliran i veličinom liganda i njegovom strukturom, što omogućuje selektivnost interakcije. Međutim, moguća je interakcija između proteina i supstrata koja mu nije svojstvena (tzv. kompetitivna inhibicija), koja se izražava u vezivanju s aktivnog mjesta na sličan, ali ne ciljni ligand. Važno je napomenuti da je kompetitivna inhibicija moguća kako u prirodnim uvjetima (inhibicija enzima sukcinat dehidrogenaze malonatom, inhibicija fumarat hidrataze piromelitnom kiselinom) tako i umjetno, tijekom uzimanja lijekova (inhibicija monoaminooksidaze iproniazidom, nialamidom, inhibicija dihidropteroata sintetaza sulfonamidima - strukturni analozi para-aminobenzojeve kiseline, inhibicija angiotenzin-konvertirajućeg enzima kaptoprilom, enalaprilom).

Stoga je moguće namjerno promijeniti aktivnost mnogih molekularnih sustava pomoću sintetskih spojeva sa strukturom sličnom prirodnim supstratima.

Međutim, površno razumijevanje mehanizama interakcije između liganada i molekularnih meta može biti iznimno opasno i često dovesti do tragičnih posljedica. Najpoznatijim slučajem može se smatrati tzv. “Tragedija talidomida”, koja je rezultirala rađanjem tisuća djece s urođenim deformitetima zbog upotrebe nedovoljno proučenog ljekovitog spoja talidomida od strane trudnica.

Uvod

Farmakološko djelovanje u potpunosti je određeno strukturom ljekovite tvari. Pritom kemijska struktura podrazumijeva ne samo poznati redoslijed atoma u molekuli, već i njihov specifičan prostorni raspored. Razvoj farmakološkog učinka često je posljedica konformacijskih promjena uzrokovanih utjecajem molekule lijeka na molekularnu metu. Aktivaciju ili inhibiciju funkcija receptora, transmembranskih kanala i enzima kontroliraju ligandi – specifični spojevi koji imaju određeni afinitet prema odgovarajućim biološkim strukturama. Očito je da je intenzitet farmakološkog učinka posljedica komplementarnosti interakcije, čija potpunost podrazumijeva ne samo potreban raspored radikala, već i oblik molekule, što se objašnjava potrebom prodiranja aktivnog centar molekularne mete.

Oblik molekule, položaj nabijenih i nepolarnih radikala određuje prodiranje kroz stanične membrane, BBB i GMB, snagu i trajanje djelovanja, kao i brzinu eliminacije iz sistemskog krvotoka.

Uzimajući u obzir važnost prostorne strukture za farmaceutsku kemiju, može se primijetiti da pravilno ciljanje strukture spoja lijeka može poboljšati njegov terapeutski profil produljenjem trajanja djelovanja ili neutraliziranjem nuspojava. Uvođenjem hidrofobnih fragmenata u molekulu, primjerice linearnih alkilnih “sidra”, može se povećati afinitet spoja za membrane i sposobnost spoja da prodre u stanicu, što je pokazano na primjeru tzv. "Sukačevljevi ioni".

Uvođenje "sidra" također može pomoći u produljenju djelovanja spoja lijeka, što je osigurano povećanim taloženjem u masnom tkivu i smanjenim metabolizmom u jetri i bubrezima. Azatioprin je predlijek za 6-merkaptopurin, nespecifični citostatik. U tijelu se azatioprin sporo metabolizira u 6-merkaptopurin, što u konačnici dovodi do produljenog djelovanja.

Modifikacija molekule također se može koristiti za ispravljanje organoleptičkih karakteristika, na primjer, kloramfenikol stearat, koji se hidrolizira u probavnom traktu u kloramfenikol, nema gorak okus, što omogućuje održavanje izvorne farmakološke aktivnosti uz poboljšanje karakteristike okusa.

Mnogi lijekovi koji se trenutno koriste na tržištu prošli su dug put od inicijalnog koncepta do konačne implementacije, pri čemu je cilj bio povećati ciljnu aktivnost i smanjiti učestalost i težinu nuspojava, povećati stabilnost i trajanje djelovanja. Prostorna struktura u potpunosti određuje sudbinu lijeka u tijelu - mogućnost vezanja na molekularne mete, sposobnost "izbjegavanja" neželjenih biotransformacija i, naprotiv, sudjelovanje u potrebnim transformacijama.

1. Molekularni ciljevi biološki aktivnih tvari u tijelu

Slika 1. Vrste molekularnih meta za djelovanje lijeka.

Molekularni cilj je molekula ili molekularni sklop koji ima specifično vezno mjesto za biološki aktivan spoj. Molekularni cilj mogu predstavljati membranski proteini koji prepoznaju hormone ili neurotransmitere (receptore), kao i ionske kanale, nukleinske kiseline, molekule nosače ili enzime. Kao što se može vidjeti na slici 2, ne djeluju svi spojevi lijekova na receptore. Većina lijekova mora se vezati na molekularnu metu da bi proizveli učinak, ali postoje iznimke. Već u prvim istraživanjima djelovanja lijekova na životinjska tkiva krajem 19.st. Postalo je jasno da većina PAS ima specifičan učinak u određenim tkivima, tj. spoj koji djeluje na jednu vrstu tkiva ne mora djelovati na drugu; ista tvar može imati potpuno različite učinke na različita tkiva. Na primjer, alkaloid pilokarpin, poput neurotransmitera acetilkolina, uzrokuje kontrakciju glatkih mišića crijeva i inhibira otkucaje srca. S obzirom na te fenomene, Samuel Langley (1852.-1925.) 1878. godine, na temelju proučavanja učinaka alkaloida pilokarpina i atropina na salivaciju, predložio je da "postoje određene receptorske tvari... s kojima oboje mogu tvoriti spojeve." Kasnije, 1905., dok je proučavao učinke nikotina i kurarea na skeletne mišiće, otkrio je da nikotin uzrokuje kontrakcije kada se primijeni na određena mala područja mišića. Langley je zaključio da se "receptorska tvar" za nikotin nalazi na tim mjestima i da kurare djeluje tako da blokira interakciju nikotina s receptorom.

Slika 2. Učinkovitost u odnosu na endogeni agonist.

Stoga je očito da učinak nekih spojeva može biti posljedica ne toliko razvoja biološkog odgovora na vezanje na molekularnu metu, već radije prepreke vezanju endogenog liganda. Doista, ako uzmemo u obzir interakciju liganda i receptora, može se primijetiti da trenutno postojeći spojevi lijekova mogu igrati ulogu i agonista i antagonista. Na slici 3 možete vidjeti detaljniju klasifikaciju liganada u odnosu na učinke koje uzrokuju. Agonisti se razlikuju po snazi ​​i smjeru fiziološkog odgovora koji proizvode. Ova klasifikacija nije povezana s afinitetom liganada i temelji se samo na veličini odgovora receptora. Stoga se mogu razlikovati sljedeće klase agonista:

o Superagonist - spoj sposoban izazvati jači fiziološki odgovor od endogenog agonista.

o Puni agonist—spoj koji proizvodi isti odgovor kao endogeni agonist (npr. izoprenalin, β-adrenergički agonist).

o Ako je odgovor manji, spoj se naziva djelomični agonist (na primjer, aripiprazol je djelomični agonist dopaminskih i serotoninskih receptora).

o Ako receptor ima bazalnu (konstitutivnu) aktivnost, neke tvari – inverzni agonisti – mogu je smanjiti. Konkretno, inverzni agonisti GABA A receptora imaju anksiogene ili spazmogene učinke, ali mogu poboljšati kognitivne sposobnosti.

Razmatrajući mehanizam vezanja između liganda i receptorske molekule, može se vidjeti da je specifičnost i snaga vezanja određena strukturnim značajkama obje komponente. Konkretno, važnu ulogu ima aktivno središte proteina - određeno područje proteinske molekule, obično smješteno u njegovom udubljenju ("džep"), formirano od radikala aminokiselina okupljenih u određenom prostornom području tijekom formiranja tercijarnu strukturu i sposoban se komplementarno vezati na ligand. U linearnom slijedu polipeptidnog lanca, radikali koji tvore aktivno središte mogu se nalaziti na znatnoj udaljenosti jedni od drugih.

Visoka specifičnost vezanja proteina na ligand osigurana je komplementarnošću strukture aktivnog centra proteina sa strukturom liganda. Komplementarnost se odnosi na prostornu i kemijsku podudarnost molekula u interakciji. Ligand mora imati sposobnost ulaska i prostornog podudaranja s konformacijom aktivnog mjesta. Ova podudarnost možda nije potpuna, ali zbog konformacijske labilnosti proteina, aktivni centar je sposoban za male promjene i "prilagođen" je ligandu. Osim toga, između funkcionalnih skupina liganda i aminokiselinskih radikala koji tvore aktivno središte, moraju nastati veze koje drže ligand u aktivnom središtu. Veze između liganda i aktivnog centra proteina mogu biti ili nekovalentne (ionske, vodikove, hidrofobne) ili kovalentne. Aktivno središte proteina je regija relativno izolirana od okoline koja okružuje protein, formirana od aminokiselinskih ostataka. U tom području svaki ostatak, zbog svoje pojedinačne veličine i funkcionalnih skupina, čini “reljef” aktivnog središta.

Kombinacija takvih aminokiselina u jedan funkcionalni kompleks mijenja reaktivnost njihovih radikala, baš kao što se mijenja zvuk glazbenog instrumenta u ansamblu. Stoga se aminokiselinski ostaci koji čine aktivni centar često nazivaju "ansambl" aminokiselina.

Jedinstvena svojstva aktivnog centra ne ovise samo o kemijskim svojstvima aminokiselina koje ga tvore, već i o njihovoj preciznoj relativnoj orijentaciji u prostoru. Stoga čak i manji poremećaji u ukupnoj konformaciji proteina kao rezultat točkastih promjena u njegovoj primarnoj strukturi ili uvjetima okoliša mogu dovesti do promjena u kemijskim i funkcionalnim svojstvima radikala koji tvore aktivno središte, poremetiti vezanje proteina na ligand i njegovu funkciju. Tijekom denaturacije aktivno središte proteina se uništava i gubi se njihova biološka aktivnost.

Često je aktivni centar formiran na takav način da je pristup vode funkcionalnim skupinama njegovih radikala ograničen, tj. stvaraju se uvjeti za vezanje liganda na radikale aminokiselina.

U nekim slučajevima, ligand se veže samo za jedan od atoma koji ima određenu reaktivnost, na primjer, dodatak O 2 željezu mioglobina ili hemoglobina. Međutim, svojstva danog atoma za selektivnu interakciju s O2 određena su svojstvima radikala koji okružuju atom željeza u sastavu. Hem se također nalazi u drugim proteinima, poput citokroma. Međutim, funkcija atoma željeza u citokromima je drugačija; on služi kao posrednik za prijenos elektrona s jedne tvari na drugu, dok željezo postaje ili dvovalentno ili trovalentno.

Vezno mjesto protein-ligand često se nalazi između domena. Na primjer, proteolitički enzim tripsin, koji je uključen u hidrolizu peptidnih veza proteina hrane u crijevima, ima 2 domene odvojene utorom. Unutarnju površinu žlijeba čine radikali aminokiselina ovih domena, smješteni daleko jedan od drugoga u polipeptidnom lancu (Ser 177, His 40, Asp 85).

Različite domene u proteinu mogu se pomicati jedna u odnosu na drugu u interakciji s ligandom, što olakšava daljnje funkcioniranje proteina. Kao primjer možemo uzeti u obzir rad heksokinaze, enzima koji katalizira prijenos fosfornog ostatka s ATP-a na molekulu glukoze (tijekom njezine fosforilacije). Aktivno mjesto heksokinaze nalazi se u pukotini između dviju domena. Kada se heksokinaza veže za glukozu, domene koje je okružuju se približavaju, a supstrat postaje "zarobljen", što olakšava njegovu daljnju fosforilaciju.

Glavno svojstvo proteina koje je u osnovi njihove funkcije je selektivnost vezanja specifičnih liganada na određene dijelove proteinske molekule.

Klasifikacija liganada

· Ligandi mogu biti anorganske (često ioni metala) i organske tvari, niskomolekularne i visokomolekularne tvari;

· postoje ligandi koji mijenjaju svoju kemijsku strukturu kada se vežu za aktivno središte proteina (promjene supstrata u aktivnom središtu enzima);

· postoje ligandi koji se vežu za protein samo u trenutku funkcioniranja (npr. O 2 transportiran hemoglobinom), te ligandi koji su stalno povezani s proteinom i igraju pomoćnu ulogu u funkcioniranju proteina (npr. željezo , koji je dio hemoglobina).

U slučajevima kada aminokiselinski ostaci koji tvore aktivno središte ne mogu osigurati funkcioniranje određenog proteina, neproteinske molekule mogu se pričvrstiti na određena područja aktivnog središta. Dakle, aktivno središte mnogih enzima sadrži metalni ion (kofaktor) ili organsku neproteinsku molekulu (koenzim). Neproteinski dio, čvrsto povezan s aktivnim središtem proteina i neophodan za njegovo funkcioniranje, naziva se "skupina prostate". Mioglobin, hemoglobin i citokromi imaju protetičku skupinu u aktivnom centru - hem, koja sadrži željezo.

Povezivanje protomera u oligomernom proteinu primjer je interakcije liganada velike molekulske mase. Svaki protomer, povezan s drugim protomerima, služi im kao ligand, kao i oni njemu.

Ponekad vezanje liganda mijenja konformaciju proteina, što rezultira stvaranjem veznog mjesta s drugim ligandima. Na primjer, protein kalmodulin, nakon što se veže na četiri iona Ca 2+ u određenim područjima, stječe sposobnost interakcije s određenim enzimima, mijenjajući njihovu aktivnost.

Važan koncept u teoriji interakcije između liganda i aktivnog mjesta biološke mete je "komplementarnost". Aktivno mjesto enzima mora na određeni način odgovarati ligandu, što se odražava u određenim zahtjevima za supstrat.

Slika 3. Shema interakcije između liganda i molekularne mete.

Na primjer, očekuje se da se za uspješnu interakciju veličina aktivnog centra i liganda mora podudarati (vidi poziciju 2 na slici 3), što omogućuje povećanje specifičnosti interakcije i zaštitu aktivnog centra od očito neprikladnih supstrata. . U isto vrijeme, kada se pojavi kompleks "aktivni centar-ligand", moguće su sljedeće vrste interakcija:

· van der Waalsove veze (pozicija 1, slika 3), uzrokovane fluktuacijama elektronskih oblaka oko suprotno polariziranih susjednih atoma;

· elektrostatske interakcije (pozicija 3, slika 3) koje nastaju između suprotno nabijenih skupina;

· hidrofobne interakcije (pozicija 4, slika 3), uzrokovane međusobnim privlačenjem nepolarnih površina;

· vodikove veze (položaj 5, slika 3) koje nastaju između mobilnog atoma vodika i elektronegativnih atoma fluora, dušika ili kisika.

Unatoč relativno niskoj snazi ​​opisanih interakcija (u usporedbi s kovalentnim vezama), ne treba podcjenjivati ​​njihovu važnost koja se ogleda u povećanju afiniteta vezanja.

Rezimirajući gore navedeno, može se primijetiti da je proces vezanja liganda i molekularne mete vrlo specifičan proces kontroliran i veličinom liganda i njegovom strukturom, što omogućuje selektivnost interakcije. Međutim, moguća je interakcija između proteina i supstrata koja mu nije svojstvena (tzv. kompetitivna inhibicija), koja se izražava u vezivanju s aktivnog mjesta na sličan, ali ne ciljni ligand. Važno je napomenuti da je kompetitivna inhibicija moguća kako u prirodnim uvjetima (inhibicija enzima sukcinat dehidrogenaze malonatom, inhibicija fumarat hidrataze piromelitnom kiselinom) tako i umjetno, tijekom uzimanja lijekova (inhibicija monoaminooksidaze iproniazidom, nialamidom, inhibicija dihidropteroata sintetaza sulfonamidima - strukturni analozi para-aminobenzojeve kiseline, inhibicija angiotenzin-konvertirajućeg enzima kaptoprilom, enalaprilom).

Stoga je moguće namjerno promijeniti aktivnost mnogih molekularnih sustava pomoću sintetskih spojeva sa strukturom sličnom prirodnim supstratima.

Međutim, površno razumijevanje mehanizama interakcije između liganada i molekularnih meta može biti iznimno opasno i često dovesti do tragičnih posljedica. Najpoznatijim slučajem može se smatrati tzv. “Tragedija talidomida”, koja je rezultirala rađanjem tisuća djece s urođenim deformitetima zbog upotrebe nedovoljno proučenog ljekovitog spoja talidomida od strane trudnica.

2. Optička izomerija

2.1 Opće karakteristike

Optička izomerija opažena je u tvarima koje pokazuju optičku aktivnost, to jest, sposobne su rotirati polariziranu svjetlosnu zraku. Tvari koje skreću ravninu polarizacije zrake udesno nazivaju se desnorotatorne, a lijevo - lijevorotatorne. Da bi tvar bila optički aktivna, jedini uvjet koji je potreban je da molekula ne smije imati niti središte niti ravninu simetrije. U najjednostavnijem slučaju, to je određeno prisutnošću u molekuli takozvanog asimetričnog (kiralnog) atoma. Postoje optički aktivne molekule bez asimetričnog atoma ugljika, ali ih nećemo razmatrati. Pojam "kiralnost" dolazi od engleske riječi "chirality" (od grčke riječi ceir - ruka), koju je predložio Kelvin krajem 19. stoljeća.

Slika 4. Enantiomeri talidomida.

Talidomid (Slika 4) je ozloglašeni lijek za nesanicu koji se u Europi koristio za umirenje trudnica između 1956. i 1962., što je rezultiralo između 8.000 i 12.000 tisuća beba rođenih s deformitetima. Unatoč činjenici da je mehanizam djelovanja R-izomera odgovornog za hipnotički učinak nepoznat, razlog teratogenosti S-izomera je donekle jasan - umetanje molekule S-talidomida između G-C veza DNK dovodi do poremećaja procesa replikacije i naknadnog abnormalnog razvoja fetusa. Na prvi pogled možda neće biti dovoljno očito zašto molekule koje imaju isti atomski red u svom sastavu imaju različite biološke učinke, pa ćemo ilustrirati sljedeće razmišljanje.

Slika 5. Enantiomerija kao zrcalna simetrija

Unatoč činjenici da molekule aminokiselina prikazane na slici 5 imaju identičan slijed atoma, one su ipak različite tvari, što se ogleda u nemogućnosti usporedbe njihovih prostornih modela, što je posljedica prisutnosti tetraedarskog centra asimetrije - atom ugljika, koji ima četiri različita supstituenta.

Očito, u ovom slučaju, samo jedna od molekula enantiomera može biti ligand za aktivno središte molekularne mete (slika 6), budući da druga molekula enantiomera neće djelovati s odgovarajućim veznim mjestima.

Slika 6. Projekcija enantiomera na ravninu.

Doista, ogroman broj molekularnih struktura u ljudskom tijelu ima afinitet prema molekulama s određenom kiralnošću. Dakle, u prirodi prevladavaju aminokiseline i saharidi samo jedne konfiguracije, a stvaranje njihovih antipoda je potisnuto. L-aminokiseline se prirodno nalaze u ljudskom tijelu, dok se D-aminokiseline brzo metaboliziraju D-oksidazama.

U nekim slučajevima, različiti enantiomeri mogu se razlikovati bez ikakve opreme - kada različito stupaju u interakciju s asimetričnim receptorima u našem tijelu.

Upečatljiv primjer je aminokiselina leucin: njen desnorotirajući izomer je sladak, a lijevorotirajući izomer je gorak. Odmaknuvši se malo od teme kolegija, možemo također dodati da (+)-enantiomer nootkatona ima 2200 puta intenzivniji gorki okus grejpa i karakterističan miris od (-)-enantiomera, a prirodni (3S) , 3aS, 7aR) izomer vinskog laktona ima 25 000 000 intenzivniji slatki miris s nijansom kokosa od odgovarajućeg (3R, 3aR, 7aS) izomera.

3.1. Učinak optičke izomerije na biološku aktivnost

Fenomen kiralnosti (stereoizomerije) toliko je čest u biologiji da su više od polovice svih ljekovitih spojeva kiralne molekule, odnosno imaju parove enantiomera.

Često je jedan od enantiomera (eutomer) značajno aktivniji od drugog, koji je slabiji ili uopće nije aktivan (distomer). Omjer aktivnosti eutomera prema distomeru naziva se eudizma i mjera je stereoselektivnosti danog spoja. Što je taj omjer veći, to je jača biološka aktivnost samo jednog optičkog izomera. To je posebno jasno vidljivo kada se centar optičke asimetrije nalazi na mjestu molekule koja je odgovorna za njezinu interakciju s receptorom (tzv. Pfeifferovo pravilo).

Proučavanje aktivnosti stereoizomera na izoliranim tkivima eliminira utjecaj prodiranja i distribucije i omogućuje procjenu učinkovitosti stereoizomernih tvari u njihovoj reakciji s receptorom. Interakcija asimetrične, prilično složene molekule lijeka s još složenijom strukturom aktivnog središta receptora, izvedena poput ključa-brave, nedvojbeno je određena njihovim dodirom na više točaka. U tom slučaju u strukturama tvari i receptora mogu postojati i točke povezivanja i točke međusobnog odbijanja. Očito, postojanje prvog određuje afinitet tvari za receptor. Prisutnost potonjeg može utjecati na afinitet, budući da međusobno odbijanje nekih skupina tvari i receptora može pridonijeti specifičnoj promjeni konformacije potonjeg.

Ako zamislimo da su glavne sile interakcije između asimetrično građene molekule lijeka i aktivnog mjesta receptora (ili enzima) koncentrirane barem u tri točke, tada dva optička antipoda tvari mogu jednako usmjeriti samo dva od tri skupine koje sudjeluju u procesu s obzirom na danu površinu.

Različita orijentacija treće skupine najbolje može objasniti razliku u biološkoj aktivnosti optičkih izomera, a ovisno o stupnju sudjelovanja ove skupine u procesu interakcije s receptorom, utjecaj optičke izomerije bit će izraženiji u većoj mjeri. ili manjoj mjeri.

Ako tvar stupa u interakciju s receptorom na samo dvije točke, ne može se očekivati ​​razlika u biološkoj aktivnosti njezinih optičkih izomera. Međutim, ako treća skupina u jednom izomeru prostorno sprječava kontakt tvari s receptorom na dvije druge točke, tada bi u tom slučaju također trebala postojati razlika između optičkih antipoda. Na primjer, od dva optička izomera adrenalina samo jedan ima sve tri skupine usmjerene na takav način da se mogu kombinirati s odgovarajućim skupinama receptora. U tom slučaju će se primijetiti maksimalna farmakološka aktivnost koja odgovara D-(-)-adrenalinu. U L-(+)-adrenalinu, alkoholna hidroksilna skupina je nepravilno orijentirana u odnosu na površinu receptora, te ova molekula može djelovati s receptorom samo u dvije točke. Stoga prirodni D-(-)-adrenalin ima desetke puta veću farmakološku aktivnost od umjetno sintetiziranog L-(+)-izomera.

Biološki aktivna tvar s dva asimetrična centra ima četiri dijastereomera, kao što je b-blokator labetalol. U većini slučajeva, jedan od ovih enantiomera bit će učinkovitiji od svog zrcalnog enantiomera, zbog boljeg "priklapanja" s molekulom receptora. Na primjer, 5(+)-enantiomer parasimpatikomimetičkog lijeka metakolina je više od 250 puta aktivniji od R(-)-enantiomera. Ako o receptoru razmišljate kao o rukavici u koju molekula liganda mora stati kako bi proizvela učinak, postaje jasno zašto će "ljevoruki" ligandi biti učinkovitiji u vezivanju za "lijevoruki" receptor nego njihovi " desnokretni” enantiomeri.

Aktivniji enantiomer za jednu vrstu receptora može biti manje aktivan za drugu vrstu receptora, na primjer za receptore odgovorne za neke neželjene učinke. Karvedilol, lijek koji stupa u interakciju s adrenergičkim receptorima, ima jedan kiralni centar i, prema tome, dva enantiomera. Jedan od tih enantiomera, 5(-)-izomer, aktivni je β-blokator. R(+) izomer ima 100 puta slabiji učinak na receptor. Ketamin je intravenski anestetik. Njegov (+)-enantiomer je aktivniji i manje toksični anestetik od (-)-enantiomera. Unatoč tome, racemična smjesa još uvijek se koristi kao lijek.

Konačno, budući da su enzimi obično stereoselektivni, jedan enantiomer često ima veći afinitet za enzim koji metabolizira lijek od drugog. Zbog toga se enantimomeri mogu jako razlikovati u trajanju djelovanja.

Nažalost, većina studija kliničke učinkovitosti i eliminacije spojeva lijekova kod ljudi provedena je korištenjem racemičnih smjesa lijekova, a ne njihovih pojedinačnih enantiomera. Trenutno je samo oko 45% kiralnih lijekova koji se koriste u klinici dostupno kao aktivni enantiomeri—ostali se prodaju samo kao racemične smjese. Kao rezultat toga, mnogi pacijenti primaju doze tvari koje su 50% ili više neaktivne ili čak otrovne. Međutim, bilježi se porast interesa, kako na znanstvenoj tako i na zakonodavnoj razini, za proizvodnju kiralnih lijekova u obliku njihovih aktivnih enantiomera.

Međutim, brojni spojevi prisutni su na suvremenom farmaceutskom tržištu Republike Bjelorusije kao racemati.

Slika 7. S- i R-izomeri ibuprofena.

Na primjer, široko rasprostranjeni nesteroidni protuupalni lijek ibuprofen (Slika 7) prisutan je u smjesi dvaju izomera, od kojih jedan ((S)-(+)-ibuprofen) ima ciljano djelovanje i manifestira se kao analgetik, antipiretik i ima protuupalni učinak, dok je R-izomer toksičan i može se nakupljati u masnim naslagama u obliku estera s glicerolom. S tim u vezi, sličan lijek postao je komercijalno dostupan, a to je enantiomerno čisti (S)-(+)-ibuprofen, tzv. deksibuprofen. Daljnjim istraživanjem otkriveno je da ljudsko tijelo sadrži izomerazu sposobnu pretvoriti neaktivni (R)-(-)-ibuprofen u aktivni (S)-(+)-ibuprofen.

Slika 8. R- i S-izomeri naproksena.

Naproksen, nesteroidni protuupalni lijek izveden iz propionske kiseline, također se prodaje kao racemična smjesa, iako samo S-izomer ima terapeutsko djelovanje, a R-izomer ima izraženu hepatotoksičnost.

S-amlodipin se koristi više od 20 godina u liječenju arterijske hipertenzije (AH) i angine pektoris, dok je većina lijekova koji sadrže amlodipin predstavljena racemičnom smjesom njegovih S- i R-enantiomera. Utvrđeno je da je sposobnost blokiranja sporih kanala tipa L u glatkim mišićnim stanicama krvnih žila, koja je u osnovi terapijskog učinka ovog lijeka, svojstvena samo njegovom S-enantiomeru, dok je njegov R-enantiomer 1000 puta manje aktivan u ovome. pogledu, odnosno praktički nema takva svojstva. U isto vrijeme, R-izomer nije farmakološki inertan, budući da je, za razliku od S-izomera, sposoban stimulirati sintezu NO u endotelnim stanicama putem mehanizma ovisnog o kininu. Utvrđeno je da prekomjerna dilatacija prekapilarno-arteriolarne veze krvnih žila donjih ekstremiteta, uzrokovana prekomjernim stvaranjem NO, neutralizira provedbu važnog fiziološkog mehanizma koji sprječava razvoj edema tkiva donjih ekstremiteta kada tijelo je u uspravnom položaju – tzv.prekapilarni posturalni vazokonstriktorni refleks.

Upravo je ta okolnost u pozadini nuspojava tradicionalnog racemskog amlodipina u obliku perifernog edema, koji se razvija ovisno o dozi, prema različitim podacima, u 9-32% pacijenata koji ga primaju, često starijih osoba. U usporednoj randomiziranoj studiji S-amlodipina i originalnog racemskog amlodipina, provedenoj u Ukrajini, incidencija edema tijekom 12-tjednog liječenja u gore navedenim skupinama iznosila je 1,6 odnosno 7,8%, to jest, terapija s Asomexom (trgovačka marka S-amlodipina, proizvođača Actavis Group) smanjio je rizik od njihove pojave za 4,8 puta. Učestalost perifernog edema tijekom liječenja S-amlodipinom u dvije velike postmarketinške studije bila je samo 0,75% (14 od 1859 promatranih) i 0,84% (14 od 1669). Štoviše, prema 4-tjednom promatranju, pokazalo se da je antihipertenzivna aktivnost S-amlodipina u dozama od 2,5 i 5 mg/dan jednaka onoj racemata amlodipina uzetog u dvostrukim dnevnim dozama - 5 i 10 mg.

Međutim, neki lijekovi dostupni su kao optički čisti spojevi. Dobivaju se trima metodama: razdvajanjem racemskih smjesa, modifikacijom prirodnih optički aktivnih spojeva (to su ugljikohidrati, aminokiseline, terpeni, mliječna i vinska kiselina itd.) i izravnom sintezom. Potonji također zahtijeva kiralne izvore, budući da sve druge tradicionalne metode sinteze daju racemat. To je jedan od razloga visoke cijene nekih lijekova, pa ne čudi da je od brojnih sintetskih kiralnih lijekova koji se proizvode u cijelom svijetu samo mali dio optički čist, a ostatak su racemati.

Također je moguće da svaki enantiomer ima svoj specifični učinak. Dakle, lijevorotirajući S-tiroksin (lijek levothroid) je prirodni hormon štitnjače. A dekstrorotatorni R-tiroksin ("dekstroid") snižava kolesterol u krvi. Neki proizvođači smišljaju palindromske trgovačke nazive za takve slučajeve, na primjer, "Darvon" za narkotički analgetik i "Novrad" za lijek protiv kašlja.

Kao što je već navedeno na primjeru aminokiseline leucina, čovjek je kiralno biće.

I to se ne odnosi samo na njegov izgled. Enantiomerni lijekovi, u interakciji s kiralnim molekulama u tijelu, na primjer s enzimima, mogu djelovati na različite načine. "Pravi" lijek pristaje svom receptoru poput ključa u bravu i pokreće željenu biokemijsku reakciju. Antiaritmik S-anaprilin je sto puta jači od R-forme. Antihelmintik levamisol djeluje uglavnom u S-izomeru, dok njegov R-antipod izaziva mučninu, pa je svojedobno racemični levamisol zamijenjen jednim od enantiomera. Šezdesetih godina prošlog stoljeća pokušali su liječiti parkinsonizam jednim od prekursora adrenalina u tijelu - dioksifenilalaninom (L-DOPA).

Pokazalo se da je ova supstanca, kao i njoj srodni dopamin i metildopa, učinkovita samo u obliku S-izomera. U isto vrijeme, R-DOPA uzrokuje ozbiljne nuspojave, uključujući poremećaje krvi. Merck je razvio metodu za proizvodnju antihipertenzivnog lijeka methyldopa, koja uključuje spontanu kristalizaciju samo željenog enantiomera uvođenjem male klice ovog izomera u otopinu.

Penicilamin (3,3-dimetilcistein) je prilično jednostavan derivat aminokiseline cisteina. Ova tvar se koristi za akutna i kronična trovanja bakrom, živom, olovom i drugim teškim metalima, jer stvara jake komplekse s ionima tih metala, a ti se kompleksi uklanjaju putem bubrega.

Penicilamin se također koristi za različite oblike reumatoidnog artritisa, sistemske sklerodermije iu nizu drugih slučajeva. U ovom slučaju koristi se samo S-oblik lijeka, jer je R-izomer toksičan i može dovesti do sljepoće. Nije uzalud naslovnica američkog časopisa “Journal of Chemical Education” iz lipnja 1996. godine sadržavala tako neobičan crtež. Ništa manje rječit nije bio ni naslov članka o antipodnim lijekovima: “Kada se molekula pogleda u ogledalo”.

4. Geometrijska izomerija

4.1 Opće karakteristike

Slika 9. Cis- i trans-dikloroeten.

farmakologija lijeka izomerija

Stereoizomeri su tvari koje imaju iste kemijske formule, ali čije se molekule razlikuju samo u međusobnom rasporedu atoma. Za razliku od strukturnih izomera, u stereoizomernim molekulama priroda i redoslijed kemijskih veza su isti. Najvažniji tipovi stereomera su cis-trans izomeri (E-Z izomeri), enantiomeri, dijastereomeri i konformeri. Potonji se slučaj odnosi na velike molekule, na primjer proteine, koji uz istu primarnu strukturu mogu imati različite konformacije.

Cis-trans izomerija odnosi se na raspored različitih atoma ili skupina u odnosu na poželjnu vezu, kao što je dvostruka veza. U cis izomeru ti se atomi nalaze s jedne strane izolirane veze, a u trans izomeru s različitih strana. Najjednostavniji primjer cis-trans izomerije su spojevi kao što je dikloroeten (slika 10). U složenijim slučajevima, nomenklatura koju je predložio UPAK koristi se za opisivanje ove vrste stereoizomera: za Z-izomere, skupine s najvećim težinama su na jednoj strani veze, a za E-izomere su na različitim stranama.

4.2. Učinak geometrijske izomerije na biološku aktivnost

Slika 10. Prikaz inhibicije rotacije u odnosu na peptidnu vezu u proteinima.

Cis-trans izomeri također mogu nastati enantiomeri kiralnih spojeva. Važan primjer je peptidna veza u proteinima koju tvore ostaci L-aminokiselina. Ova veza ima karakter djelomične dvostruke veze, stoga se glavni atomi peptidne skupine (-C b -C?-N-C b -) nalaze u istoj ravnini i skupina može biti u cis ili trans konformaciji ( Slika 11).

Iako se slobodna izomerizacija događa u nesmotanom polipeptidnom lancu i peptidne skupine poprimaju obje konformacije, u nativnom proteinu samo jedna od 1000 skupina ima cis konformaciju (ostale su u trans konformaciji). Trans konformacija peptidnih skupina postavlja se tijekom njihove sinteze na ribosomima i održava se naknadno. Međutim, ako peptidna skupina uključuje prolinski ostatak (Slika 12), što je rijetko u običnim proteinima, tada trans/cis omjer postaje 3/1. To znači da se u ovom slučaju izomerizacija odvija mnogo brže (iako još uvijek vrlo sporo, s vremenskom konstantom od oko 20, na sobnoj temperaturi) nego u peptidnoj vezi koju tvore drugi aminokiselinski ostaci.

Slika 11. Molekula L-prolina

Tijekom sinteze proteina, proces savijanja polipeptidnog lanca da bi se formirala nativna konformacija (savijanje) događa se tisućama puta brže od cis-trans izomerizacije; međutim, ponekad se peptidna skupina formira u cis konformaciji. U tom slučaju, proces savijanja se zaustavlja sve dok ne dođe do ispravne konformacije ili se potpuno zaustavlja. Događa se obrnuto, kada aktivni oblik proteina ne zahtijeva trans konformaciju, koja se formira tijekom sinteze, već cis konformaciju, tada morate čekati dok se ne formira. U oba slučaja u pomoć dolazi poseban enzim - peptidilprolil izomeraza, koji značajno ubrzava proces izomerizacije, zbog čega se sinteza takvih proteina nastavlja bez odlaganja.

Slika 12. Molekula serotonina

Nedavno je otkriveno da cis-trans izomerizacija ne utječe samo na strukturu proteina, već takva promjena strukture može imati važnu ulogu u regulaciji biokemijskih procesa. Jedan od najvažnijih neurotransmitera odgovornih za regulaciju vrlo velikog broja procesa u različitim organizmima – od nematoda do čovjeka – je serotonin (5-hidroksitriptamin, slika 13). Kod ljudi se 80-90% serotonina nalazi u posebnim stanicama crijeva, gdje se koristi za regulaciju peristaltike. Ostatak serotonina sintetizira se u serotonergičkim neuronima u središnjem živčanom sustavu, gdje je uključen u regulaciju apetita, sna, dobrog raspoloženja i agresije. Osim toga, potiče rast stanica, posebice u procesu obnove jetre nakon oštećenja, te regulira rast i resorpciju kostiju. Serotonin se također proizvodi u biljkama i gljivama, a sadrži ga i neko povrće i voće.

Raznolikost regulatornih funkcija serotonina posljedica je prisutnosti različitih serotoninskih receptora u različitim stanicama, koji tvore takozvanu superobitelj serotoninskih receptora (5-HT receptori). Nedovoljna ili prekomjerna proizvodnja serotonina dovodi do različitih psihičkih poremećaja. Dakle, s nedostatkom serotonina (ili defektima u njegovim receptorima), osoba doživljava depresiju. Stoga mnogi laboratoriji proučavaju regulaciju serotonina, posebice mehanizme interakcije serotonina s različitim receptorima.

Svi serotoninski receptori, osim 5-HT 3 , djeluju tako da aktiviraju G proteine, koji zatim uzrokuju kaskadu biokemijskih reakcija koje dovode do specifičnog rezultata. 5-HT 3 receptor je jedini koji pripada tipu zatvorenih ionskih kanala (najbliži strukturni analog mu je nikotinski acetilkolinski receptor). Ovaj receptor je protein koji pet puta prodire kroz staničnu membranu živčane stanice u kojoj se, kada se veže za serotonin, stvara pora koja propušta katione natrija, kalija i kalcija. Prolaz iona kroz otvoreni kanal dovodi do ekscitacije neurona i stvaranja živčanog impulsa.

Međutim, nije bilo poznato kako se kanal otvara u membrani. Nedavno je otkriveno da je inicijator strukturnih preustroja u 5-HT 3 receptoru izomerizacija jednog prolinskog ostatka koji se nalazi na ključnom mjestu za ovu vrstu receptora (vrh cisteinske petlje). Ako je prolin u trans konformaciji, tada je kanal zatvoren. Vezanje serotonina uzrokuje izomerizaciju prolina i kanal se otvara. Ovo je možda prvi put da je eksperimentalno pokazano da je prebacivanje ionskog kanala između otvorenog i zatvorenog stanja posljedica stereoizomerizacije samo jedne jedinice u polipeptidnom lancu.

Unatoč manjoj (u usporedbi s optičkom izomerijom) važnosti cis-trans izomerije za farmaciju, mora se priznati da ona još uvijek ima svoju nišu.

Upečatljiv primjer razlika u svojstvima biološki aktivnih spojeva u kontekstu geometrijske izomerije je linolna kiselina, koja je monobazična karboksilna kiselina s dvije izolirane veze - CH 3 (CH 2) 3 -(CH 2 CH=CH) 2 ( CH 2) 7 COOH.

Slika 13. Linolna kiselina.

Linoleinska kiselina pripada obitelji omega-6 višestruko nezasićenih masnih kiselina i regulira svojstva staničnih i substaničnih membrana u tijelu. Važno je napomenuti da samo cis izomer linolne kiseline tijelo može koristiti za sintezu arahidonske kiseline, dok su trans izomeri neaktivni i mogu se nakupljati u organima i tkivima. Linolna kiselina uključena je u mnoge lijekove i dodatke prehrani koji se prodaju u Republici Bjelorusiji. Na primjer, linolna kiselina je jedna od glavnih komponenti lijekova "Essentiale" i "Essentiale Forte N" (Sanofi Aventis), "Essentsikaps" (MinskInterCaps), "Akulive" (Lysi HF), "Phosphoglyph" (Pharmstandard-Leksredstva). ) i drugi.

U isto vrijeme, trans izomeri masnih kiselina nisu uvijek ravnodušni. Početkom 90-ih godina prošlog stoljeća pojavio se niz publikacija koje ukazuju na povezanost konzumacije transmasti s rizikom od razvoja kardiovaskularnih bolesti. Naknadno je WHO preporučio smanjenje konzumacije trans masti u tragovima, jer su se pojavile informacije koje potvrđuju utjecaj trans izomera masnih kiselina na pojavu raka, dijabetesa, Alzheimerove bolesti i drugih jednako neugodnih bolesti.

Međutim, ne pokazuju samo izomeri prirodnog podrijetla različite biološke aktivnosti. Na primjer, cisplatin (cis-, cis-diklordiaminplatina(II) je alkilirajući citotoksični lijek predstavljen, kao što naziv implicira, cis izomerom. Cisplatin ima terapeutski učinak tako što se veže na molekulu DNA i stvara koordinacijski spoj između platine atoma i dvije dušikove baze, što dovodi do nemogućnosti daljnjeg očitavanja i reprodukcije nasljednih informacija. Studija je pokazala da je kompleks cisplatin-DNA stabilniji od sličnog kompleksa koji sadrži trans izomer. To osigurava razvoj dugotrajnijeg terapijskog učinka, što je, očito, odredilo izlazak cis izomera na tržište.Istovremeno, postoje istraživanja koja ukazuju na prisutnost spojeva kompleksa platine koji su u trans obliku i imaju aktivnost usporedivu s cisplatinom.U tom kontekstu postaje očito da razmatranje jednog spoj bez proučavanja njegove interakcije s molekularnom metom ne čini se optimalnim.

Kada govorimo o pitanjima geometrijske izomerije, ne možemo ne spomenuti naše sunarodnjake koji razvijaju lijekove na bazi kompleksa paladija (II) s N-supstituiranim tetrazolima (Bjelorusko državno sveučilište), koji su učinkoviti citostatici koji pokazuju antiproliferativno djelovanje u cis- i a broj trans izomera.

Zaključak

Ukratko, može se primijetiti da prostorna struktura spoja lijeka uvelike određuje njegovu farmakološku aktivnost. Ozbiljnost biološkog učinka i njegov smjer ovise o strukturi liganda u interakciji s molekularnom metom.

U sadašnjem stupnju razvoja farmaceutske industrije velika se pažnja posvećuje metodama računalno potpomognutog dizajna ljekovitih spojeva, što je diktirano kako ekonomskim čimbenicima (vrijeme i troškovi razvoja značajno su smanjeni), tako i etičkim čimbenicima - postojećim algoritmima. omogućiti predviđanje moguće toksičnosti ispitivanog spoja i spriječiti tragedije slične talidomidu.

Po mom mišljenju, jedan od najznačajnijih aspekata utjecaja prostorne strukture ljekovite tvari na farmakološku aktivnost i farmakokinetiku je proučavanje interakcija ligand-receptor. Proučavanje strukture biomolekule i rekreacija njezine izvorne strukture omogućuje dobivanje informacija o aktivnom centru, što u budućnosti, korištenjem dockinga, omogućuje odabir točno one strukture koja će proizvesti optimalan učinak.

Sljedeća zanimljiva činjenica za mene bilo je postojanje deskriptora molekularne strukture - posebnih matematičkih parametara koji mogu generalizirati prostorni raspored atoma na neku mjerljivu vrijednost. Molekularni deskriptori kasnije se mogu koristiti za izradu modela koji "uključuju" dostupne informacije o spoju koji se proučava, a kao rezultat se "dobiva" parametar koji nas zanima - farmakološka aktivnost.

Proučavanje materijala pri izradi kolegija bilo je vrlo zanimljivo, iako teško, jer je adekvatno razumijevanje djelovanja ljekovitih supstanci nemoguće bez proučavanja mehanizama koji su uključeni pri njihovom prodiranju u organizam. Bilo je ugodno saznati da se rad na dobivanju novih ljekovitih spojeva provodi ne samo u apstraktnom "inozemstvu", već i od strane znanstvenika iz zemalja ZND-a, kao i Bjelorusije - posebno Nacionalne akademije znanosti Republike Hrvatske. iz Bjelorusije već dugo i prilično uspješno radi na problemu molekularnog dizajna liganada za mikrosomalne oksidacijske enzime .

Ovako ili onako, obavljeni posao činio mi se korisnim, možda ne toliko za moj profesionalni razvoj kao ljekarnika-receptora, koliko za formiranje širokog pogleda i dubljeg razumijevanja uloge farmaceutske kemije kao znanosti .

Književnost

1. MedUniver [Elektronički izvor] / Farmakologija. - Način pristupa: http://meduniver.com/Medical/farmacologia/25.html. - Datum pristupa: 01.05.2013.

2. Klinička farmakologija. Nacionalno vodstvo. Uredio Yu.B. Belousova, V.G. Kukeša, V.K. Lepakhina, V.I. Petrova-M: “GEOTAR-Media”, 2009-965p.

3. Wikipedia [Elektronički izvor] / Agonist. - Način pristupa: http://ru.wikipedia.org/wiki/Agonist. - Datum pristupa: 01.05.2013.

4. Biokemija: udžbenik / ur. E. S. Severina. - 3. izdanje, rev. - M.: Geotar-Media, 2005. - 784 str.

5. Chemical encyclopedia [Elektronički izvor] / Fumarate hydratase. - Način pristupa: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4963.html. - Datum pristupa: 01.05.2013.

6. Soldatenkov A.T. Osnove organske kemije ljekovitih tvari / A.T. Soldatenkov. - M.: Kemija, 2001.-- 192 str.

7. Tracy, T. S. Metabolička inverzija (R)-ibuprofena. Epimerizacija i hidroliza ibuprofenil-koenzima A/T.S. Tracy, S.D. Hall // Drug Metab. Dispos. -- 1992. -- V.20. -- br. 2. -- Str. 322-327.

8. Hlapljivi prirodni organski spojevi [Elektronički izvor] / Način pristupa: http://fen.nsu.ru/poosob/pochki/Tkachev.pdf. - Datum pristupa: 01.05.2013.

9. Burges, R.A. Svojstva amlodipina za blokiranje kalcijevih kanala u vaskularnom glatkom mišiću i srčanom mišiću in vitro: dokazi za modulaciju napona vaskularnih dihidropiridinskih receptora / R.A. Burges // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1987.; 9 (1): 110-119.

10. Laufen, H. Enantioselektivna raspodjela oralnog amlodipina u zdravih dobrovoljaca / H. Laufen, M. Leitold // Kiralnost. - 1994. - V. 6 (7). - Str. 531-536.

11. Cogolludo, A. Nove spoznaje u farmakološkoj terapiji arterijske hipertenzije / A. Cogolludo, F. Perez-Vizacaino, J. Tumargo // Curr. Opin. Nefrol. hipertenzije. - 2005. - V.14. - Str. 423-427.

12. Perna G.P. Učinkovitost i tolerancija amlodipina u bolesnika sa stabilnom anginom pektoris. Rezultati multicentrične studije / G.P. Perna // Clin. Droga. Investirati. - 1997. - V. 13. - P. 149-155.

13. Bobrov, V.A. Primjena S-amlodipina u liječenju bolesnika s blagom i umjerenom arterijskom hipertenzijom / V.A. Bobrov [etc.] // Zdravlje Ukrajine - 2007. - Broj 12/1. - P. 1-4.

14. Leenson, I.A. Lijevo ili desno / I.A. Leenson // M.: Kemija i život. - br. 5. - 2009. - S. 20-23.

15. Aleksejev, V.V. Optička izomerija i farmakološka aktivnost lijekova // Soros Educational Journal, 1998, br. 1, str. 49-55 (prikaz, ostalo).

16. Yanitsky, P.K. Raznolikost strukture i oblika molekula organskih spojeva / P.K. Yanitsky, V. Reversky, V. Gumulka // Novosti farmacije i medicine. 1991. broj 4/5. str. 98-104.

17. Biologija [Elektronički izvor] / Uloga stereoizometrije u biokemijskoj regulaciji. Način pristupa: http://bio.1september.ru/view_article.php?ID=200901701. - Datum pristupa: 01.05.2013.

18. Biokemija: udžbenik za visoka učilišta / Ured. E. S. Severina. -- GEOTAR-Media, 2003. -- Str. 371-374

19. Unos transmasnih kiselina i rizik od koronarne bolesti srca kod žena / Walter C. - Lancet. - V. 341. - P. 581--585.

20. Willett, W.C. Transmasne kiseline: jesu li učinci samo marginalni? /ZAHOD. Willet, A. Ascherio Američki časopis za javno zdravstvo. - V. 84 (3). - 1994. - P. 722-724.

21. Znanstveno ažuriranje SZO-a o trans masnim kiselinama: sažetak i zaključci / R Uauy // European Journal of Clinical Nutrition. - Broj 63. - 2009. - R. 68-75.

22. Nafisi, S. Komparativna studija o interakciji cis- i trans-platine s DNA i RNA. / S. Nafisi, Z. Norouzi. // DNA Cell Biol. - V. 28(9). - 2009. - Str. 469-477.

23. Moskovsko državno sveučilište nazvano po. Lomonosov [Elektronički izvor] / Antitumorsko djelovanje kompleksa acetoksima i hidroksilamina platine(II). Način pristupa: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2007/23/Chemistry/kukushkin_nv.doc.pdf. - Datum pristupa: 01.05.2013.

24. Sinteza i struktura novih kompleksnih spojeva paladija(ii) s n-supstituiranim tetrazolima / T.V. Serebryanskaya [i drugi] // Minsk, “Sviridovska čitanja”, 2008. - P. 45-53.

25. Todeschini, R. Molekularni deskriptori za kemoinformatiku / R. Todeschini, V. Consonni. - Willey-VCH, 2009. - 1265 str.

26. Kvantitativni odnosi strukture i aktivnosti: Osnove i primjena Hanschove analize / Međunarodna unija čiste i primijenjene kemije. Brasil, 2006. - Način pristupa: http://iupac.org/publications/cd/medicinal_chemistry. - Datum pristupa: 20.04.2013.

27. Todeschini, R. Priručnik molekularnih deskriptora / R. Todeschini, V. Consonni. - Wiley-VCH, 2000. - 688 str.

Slični dokumenti

Proučavanje glavnih značajki upalnog procesa. Obilježja farmakološkog djelovanja nesteroidnih protuupalnih lijekova. Proučavanje indikacija i načina primjene, kontraindikacija, nuspojava.

kolegij, dodan 03/10/2014


Glavne indikacije i farmakološki podaci za primjenu nesteroidnih protuupalnih lijekova. Slučajevi zabrane njihove uporabe. Karakteristike glavnih predstavnika nesteroidnih protuupalnih lijekova.

sažetak, dodan 23.03.2011


Digitalno kodiranje lijekova. Utjecaj različitih čimbenika na potrošačka svojstva i kvalitetu lijekova, metode zaštite robe po fazama životnog ciklusa. Farmakološko djelovanje, indikacije lijekova na bazi čage.

kolegij, dodan 28.12.2011


Značajke lijekova koji se primjenjuju kod poremećaja sekretorne funkcije želuca, dvanaesnika i gušterače. Analiza skupina lijekova: njihovo farmakološko djelovanje, doze, oblici primjene i puštanja u promet, nuspojave.

kolegij, dodan 30.10.2011


Mjesto nesteroidnih protuupalnih lijekova među “simptomatskim” lijekovima u liječenju reumatskih bolesti. Značajke mehanizma djelovanja, indikacije za uporabu i doziranje, nuspojave lijekova u ovoj skupini.

kolegij, dodan 21.08.2011


Pojam bioraspoloživosti lijekova. Farmakotehnološke metode za procjenu razgradnje, otapanja i otpuštanja ljekovitih tvari iz ljekovitih pripravaka različitih oblika. Prolaz lijekova kroz membrane.

kolegij, dodan 02.10.2012


Značajke ruskog farmaceutskog tržišta. Karakteristike skupine nesteroidnih protuupalnih lijekova. Robna analiza lijeka na temelju lijeka. Istraživanje marketinga proizvoda, strategija promocije.

kolegij, dodan 30.11.2010


Državna regulativa u području prometa lijekova. Krivotvorenje lijekova važan je problem današnjeg farmaceutskog tržišta. Analiza stanja kontrole kvalitete lijekova u sadašnjoj fazi.

kolegij, dodan 07.04.2016


Značajke primjene nesteroidnih protuupalnih lijekova u reumatoidnom artritisu. Terapeutski učinak primjene lijekova, mogućnost nuspojava, individualizacija izbora. Čimbenici rizika za gastrotoksičnost.

prezentacija, dodano 21.12.2014


Glavne zadaće farmakologije: stvaranje lijekova; proučavanje mehanizama djelovanja lijekova; proučavanje farmakodinamike i farmakokinetike lijekova u eksperimentu i kliničkoj praksi. Farmakologija sinaptotropnih lijekova.

1. 
   Nositelji genetske informacije u mikroorganizmima.
2. 
   Oblici manifestacije varijabilnosti mikroorganizama. Izmjene. Mutacije, njihova klasifikacija. R-S disocijacija. Praktični značaj varijabilnosti mikroorganizama.
3. 
   Mutageni, podjela, mehanizam djelovanja mutagena na genom mikroorganizama.
4. 
   Uloga citoplazmatskih genetskih struktura u varijabilnosti mikroorganizama.
5. 
   Genetske rekombinacije.
6. 
   Transformacija, faze procesa transformacije.
7. 
   Transdukcija, specifična i nespecifična transdukcija.
8. 
   Konjugacija, faze procesa konjugacije.

1. U testnim zadatcima naznačite točne odgovore.

1. Pregled i skiciranje demonstracijskih priprema:

A) R-S disocijacija bakterija.

Kontrolna pitanja:

1. 
   Što je materijalna osnova nasljeđivanja mikroorganizama?
2. 
   Koji oblici manifestacije varijabilnosti mikroorganizama postoje?

1. 
   Koji je praktični značaj mikrobne varijabilnosti?
2. 
   Što su izmjene?
3. 
   Što su mutacije?
4. 
   Koja je klasifikacija mutacija?
5. 
   Što su mutageni?
6. 
   Kakav je mehanizam djelovanja mutagena na genom mikroorganizama?

1. 
   Koja je uloga citoplazmatskih genetskih struktura u varijabilnosti mikroorganizama?
2. 
   Što su genetske rekombinacije?
3. 
   Što je transformacija? Koje su faze u ovom procesu?
4. 
   Što je transdukcija?
5. 
   Što je konjugacija? Koje su faze u ovom procesu?

TEST ZADANIJA

Navedite točne odgovore ety:

1. Što su izvankromosomske genetske strukture?

A) ribosomi

B) polisomi

B) plazmidi

D) mezosomi

D) transpozoni

2. Što su mutageni?

A) geni koji osiguravaju mutaciju

B) čimbenici koji uzrokuju mutaciju

B) čimbenici koji prenose genetske informacije

D) Čimbenici popravka DNA

3. Što je egzon?

A) virulentni bakteriofag

B) profage

B) dio gena koji nosi određenu genetsku informaciju

D) umjereni bakteriofag

4. Što je inverzija?

A) metoda genetske rekombinacije

B) korekcija oštećenih dijelova DNA

B) kromosomska mutacija

D) točkasta mutacija

5. Što je modifikacija?

B) fenotipske promjene koje ne zahvaćaju genom stanice

B) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

D) nasljedna nagla promjena svojstva

6. Konjugaciju karakteriziraju:

A) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

B) potreban je kontakt između stanica donora i primatelja

B) prijenos genetskog materijala pomoću RNA

D) prijenos genetskog materijala spolnim putem

7. Što je reparacija?

A) lizogenija

B) popravak oštećene DNA

C) način prijenosa genetske informacije

D) viropeksija

8. Što karakterizira "minus" lanac RNK?

A) ima infektivnu aktivnost

B) ima nasljednu funkciju

B) može se integrirati u kromosom stanice

D) nema funkciju glasničke RNK

9. Kod kojih je mikroorganizama RNK materijalna osnova nasljeđa?

A) kod bakterija

B) kod spiroheta

D) u mikoplazmi

10. Što su mutacije?

A) ispravak oštećenih dijelova DNA

B) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

B) nasljedna nagla promjena svojstva

D) proces stvaranja bakterijskog potomstva koje sadrži karakteristike davatelja i primatelja

11. Što je transformacija?

A) popravak oštećene DNK

B) prijenos genetske informacije nakon kontakta bakterijskih stanica različite "seksualne" orijentacije

C) prijenos genetske informacije pomoću fragmenta DNA

D) prijenos genetske informacije od stanice donora do stanice primatelja pomoću bakteriofaga

INFORMACIJA MATERIAL NA TEMU NASTAVE

Uprizorenje iskustva transformacije

Primatelj - procijediti Bacil subtilis Str (bacillus subtilis, osjetljiv na streptomicin); donor - DNA izolirana iz soja U.Subtilis Str (otporan na streptomicin). Selektivni medij za odabir rekombinanata (transformanata) hranjivi agar koji sadrži 100 U/ml streptomicina.

Na 1 ml bujonske kulture U.Subtilis dodajte 1 µg/ml otopine DNaze u 0,5 ml otopine magnezijevog klorida kako biste uništili DNK koja nije prodrla u bakterijske stanice soja primatelja i inkubirajte 5 minuta. Za određivanje broja nastalih rekombinanata (transformanata) rezistentnih na streptomicin, 0,1 ml nerazrijeđene smjese se posije na selektivnu podlogu u Petrijevu zdjelicu. Za određivanje broja stanica primateljske kulture u izotoničnoj otopini natrijevog klorida, pripremite 10-struka razrjeđenja do 10 -5 -10 -6 (kako biste dobili izbrojiv broj kolonija), inokulirajte 0,1 ml na hranjivi agar bez streptomicina, a za kontrolu – na agaru sa streptomicinom. Kultura primatelja ne bi trebala rasti na potonjem mediju jer je osjetljiva na streptomicin. Inokulacija se inkubira na 37 0 C. Sljedeći dan se uzimaju u obzir rezultati pokusa i određuje učestalost transformacije omjerom broja uzgojenih rekombinantnih stanica i broja stanica soja primatelja.

Pretpostavimo da kada se posije 0,1 ml kulture primajućeg soja u razrjeđenju od 10 -5, izraste 170 kolonija, a kada se posije 0,1 ml nerazrijeđene smjese, izraste 68 kolonija rekombinantnog soja. Budući da je svaka kolonija nastala kao rezultat razmnožavanja samo jedne bakterijske stanice, 0,1 ml inokulirane primateljske kulture sadrži 170 x 10 5 živih stanica, a 1 ml - 170 x 10 6, odnosno 1,7 x 10 8. U isto vrijeme, 0,1 ml smjese sadrži 68 rekombinantnih stanica, a 1 ml - 680, ili 6,8 x 10 2.

Stoga će učestalost transformacije u ovom eksperimentu biti jednaka:

Postavljanje specifičnog eksperimenta transdukcije

Primatelj je soj E. coli lac-, kojemu nedostaje operon 3-galaktozidaze koji kontrolira fermentaciju laktoze. Transducirajući fag je fag X dgal u čijem su genomu neki od gena zamijenjeni (operonom 3-galaktozidaze E. coli. Defektan je, tj. nije sposoban izazvati produktivnu infekciju koja završava u lizu Escherichie coli, a označava se slovom d (fag dgal ) uz naziv gal operona sadržanog u genomu Selektivna podloga - Endo podloga, na kojoj laktoza-negativne bakterije soja primatelja stvaraju bezbojne kolonije, a laktoza -pozitivne kolonije rekombinantnog soja poprimaju crvenu boju s metalnom nijansom.U 1 ml 3-satne bujonske kulture soja primatelja dodajte 1 ml transducirajućeg faga dgal u koncentraciji od 10 6 - 10 7 čestica po 1 ml Smjesa se inkubira 60 minuta na 37 0 C, nakon čega se priprema serija 10-strukih razrjeđenja (ovisno o očekivanoj koncentraciji bakterija) kako bi se dobio izbrojiv broj kolonija. epruvete s razrjeđenjem od 10 -6 , inokulirajte 0,1 ml kulture u 3 Petrijeve zdjelice s Endo medijem i ravnomjerno rasporedite tekućinu lopaticom po površini medija.

Usjevi se inkubiraju 1 dan, nakon čega se bilježe rezultati pokusa i izračunava se učestalost transdukcije omjerom broja rekombinantnih stanica (transduktanata) pronađenih na svim posudama prema broju stanica soja primatelja.

Na primjer, nakon sijanja 0,1 ml miješane kulture u razrjeđenju od 10 -6 na 3 čaše s Endo medijem, izraslo je 138, 170 i 160 bezbojnih kolonija soja primatelja, redom, na prvoj i posljednjoj čašici - 5 i 1 kolonija crvenih transduktanata. Stoga će frekvencija transdukcije u ovom slučaju biti jednaka:

Postavljanje pokusa konjugacije u svrhu prijenosa fragmenta kromosoma, katkoji sadrži genleu, koji kontrolira sintezu leucina.

Donator - soj E.coli K12 Hfr leu str S ; primatelj – soj E.Coli K12 F - leu+ Str R . Hfr je oznaka za stanje koje karakterizira visoka frekvencija rekombinacije. Selektivna podloga za izolaciju rekombinanata - minimalna glukozno-solna podloga: KH 2 PO 4 - 6,5 g, MgSO 4 - 0,1 g, (NH 4)2SO 4 - 1 g, Ca(NO 3)2 - 0,001 g, FeSO 4 - 0,0005 g, glukoza - 2 g, streptomicin - 200 U/ml, destilirana voda - 1 l.

Dodajte 1 ml bujonske kulture donora u 2 ml 3-satne kulture primatelja. Usjevi su inkubirani na 37°C 30 minuta. Zatim se smjesa razrijedi na 10 -2 -10 3 i 0,1 ml se nasadi na selektivnu agarnu podlogu u Petrijevim zdjelicama, na kojoj će rasti samo rekombinantne kolonije. Kao kontrola, sojevi donora i primatelja posijani su na istu podlogu, na njoj neće rasti, jer je prvi soj osjetljiv na streptomicin, a drugi je auksotrofan na leucin. Uz to se kultura soja donora sije na selektivnu podlogu bez streptomicina, a kultura soja primatelja sije se na potpunu podlogu (hranjivi agar) s antibioticima radi određivanja broja živih stanica. Usjevi su inkubirani na 37 0 C do sljedećeg dana. Nakon brojanja izraslih kolonija, učestalost rekombinacija određuje se omjerom broja rekombinantnih stanica i stanica primatelja.

Na primjer, nakon sjetve 0,1 ml mješavine kultura davatelja i primatelja u razrjeđenju od 10 -2, izraslo je 150 kolonija rekombinanata, a nakon sjetve 0,1 ml kulture primatelja iz razrjeđenja od 10 -6, naraslo je 75 kolonija. Stoga će frekvencija rekombinacije biti jednaka:

EDUKATIVNO ISTRAŽIVAČKI RAD br.7

Tema: Bakteriološka metoda dijagnosticiranjaagnostici

zarazne bolesti. Ishrana bakterija. Principi uzgoja mikroorganizama. Hranjivi mediji. Metode sterilizacije

Cilj učenja: Ovladati bakteriološkom metodom dijagnostike zaraznih bolesti. Proučiti vrste bakterijske ishrane, principe uzgoja mikroorganizama, klasifikaciju podloga za kulture i metode sterilizacije.

Potrebna početna razina znanja: Fiziologija mikroorganizama.

Praktična znanja i vještine koje student treba steći u nastavi:

Pitanja koja se razmatraju tijekom ispitayatii:

1. 
   Bakteriološka metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, njezina svrha i stadiji.
2. 
   Vrste bakterijske ishrane.
3. 
   Principi uzgoja mikroorganizama.

1. 
   Hranjive podloge; zahtjevi za hranjive medije.
2. 
   Podjela hranjivih podloga, njihov sastav i priprema.
3. 
   Metode sterilizacije: fizikalne, kemijske, biološke i mehaničke.
4. 
   Mikrob kao predmet sterilizacije i dezinfekcije. Povezanost sa strukturom mikrobne stanice. Glavne mete molekularne strukture mikroorganizama pod utjecajem sterilizacije i dezinfekcije.
5. 
   Razlike između pojmova kontaminacije i dekontaminacije, dezinfekcije i sterilizacije, asepse i antiseptike.
6. 
   Klasifikacija instrumenata, uređaja, metoda obrade i vrsta izloženosti za sterilizaciju i dezinfekciju.

1. 
   Suvremene tehnologije i oprema za sterilizaciju.
2. 
   Metode praćenja učinkovitosti sterilizacije i dezinfekcije.

Samostalni rad studenata:

1. Pokus kojim se utvrđuje učinak visoke temperature (80°C) na sporotvorne (antrakoidne) i asporogene (Escherichia coli i stafilokoke) mikroorganizme.

Učitelj objašnjava iskustvo:

A) na svakoj tablici daje se suspenzija stafilokoka, E. coli i spore bacila (antracoid);

B) svaka se suspenzija inokulira na kosi agar prije zagrijavanja;

C) suspenzije koje se proučavaju se stave u vodenu kupelj na temperaturi od 80 0 C tijekom 20 minuta;

D) svaka se suspenzija inokulira na kosi agar nakon zagrijavanja;

D) popunjava se protokol na sljedećem obrascu:

Vegetativni oblici patogenih mikroorganizama ugibaju na 50-60 0 C tijekom 30 minuta, a na temperaturi od 70 0 C 5-10 minuta. Bakterijske spore su otpornije na visoke temperature, što se objašnjava sadržajem vode u njima u vezanom stanju, visokim sadržajem kalcijevih soli, lipida te gustoćom i višeslojnošću ovojnice. Posljedično, stafilokok i E. coli umiru nakon zagrijavanja, ali antrakoidne spore preživljavaju. To se mora uzeti u obzir pri ocjeni rezultata sjetve.

2. Sami popunite tablicu:

3. U testnim zadatcima naznačite točne odgovore.

Praktičan rad studenata:

1. Pregled demonstracijskih pripravaka i uređaja:

A) hranjivi mediji (MPB, MPA, krvni agar, serumski agar, Hissov medij, Endo medij, Ploskirev medij);

B) Pasterova pećnica, autoklav.

Testovi uankete:

1. 
   Koji su ciljevi i faze bakteriološke metode dijagnostike zaraznih bolesti?
2. 
   Što je bakterijska ishrana?
3. 
   Koje vrste bakterijske ishrane postoje?
4. 
   Koji su principi uzgoja mikroorganizama?
5. 
   Što su kulturni mediji?
6. 
   Koji su zahtjevi za hranjive podloge?
7. 
   Koja je klasifikacija hranjivih podloga?
8. 
   Kako se pripremaju kulturni mediji?
9. 
   Što je sterilizacija?
10. 
    Koje metode sterilizacije postoje?
11. 
    Koja je razlika između pojmova kontaminacije i dekontaminacije, dezinfekcije i sterilizacije, asepse i antiseptike?
12. 
    Na koje stanične strukture mikroorganizama utječu čimbenici sterilizacije i dezinfekcije?
13. 
    Koja je klasifikacija instrumenata, uređaja, metoda obrade i vrsta izloženosti za sterilizaciju i dezinfekciju?
14. 
    Koje su moderne tehnologije i oprema za sterilizaciju poznate?
15. 
    Koje metode se koriste za praćenje učinkovitosti sterilizacije i dezinfekcije?

TESTNI ZADACI

Molimo navedite točne odgovore:

1. Koje su hranjive podloge jednostavne?

A) Endo srednje

B) krvni agar

D) peptonska voda

2. Što je sterilizacija?

A) Potpuna sterilizacija predmeta od svih vrsta mikroba i njihovih spora

B) uništavanje patogenih mikroorganizama

C) uništavanje vegetativnih oblika mikroorganizama

D) sprječavanje ulaska mikroorganizama u ranu

D) uništavanje specifičnih vrsta mikroba na mjestima

3. Koji se faktori koriste u autoklaviranju?

Temperatura

B) filtri

D) pritisak

4. Koji se faktori koriste u Pasteur peći?

A) pritisak

B) suha toplina

D) antibiotici

5. Hranjive podloge prema namjeni dijele se na:

Jednostavan

B) izborni

B) tekućina

D) diferencijalna dijagnostika

D) prijevoz

6. S obzirom na čimbenike rasta mikroorganizme dijelimo na:

A) autotrofi

B) heterotrofi

B) auksotrofi

D) litotrofi

D) prototrofi

E) organotrofi

7. Optimalna temperatura za uzgoj većine patogenih mikroorganizama je:

8. Fizičke metode sterilizacije uključuju:

A) ultrazvuk

B) ultraljubičaste zrake

B) antibiotici

D) filtriranje

D) sterilizacija parom

E) sterilizacija suhom toplinom

9. Na rast bakterija utječu sljedeći uvjeti uzgoja:

B) pH okoline

B) temperatura

D) vlažnost okoline

D) faktori rasta

E) svi odgovori su netočni

10. Gustoća hranjivih podloga ovisi o sadržaju u njima:

A) natrijev klorid

B) pepton

B) agar-agar

D) saharoza

D) krvni serum

11. Mikrobi koji koriste izvore anorganskog ugljika i redoks reakcije za proizvodnju energije nazivaju se:

A) kemoorganotrofi

B) fotoorganotrofi

B) kemolitotrofi

D) kemoautotrofi

D) kemoauksotrofi

12. Navedite metode sterilizacije kojima se predmet oslobađa od spornih oblika mikroba:

A) ultraljubičasto zračenje

B) autoklaviranje

B) pasterizacija

D) suha toplina

D) gama zračenje

13. Rasporedite procese obrade laboratorijskih instrumenata pravilnim redoslijedom:

A) predsterilizacijsko čišćenjesterilizacija

B) predsterilizacijsko čišćenje, sterilizacijadezinfekcija

C) predsterilizacijsko čišćenjedezinfekcija-sterilizacija

D) dezinfekcijapredsterilizacijsko čišćenjesterilizacija

14. Skup mjera usmjerenih na uništavanje patogenih mikroorganizama naziva se:

A) asepsa

B) antiseptik

B) dezinfekcija

D) sterilizacija

D) tindalizacija

INFORMATIVNI MATERIJAL O TEMI LEKCIJE

Mikrobiološki pregled provodi se s ciljem izolacije čistih kultura mikroorganizama, njihovog uzgoja i proučavanja njihovih svojstava. Neophodan je u dijagnostici zaraznih bolesti, za određivanje vrste mikroba, u istraživačkom radu, za dobivanje otpadnih produkata mikroba (toksina, antibiotika, cjepiva i dr.). Za uzgoj mikroorganizama u umjetnim uvjetima potrebni su posebni supstrati - hranjivi mediji. Oni su osnova mikrobiološkog rada i određuju rezultate cjelokupne studije. Okruženje mora stvoriti optimalne uvjete za život mikroba.

ZAHTJEVI, PRIJEIZLAZI SRIJEDOM:

1. 
   Mora biti hranjiv, tj. sadržavati u lako probavljivom obliku sve tvari potrebne za zadovoljenje prehrambenih i energetskih potreba mikroorganizama.
2. 
   Imaju optimalnu koncentraciju vodikovih iona.
3. 
   Budite izotonični za mikrobnu stanicu.
4. 
   Budite sterilni.
5. 
   Budi mokar.
6. 
   Imaju određeni redoks potencijal.
7. 
   Budite što je moguće jedinstveniji.

Za učinkovito funkcioniranje višestaničnog organizma nužna je precizno usklađena interakcija između različitih bioloških molekula, supramolekulskih i substaničnih struktura, stanica i organa koji predstavljaju funkcionalno jedinstveni cjeloviti sustav. Fiziološke funkcije organa, organskog sustava i tijela u cjelini ne mogu obavljati izolirane specijalizirane stanice, a još više subcelularne tvorevine. Jedna od ključnih faza u evoluciji živih bića bilo je stjecanje sposobnosti makromolekula za reverzibilnu, specifičnu međumolekularnu interakciju, što je dovelo do promjene njihove funkcionalne aktivnosti, što je u konačnici unaprijed odredilo regulaciju fizioloških procesa na različitim razinama organizacije organizma. biološki sustav - molekularni, supramolekularni, subcelularni, stanični, organski i, konačno, , u tijelu kao cjelini. Biokemijski procesi u stanicama višestaničnog organizma usklađeni su i ujedno primjereni mogućnostima pojedine stanice, njezinoj sposobnosti da sudjeluje u radu cijelog organizma. Ova priroda staničnog ponašanja u višestaničnom organizmu posljedica je sposobnosti stanica da uđu u međustanične, matriksno-stanične i humoralno-stanične interakcije regulirane i iz stanice i iz tijela preko specijaliziranih struktura peptidne prirode - receptora. Međustaničnim, matriksno-staničnim i humoralno-staničnim međudjelovanjem od stanica različitih fizioloških specijalizacija nastaje funkcionalno jedinstvena struktura tkiva, organa i organizma u cjelini, u kojima se provodi koordinirana regulacija metaboličke aktivnosti, omogućujući im da obavljaju fiziološke funkcije svojstvene organu/organskom sustavu.

Strukture citoplazmatske membrane višestaničnog organizma tijekom evolucije nastale su na temelju već postojećih unutarstaničnih struktura peptidne prirode 1 . Modifikacija odgovarajućih gena i evolucijska selekcija osigurali su i očuvanje određenih domena proteinske molekule, nazvanih evolucijski konzervativnim, i pridonijeli nastanku novih dizajniranih za obavljanje specijaliziranih funkcija. Prisutnost evolucijski očuvanih domena u molekule peptidne prirode za različite funkcionalne svrhe značajan je, između ostalog, za regulaciju njihove funkcionalne aktivnosti prema zajedničkim načelima, zajedničkim utjecajima.

Domene molekule peptidne prirode, obogaćeni sumpornim ostacima u sastavu cisteina, pripadaju evolucijski konzervativnim komponentama molekularne strukture. Cisteinom obogaćene evolucijski očuvane domene nalaze se u sastavu izvanstaničnog i unutarstaničnog transporta, regulatornog, senzornog, egzekutivnog, strukturnog i drugih, prema njihovoj funkcionalnoj namjeni, molekule peptidne prirode

Receptorske tirozin kinaze imaju evolucijski očuvanu izvanstaničnu domenu obogaćenu cisteinskim ostacima. Sulfhidrilne skupine cisteinski ostaci u staničnoj površinskoj domeni receptora osjetljivi su na djelovanje oksidacijskih reagensa, što dovodi do stvaranja intramolekularnih i intermolekularnih disulfidne poprečne veze (veze), mijenjanje funkcionalnog statusa stanične površinske domene (na primjer, povećanje tropizma i/ili specifičnosti za agonist ili agoniste) i/ili pokretanje aktivnosti receptorske tirozin kinaze 2.

Ostaci sumpora u sastavu cisteinskih evolucijski očuvanih domena molekule peptidne prirode jedna su od najvažnijih točaka primjene čimbenika koji utječu na konformaciju molekule peptidne prirode 3 4 .

Mogućnost reverzibilnih, reguliranih promjena u konformaciji izvanstaničnih i unutarstaničnih molekule peptidne prirode(uključujući receptore, membranske transportere, ionske kanale, enzime i druge specijalizirane molekule peptidne prirode), zajedno s njihovom sposobnošću obavljanja fizioloških funkcija, učinili su konformacijske preraspodjele na razini tercijarnih i kvarternih struktura jednim od učinkovitih univerzalnih mehanizama za utjecaj na aktivnost različitih proteina, uključujući molekule odgovorne za međustanične, matriks-stanične, humoralno-stanične interakcije , ionska izmjena i supstrati, organizacija stanične strukture i njezina metabolička aktivnost 5 6 7

Regulacijski učinci na ostatke sumpora u cisteinu evolucijski očuvanih strukturnih i funkcionalnih domena molekule peptidne prirode izvanstanični i unutarstanični prostor određeni su, između ostalog, redoks okolišem. Redoks okolina odražava razinu omjera interkonvertibilnih oksidiranih i reduciranih specifičnih redoks parova. Redoks okolina koju tvore međusobno povezani redoks parovi u biološkim tekućinama izvanstaničnog prostora, citosola i staničnih organela određena je zbrajanjem redukcijskog potencijala u njima i redukcijskog kapaciteta tih redoks parova.

Redukcijski ekvivalenti prevladavaju iu unutarstaničnom prostoru i izvan stanice, ali je vrijednost njihovog omjera prema oksidirajućim oblicima izvan stanice i u nizu organela nešto niža od unutarstanične vrijednosti u citosolu. Kao rezultat toga, okolina koja okružuje stanice i okolina brojnih unutarstaničnih organela karakterizirana je većim oksidacijskim kapacitetom u usporedbi s citosolom 8 9 10

Funkcionalno aktivne konformacije molekula u unutarstaničnom i izvanstaničnom prostoru prilagođene su evolucijski utvrđenim značajkama redoks uvjeta. Kao što je gore navedeno, ostaci sumpora u sastavu cisteina imaju strukturne i regulatorne molekule peptidne prirode jedna su od najvažnijih točaka primjene efektorskih molekula koje provode redoks modulaciju. Cistein je koncentriran u evolucijski očuvanim domenama strukturnih i funkcionalnih molekula peptidne prirode. Cisteinski ostaci evolucijski očuvanih regulatornih, strukturnih, katalitičkih domena molekule peptidne prirode, čija redoks modulacija sumporne veze dovodi do promjene u konformaciji i/ili funkcionalnoj aktivnosti, nazivaju se "vrući cisteini". Sulfhidrilne skupine cisteina sudjeluju u većini reakcija u obliku merkaptidnog iona RS?. Merkaptidni ioni proteina su reaktivniji i lakše podložni oksidaciji nego nedisocirane sulfhidrilne skupine. Vrijednost pKa (konstanta ionizacije) SH skupina proteina uvelike varira i uvelike je određena njihovom interakcijom sa susjednim funkcionalnim skupinama u molekuli. Prisutnost pozitivno nabijene skupine u neposrednoj blizini SH skupine smanjuje njezinu konstantu ionizacije. Vrijednost pKa većine SH skupina u aktivnim mjestima enzima je približno 8,5 11 12. Stoga, pri fiziološkom pH u staničnom mikrookruženju i stanici (~7,4), postojeće sulfhidrilne skupine većine molekule peptidne prirode ostaju neionizirani zbog visoke pKa vrijednosti, pa su otporni na oksidaciju. “Vrući cisteini” evolucijski očuvanih domena okruženi su obližnjim pozitivno nabijenim skupinama, zbog čega se njihov pK a kreće od 4,7 do 5,4. Stoga je sulfhidrilna skupina u njihovom sastavu ionizirana čak i pri fiziološkom pH i lako je podložna oksidativnoj modifikaciji. Funkcionalno aktivna konformacija većine intracelularnog molekule peptidne prirode nastaje pri redukciji sumpornih ostataka u sastavu “vrućih cisteina” na sulfhidrilne skupine 13 14 15 16. Naprotiv, funkcionalno aktivna konformacija većine izvanstaničnih molekule peptidne prirode nastaje tijekom stvaranja disulfidne veze između sumpornih ostataka “vrućih cisteina” 17 18 19 20.

Reducirani (GSH) i oksidirani glutation (GSSG) predstavljaju jedan od glavnih biokemijskih parova bioloških prostora čija vrijednost omjera (GSH/GSSG) određuje vrijednost redoks potencijala odgovarajućeg fiziološkog prostora 21 22 . Fiziološki potrebnu vrijednost omjera GSH/GSSG reguliraju i formiraju odgovarajući biokemijski sustavi, prate molekularni redoks senzori u strukturi staničnih površinskih receptora, ionskih kanala, bioregulatora, enzima, citoplazmatskih membranskih transportera i dr. molekule peptidne prirode unutarstanični i izvanstanični prostor 23 24. Posljedica reakcije molekularnog redoks senzora na promjenu vrijednosti redoks potencijala je stvaranje regulacijskog signala koji utječe na biokemijske procese ili proces, staničnu reakciju ili reakcije 25 26, određujući, s jedne strane, stanični odgovor, a s druge strane, uspostavljanje fiziološki odgovarajuće vrijednosti redoks potencijala. U tom smislu, čimbenici koji utječu na omjer između reduciranog i oksidiranog glutationa (reaktivne vrste kisika 27, reaktivne vrste dušika 28 29 30, ugljikov monoksid 31, organski peroksidi 32) mogu modulirati biokemijske procese i stanične reakcije mijenjajući vrijednost redoks potencijal i omjer reduciranog/oksidiranog glutationa u sustavu.

Slike 2 i 3 na primjeru bioregulatora i njihovih receptora ilustriraju princip molekularnog mehanizma sudjelovanja sulfhidrilnih skupina evolucijski očuvanih domena koje sadrže cistein, reduciranog (GSH) i oksidiranog (GSSG) glutationa u kontroli funkcionalne aktivnosti molekule peptidne prirode izvanstanični prostor.

sl.2. Utjecaj uz sudjelovanje reduciranog glutationa (GSH) na disulfidne poprečne veze (veze) u strukturi funkcionalno aktivnih izvanstaničnih i/ili njihovih staničnih površinskih receptora dovodi do stvaranja skupa molekula čija konformacija ograničava njihove fiziološki primjerene interakcije.

sl.3. Utjecaj na sulfhidrilne (SH) skupine u strukturi funkcionalno neaktivnih izvanstaničnih stanica bioregulatori peptidne prirode i/ili njihovih staničnih površinskih receptora, uzrokovano smanjenjem redoks potencijala zbog povećanja količine oksidiranog glutationa (GSSG), dovodi do stvaranja skupa molekula čija je konformacija primjerena prirodi situacijski određenih fizioloških interakcije.

Treba napomenuti da su reaktivne vrste kisika, reaktivne vrste dušika i organski peroksidi sposobni izravno provesti oksidativnu modifikaciju sulfhidrilnih skupina u sulfenate. Međutim, fiziološka priroda takvog učinka bit će ostvarena ako se nakon stvaranja sulfenata uz sudjelovanje GSH formira miješani disulfid s glutationom (reakcija glutationilacije), a zatim se provede uređeni enzimski proces kako bi se formirao točan disulfid umrežiti ili smanjiti ostatke sumpora u sastavu cisteina 33. U protivnom može doći do nepovratne oksidacije ostatka sumpora u cisteinu u cistin sulfonsku kiselinu (Cys-SO 3 H) i, kao rezultat toga, gubitka sposobnosti regulacije funkcije proteina.