Suvremeni problemi znanosti i obrazovanja. Metode za procjenu apoptoze Markeri apoptoze

Pregledano je 45 djece u dobi od 3 do 15 godina. Svrha istraživanja bila je utvrditi spremnost za apoptozu limfocita i neutrofila periferne krvi određivanjem markera apoptoze - CD95, CD95L, BSL2. Pri procjeni apoptoze imunokompetentnih stanica utvrđeno je smanjenje spremnosti limfocita za programiranu staničnu smrt i povećanje broja neutrofilnih granulocita. Najizraženije promjene bilježe se u dobnoj skupini od 7-15 godina sa stažom bolesti dužim od 3 godine. Dobiveni podaci mogu biti znak supresije programirane smrti autoreaktivnih limfocita u tkivu gušterače, što doprinosi produljenju imunološkog odgovora. Povećanje udjela leukocitnih stanica koje izražavaju CD95L može pridonijeti povećanom procesu programirane stanične smrti u β stanicama otočića gušterače infiltriranih imunokompetentnim stanicama.

apoptoza neutrofila

apoptoza limfocita

dijabetes melitus tipa 1

1. Pekareva E. V. Markeri apoptoze u bolesnika sa šećernom bolešću tipa 1 na početku bolesti / E. V. Pekareva i sur. // Diabetes mellitus. – 2009. – br. 4. – str. 86-89.

2. Pekareva E. V. Uloga apoptoze u patogenezi dijabetes melitusa tipa 1 / E. V. Pekareva, T. V. Nikonova, O. M. Smirnova // Diabetes mellitus. – 2010. – Broj 1. – Str.45-48.

3. Adeghate E. Ažuriranje etiologije i epidemiologije dijabetes melitusa / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. – Vol. 1084. – P. 1–29.

4. Klinički značaj apoptoze neutrofila u perifernoj krvi bolesnika sa šećernom bolešću tipa 2 / S. Sudo i sur. // Lab Hematol. 2007.; 13(3):108-12 (reducirano).

5. Filep J. G. Apoptoza neutrofila: cilj za poboljšanje razlučivanja upale / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. – 2009. – God. 108. – P. 1039–1046.

6. Odgovori ljudskih polimorfonuklearnih neutrofila na Burkholderia pseudomallei u zdravih i dijabetičara / S. Chanchamroen i sur. // Infect Immun. – 2009. – God. 77. – P. 456–463 (apoptoza je smanjena).

7. Utjecaj apoptoze limfocita na dijabetes melitus / K. A. Awadhesh i sur. // Azijski časopis medicinskih znanosti. – 2011. – br. 2. – str. 1-6.

8. Upala je postojanija kod miševa s dijabetesom tipa 1 / D. T. Graves i sur. // J. Dent. Res., 2005. – Vol. 84. – Str. 324–328.

9. Juliana C. Alves Infekcije u bolesnika sa šećernom bolešću: pregled patogeneze / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – ožujak 2012. – Dodatak l1. – Broj 16. – S. 27–36.

10. Luo H. R. Konstitutivna apoptoza neutrofila: mehanizmi i regulacija / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. – 2008. – God. 83. – P. 288–295.

Uvod

Dijabetes melitus tipa 1 (T1DM) je poligena, multifaktorijalna bolest povezana sa stvaranjem autoantitijela i autoreaktivnih T limfocita na β stanice gušterače.

Vodeće karike u patogenezi autoimunih lezija su disregulacija imuniteta i programirana stanična smrt.

Kontrolirana apoptoza danas se smatra glavnim mehanizmom za održavanje optimalne ravnoteže stanica na mjestu upale, ograničavanje širenja aktiviranih klonova i sprječavanje razvoja autoimunih reakcija. Ako dođe do kvara u njegovoj provedbi, aktivirane imunološke stanice se mogu akumulirati, što dovodi do pojave autoimunih bolesti.

Svrha studije: istraživanje aktivacijskih markera apoptoze CD95, CD95L, Bsl2 na limfocitima periferne krvi i neutrofilima u dijabetes melitusu tipa 1 u djece.

Materijal i metode istraživanja

Provedeno je ispitivanje 45 djece sa šećernom bolešću tipa 1 u dobi od 3-15 godina. I. skupinu činilo je 20 djece u dobi od 3-6 godina (predškolska djeca), II. skupinu - 12 djece od 7-15 godina (školska djeca) s trajanjem bolesti kraćom od 3 godine, III. skupinu - 13 djece u dobi od 7-15 godina (školska djeca) s iskustvom bolesti više od 3 godine. Kontrolnu skupinu činilo je 30 zdrave djece u dobi od 3-6 (15) i 7-15 (15) godina. Studija je provedena na temelju endokrinološkog odjela Dječje gradske kliničke bolnice nazvane. G. K. Filippsky, Stavropol.

Za procjenu programirane stanične smrti detektiran je broj limfocita i neutrofilnih granulocita koji eksprimiraju markere apoptoze. Limfociti su izolirani na Ficoll-Paque gradijentu gustoće, neutrofili - na dvostrukom gradijentu gustoće Ficoll-Paque i Ficoll-urografin (GE Healthcare, Švedska). Stanična suspenzija je isprana tri puta u mediju RPMI-1640 (Vector-Best, Rusija). U kulturama limfocita i neutrofila broj stanica koje eksprimiraju CD95, CD95L, Bsl2 procijenjen je protočnom citometrijom pomoću monoklonskih protutijela (Invitrogen, SAD).

Za statističku analizu podataka korišten je programski paket “Primer of Biostat 4.0”, Attestat 10.5.1.” Za procjenu međugrupnih razlika korištena je analiza varijance ponovljenih mjerenja uz izračun Newman-Keuls i Dunn testova.

Kvantitativne vrijednosti su bile nenormalno raspoređene i prikazane su kao medijan i interkvantilni (25. i 75. percentil) raspon (Me (Q1-Q)). Razlike na str<0,05.

Rezultati i njihova rasprava

Rad je otkrio smanjenje broja limfocita koji eksprimiraju Fas receptore (CD95) u bolesnika svih skupina u usporedbi sa zdravom djecom (Tablica 1). Minimalni pokazatelji uočeni su kod djece od 7 do 15 godina s iskustvom bolesti više od 3 godine (Tablica 1).

stol 1

Pokazatelji apoptoze limfocita u djece sa šećernom bolešću tipa 1

*- str<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- str<0,05 - по сравнению с группой

Pri procjeni razine ekspresije anti-apoptotskih markera (Bsl2), otkriveno je njegovo povećanje u limfocitima djece svih skupina, izraženije u školske djece s trajanjem bolesti od više od 3 godine, što također ukazuje na kršenje Fas- ovisna apoptoza u djece sa šećernom bolešću tipa 1, što dovodi do usporavanja procesa stanične smrti autoreaktivnih oblika limfocita.

Naši rezultati mogu biti neizravan znak supresije programirane smrti aktiviranih limfocita u tkivu gušterače, što doprinosi produljenju imunološkog odgovora.

Razina apoptotičke spremnosti limfoidnih stanica ovisi o trajanju bolesti i smanjuje se u djece s T1DM dulje od 3 godine.

Prethodno je pokazano da u dijabetes melitusu postoji otpornost limfocita na apoptozu, što može objasniti prirodu i trajanje autoimunog odgovora.

U kulturi limfocita djece sa šećernom bolešću utvrđeno je povećanje postotka limfocita s ekspresijom CD95L (tablica 1) u odnosu na skupinu zdrave djece. Najviše stope utvrđene su u djece od 7 do 15 godina s bolešću od više od 3 godine (Tablica 1).

Poznato je da su kod T1DM otočići gušterače infiltrirani imunološkim stanicama koje proizvode širok raspon citokina, što je popraćeno nenormalnom ekspresijom membranskih receptora. Pod utjecajem povećanih koncentracija glukoze i citokina, β-stanice počinju eksprimirati CD95 na svojoj površini, kojeg inače praktički nema.

Povećana ekspresija CD95L na limfoidnim stanicama može pridonijeti izraženijem apoptotičkom procesu u β-stanicama gušterače i njihovom kasnijem uklanjanju.

Posljednjih godina pokazalo se da neutrofilni granulociti aktivno sudjeluju u nastanku autoimune upale. Reakcija neutrofila usmjerena na lokalizaciju i eliminaciju autoantigena uvelike ovisi o snazi ​​i trajanju antigenskog učinka na imunološki sustav, kao io početnoj razini funkcionalne aktivnosti stanica.

Utvrdili smo da je tijek šećerne bolesti u djece popraćen povećanjem postotka neutrofila koji eksprimiraju markere apoptoze (CD95) i smanjenjem udjela stanica s antiapoptotskim proteinima Bsl2 na svojoj površini (Tablica 2).

tablica 2

Pokazatelji apoptoze neutrofila u djece sa šećernom bolešću tipa 1

*- str<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- str<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keuls test, Dunn test).

Uz usporedne međugrupne karakteristike, maksimalne vrijednosti CD95 (str<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

Utvrđen je porast postotka polimorfonuklearnih leukocita s CD95L na površini. Najviše stope zabilježene su kod školske djece s poviješću bolesti duljom od 3 godine.

Rezultati istraživanja apoptoze PMN-a u dijabetes melitusu prikazani u literaturi su kontradiktorni. Postoje dokazi o povećanju stope apoptoze neutrofila periferne krvi u T1DM i T2DM.

Međutim, brojne studije su otkrile smanjenje apoptoze neutrofilnih granulocita u bolesnika s dijabetesom tipa 1, osobito u uvjetima hiperglikemije, koja vjerojatno inicira procese kronične upale s oštećenjem tkiva, a također predisponira produljene bakterijske infekcije u bolesnika s tipom 1. 1 dijabetes.

Naši rezultati sugeriraju da bolesnici s T1DM imaju povećanu predispoziciju PMN-a za apoptozu, što može biti manifestacija zaštitne reakcije usmjerene na eliminaciju “viška” aktivnih neutrofila, čije stvaranje povećava oštećenje tkiva.

Povećanje apoptotičkog potencijala neutrofilnih granulocita odraz je aktivnog sudjelovanja PMN-a u imunopatogenezi bolesti.

Povećana ekspresija CD95L na neutrofilnim granulocitima u bolesnika s dijabetesom vjerojatno može pridonijeti eliminaciji ne samo stanica gušterače, već i njihovih vlastitih stanica leukocita.

Tako je pri procjeni apoptoze imunokompetentnih stanica u djece sa šećernom bolešću tipa 1 utvrđeno smanjenje spremnosti limfocita za programiranu staničnu smrt i povećanje polimorfonuklearnih leukocita.

Najizraženije promjene bilježe se u dobnoj skupini od 7-15 godina sa stažom bolesti dužim od 3 godine. U djece svih skupina otkriveno je povećanje udjela leukocitnih stanica koje izražavaju CD95L na svojoj površini.

Poznato je da su PMN poveznica između urođene i adaptivne imunosti i imaju vodeću ulogu u antibakterijskoj zaštiti.

Povećanje njihove apoptotičke aktivnosti može uzrokovati djetetovu nisku dobnu otpornost i osjetljivost na zarazne bolesti.

Smanjenje broja limfoidnih stanica osjetljivih na indukciju apoptoze neizravan je znak supresije programirane stanične smrti i poremećene eliminacije aktiviranih oblika limfocita.

zaključke

1. U djece oboljele od dijabetes melitusa tipa 1 dolazi do smanjenja spremnosti za apoptozu limfocita periferne krvi, povećanja neutrofilnih granulocita, što je popraćeno promjenom ekspresije CD95 i Bsl2 i ovisi o trajanju bolest.

2. Povećana ekspresija CD95L na limfocitima i neutrofilnim granulocitima u T1DM može pridonijeti povećanom procesu programirane stanične smrti u β-stanicama otočića gušterače infiltriranih imunokompetentnim stanicama.

Recenzenti:

Shchetinin E.V., doktor medicinskih znanosti, profesor, prorektor za znanstveni i inovacijski rad Državnog medicinskog sveučilišta St., voditelj Odsjeka HBO visokog stručnog obrazovanja "Stavropol State Medical University" Ministarstva zdravstva Ruske Federacije , Stavropol.

Golubeva M.V., doktor medicinskih znanosti, profesor, voditelj Odjela za dječje zarazne bolesti Visoke stručne obrazovne ustanove HBO "Stavropol State Medical University" Ministarstva zdravstva Ruske Federacije, Stavropol.

Bibliografska poveznica

Apoptoza je programabilni, genetski posredovan oblik stanične smrti, u kojem vanjski ili unutarnji signali daju impuls stanici da formira ili aktivira enzime koji je vode do samouništenja. Morfološki, apoptozu karakterizira skupljanje stanice, kondenzacija i fragmentacija jezgre, destrukcija citoskeleta i bulozna protruzija stanične membrane. Značajka apoptoze je da umiruća stanica održava cjelovitost svoje membrane do završetka procesa, a tek tada je uništenje njezine membrane signal za obližnje fagocite da apsorbiraju preostale fragmente i dovrše proces stanične degradacije. Apoptotične stanice koje ne prolaze trenutnu fagocitozu postaju mali, membranski vezani fragmenti koji se nazivaju "apoptotička tijela". Važna značajka apoptoze je da se uklanjanje umirućih stanica odvija bez razvoja upale.

Apoptoza ima važnu ulogu u fiziološkim procesima: organogenezi, embrionalnom razvoju, regulaciji sastava i broja staničnih populacija u tkivima odraslog organizma, raznim hormonalnim promjenama u tijelu. Uloga apoptoze također je važna u različitim patološkim procesima. Najpotpunije je istražen kod rasta tumora.

Proces apoptoze može se podijeliti u dvije faze:

· formiranje i provođenje apoptotičkih signala – faza odlučivanja;

· razgradnja staničnih struktura – efektorska faza.

Provedba mehanizama apoptoze povezana je s aktivacijom endogenih staničnih enzima - cisteinskih proteaza (kaspaza). Kaspaze su u stanicama u neaktivnom stanju (prokaspaze). Aktivacija se događa njihovim proteolitičkim cijepanjem i naknadnom dimerizacijom uz stvaranje aktivnih podjedinica. Ciljevi kaspaza su proteini odgovorni za različite vitalne funkcije stanice. Trenutno je opisano 14 vrsta kaspaza koje se prema svojim funkcionalnim karakteristikama mogu podijeliti u 3 skupine:

aktivatori citokina (kaspaze 1, 4, 5, 13)

kaspaze - induktori aktivacije efektorskih kaspaza (kaspaze 2, 8, 9, 10)

· efektorske kaspaze - izvršitelji apoptoze (3, 6, 7)

Jedan od membranskih staničnih receptora odgovornih za mehanizme apoptoze je protein koji se zove Fas receptor (CD95/APO1). Ligand za Fas receptor je protein Fas ligand (Fas-L), koji pripada obitelji tumor-nekrotičnih čimbenika i može biti predstavljen ili u obliku membranskog proteina ili u topljivom obliku. Vezanje Fas receptora na Fas ligand dovodi do aktivacije mehanizama apoptoze uz aktivaciju induktora kaspaze. S naknadnom aktivacijom efektorskih kaspaza započinje lanac proteolitičkih reakcija, čija je svrha apoptotičko "rastavljanje" stanice: fragmentacija DNA, izravno cijepanje staničnih strukturnih proteina, disregulacija sinteze proteina. Dakle, sudjelovanje efektorskih kaspaza u apoptozi dovodi do rupture apoptotičke stanice s okolnim stanicama, reorganizacije citoskeleta, smanjene sposobnosti popravka i replikacije DNA, rupture jezgrene membrane i razaranja DNA, otpuštanja signala koji označavaju stanicu za apoptoza, i rastavljanje stanice na apoptotička tijela. Nije slučajnost da se efektorske kaspaze nazivaju "dželatove kaspaze".

Metode proučavanja apoptoze vrlo su raznolike. U početku, najčešći način određivanja apoptoze bila je elektroforeza ekstrahirane frakcije DNA, koja omogućuje identifikaciju diskretnosti DNA niske molekulske mase po molu. mase (kao rezultat internukleosomske razgradnje DNA). U morfološkim istraživanjima za detekciju loma DNA koristi se TUNEL metoda koja se temelji na stvaranju umetaka obilježenih oligonukleotida na mjestima loma DNA čiju tvorbu katalizira enzim TdT.

Trenutno se sve više koriste metode temeljene na protočnoj citometriji za bilježenje apoptoze limfocita. U ovu skupinu spada metoda koja se temelji na otkrivanju gubitka dijela DNA stanicama (hipodiploidnim stanicama) pomoću fluorescentne boje - propidijevog jodida, koja je opisana u nastavku. Za određivanje apoptoze koriste se i druge metode temeljene na protočnoj citometriji. Apoptoza limfocita može se detektirati u ranim fazama pomoću aneksina V obilježenog fluorokromom, koji se veže na fosfatidilserin koji se pojavljuje na membrani stanica koje prolaze kroz apoptozu. Približna ideja o "sklonosti" limfocita razvoju apoptoze može se dobiti određivanjem ekspresije Fas receptora (CD95) na njihovoj površini iu mitohondrijima protonkogena bcl-2.

Klinički značaj procjene apoptoze tijekom kliničkog i imunološkog pregleda bolesnika je nedvojben, budući da je njezino oštećenje povezano s nizom bolesti. Do slabljenja apoptoze dolazi zbog nastanka autoimunih bolesti (zbog poremećaja procesa uništavanja autospecifičnih klonova limfocita). Stoga bilježenje slabljenja apoptoze može poslužiti kao izvor informacija o patogenetskim mehanizmima takvih autoimunih bolesti kao što su sistemski eritematozni lupus, reumatoidni artritis, kao i autoimuni limfoproliferativni sindrom koji se temelji na mutacijama gena koji određuju receptore apoptotskih signala. . Poremećena apoptoza je važan mehanizam u razvoju malignih procesa. U tumorskim stanicama često se detektira mutacija gena p53, koji kodira protein koji osjeća signal o prisutnosti nepopravljenih prekida DNA i kromosomskih mutacija, što dovodi do razvoja apoptoze. Kao rezultat toga, genetski neispravne stanice se ne odbacuju i postaju izvor stvaranja tumora.

U nizu drugih bolesti, naprotiv, opaža se povećanje apoptoze. To se događa u infektivnim procesima (masivna apoptoza T stanica često je uzrokovana mikrobnim superantigenima), sepsi i raznim virusnim bolestima, uključujući AIDS. Apoptoza je pojačana kod brojnih bolesti krvi i primarnih imunodeficijencija, kada je uzrokovana nedovoljnom proizvodnjom čimbenika preživljavanja stanica, čiju ulogu imaju citokini. Dakle, u jednom od oblika teške kombinirane imunodeficijencije povezane s mutacijom gena IL-7 ili zajedničkog γ-lanca citokinskih receptora, dolazi do smrti limfoidnih prekursora zbog nedostatka IL-7.

Međutim, općenito najvažnija je procjena "aktivirane apoptoze", kojoj prolaze limfociti kada su stimulirani mitogenima. Činjenica je da je apoptoza, uz proliferaciju, oblik odgovora limfocita na aktivacijski podražaj. U ranim fazama diferencijacije prevladava apoptotski odgovor, a njegov rezultat je stvaranje tolerancije na antigen induktor. Zreli limfociti na stimulaciju odgovaraju pretežno proliferacijom (koja je početni stadij i preduvjet za razvoj imunološkog odgovora), ali ostaje određena vjerojatnost njihovog ulaska u aktivacijsku apoptozu. Budući da apoptoza djeluje kao procesna alternativa proliferaciji, njihov omjer može poslužiti kao mjera učinkovitosti odgovora stanica na aktivacijske signale. Što je veći doprinos apoptoze odgovoru limfocita na mitogen, to će antigen-specifična imunološka obrana biti manje učinkovita. Stoga je određivanje apoptoze tijekom aktivacije limfocita mitogenima najinformativnije, uz paralelnu procjenu proliferativnog odgovora stanica na isti podražaj.

Tijekom procesa apoptoze u stanici se odvija složen lanac reakcija na molekularnoj razini koji dovodi do promjena u metaboličkim procesima i fenotipskim karakteristikama stanica. Te se promjene mogu odrediti biokemijskim, mikroskopskim ili citometrijskim metodama i koriste se kao markeri apoptoze.

Jedan od ranih markera apoptoze je pojava na citoplazmatskoj membrani stanice. aneksinski receptori. U apoptotičnim stanicama, fosfolipid fosfatildiserin (PD) je preusmjeren i lokaliziran na površini stanične membrane. Lokalizacija PS na površini membrane promatra se počevši od
rani stadij apoptoze prije potpune stanične degradacije. rekombinantni-
ny protein aneksin V (35-36 kDa), koji ima visok afinitet
otpornost na PS u prisutnosti iona Ca +2. Kontaktiranje FS-a na površini
ty stanica, aneksin V, konjugiran na fluorokrom, služi
marker apoptoze. Aneksin V se obično koristi u kombinaciji s
propidij jodid (PI), koji omogućuje istovremeno prepoznavanje
intaktne stanice (i aneksin V i PI negativne), stanice
su u "ranoj" apoptozi (aneksin V pozitivni,
negativan na PI), te stanice u kasnoj apoptozi ili
kod nekroze (pozitivan i na aneksin V i na PI).

CD95 Fas ili APO-1 je transmembranski glikoprotein (45 kDa) koji je član obitelji receptora faktora nekroze tumora (TNF-α). Antigen CD95 eksprimira se u značajnim količinama na timocitima, CD4 + , CD8 + limfocitima periferne krvi, au manjoj mjeri na B limfocitima i NK stanicama. Ovaj antigen također se eksprimira na granulocitima i monocitima, ali se ne nalazi na trombocitima i eritrocitima. CD95 receptor također se opaža na stanicama normalnih tkiva i tumora. Vezanje CD95 s Fas ligandom (Fas-L, CD95L) inducira apoptozu u stanicama koje ga eksprimiraju. Monoklonska protutijela na CD95 omogućuju identifikaciju populacije stanica spremnih za apoptozu pomoću protočne citometrije ili fluorescentne mikroskopije.

CD95L (Fas-L)– nazvan Fas ligand, je membranski protein (40 kDa). Postoji i topljivi oblik CD95L (sFas-L), koji je protein (26 kDa) iz obitelji (TNF-α) receptora. Ovaj antigen eksprimiraju citotoksični E limfociti i NK stanice, a otkriven je i na mnogim tumorskim stanicama. Vezanje Fas-L na CD95 receptor inducira proces apoptoze u ciljnim stanicama. Monoklonska protutijela na CD95L omogućuju identifikaciju populacije stanica spremnih za apoptozu pomoću protočne citometrije ili fluorescentne mikroskopije.

Bcl-2– protein (26 kDa), čija prekomjerna ekspresija blokira apoptozu. Bcl-2 je intracelularni protein lokaliziran na mitohondrijima, stoga je za njegovo otkrivanje pomoću monoklonskih protutijela potrebno izvršiti prethodnu permeabilizaciju stanične membrane.

Kraj posla -

Ova tema pripada odjeljku:

Metode procjene imunološkog statusa - udžbenik za studente medicinskih, pedijatrijskih i medicinsko-profilaktičkih fakulteta.

Državno medicinsko sveučilište Kursk Federalna agencija za zdravstveni i socijalni razvoj. Odjel za kliničku imunologiju i alergologiju..

Ako trebate dodatne materijale o ovoj temi ili niste pronašli ono što ste tražili, preporučamo pretraživanje naše baze radova:

Što ćemo učiniti s primljenim materijalom:

Ako vam je ovaj materijal bio koristan, možete ga spremiti na svoju stranicu na društvenim mrežama:

Sve teme u ovom odjeljku:

Imunološki status i metode za njegovu procjenu
Imunološki status (IS) skup je laboratorijskih parametara koji karakteriziraju kvantitativnu i funkcionalnu aktivnost stanica imunološkog sustava. IP pokazatelji su visoki

Objekti i metode imunoloških istraživanja
Objekti istraživanja Metode istraživanja Fenotipske karakteristike imunokompetentnih stanica Protočna citofluorometrija Imm

Limfociti
Kao dio stanica imunološkog sustava, pravi imunociti su sve varijante limfocita. Ostale vrste leukocita (neutrofili, eozinofili, bazofili, monociti), makrofagi, trombociti, mastociti

MFS ćelije
Monociti periferne krvi i tkivni makrofagi potječu od pluripotentnih matičnih stanica. Jednom kada uđu u krvotok, monociti se talože u tkivima unutar 2-3 dana, gdje se pretvaraju u tkivo

Antimikrobni sustav ovisan o kisiku
mehanizmi baktericidnosti ovisni o kisiku glukoza + NADP+ → pentoza fosfat + NADPH Citokrom b245 NADP + O2 ͛

Medijatorske stanice
Granulociti su polimorfonuklearni leukociti koji cirkuliraju krvlju i nastaju, poput stanica monocita-makrofaga, iz mijeloične matične stanice u koštanoj srži. Postoje tri vrste granua

Metode imunofenotipizacije limfocita
Pri proučavanju limfocita procjenjuje se njihov broj u perifernoj krvi i funkcionalna aktivnost. Određivanje broja stanica provodi se uzimajući u obzir antigene diferencijacije na i

Izolacija mononuklearne stanične frakcije
Metoda izolacije mononuklearnih stanica temelji se na različitom uzgonu različitih krvnih stanica. Korištenje gradijenta određene gustoće omogućuje izdvajanje mononuklearnih stanica (limfocita, monocita, krvnih stanica)

Protočna citometrija
Metoda protočne citometrije temelji se na mjerenju optičkih svojstava stanica. Stanice se uvode pojedinačno u laminarni tok u kvarcnoj protočnoj ćeliji, gdje prolaze kroz fokusirano svjetlo

Metoda neizravne imunofluorescencije
Indirektna imunofluorescencija je metoda koja se temelji na korištenju monoklonskih protutijela obilježenih fluorokromom, procjenjujući rezultate uzimajući u obzir specifičnu luminiscenciju stanica tijekom luminiscentne mikroskopije

Imunocitokemijska metoda
Imunocitokemijske metode temelje se na upotrebi enzima kao što su peroksidaza i alkalna fosfataza. Trenutno se najčešće koristi metoda PA (peroksidaza-antiperoksidaza), sv.

Metode proučavanja funkcionalne aktivnosti limfocita
Funkcionalna aktivnost limfocita procjenjuje se sljedećim učincima: sposobnošću prepoznavanja antigena, aktivacijom, proliferacijom i diferencijacijom stanica. Sposobnost prepoznavanja limfocita

Reakcija blast transformacije limfocita
Kontakt limfocita sa stranim antigenom ili nespecifičnim mitogenom praćen je reakcijom aktivacije i blast transformacije (BTLR), tj. proliferacija stanica s prijelazom malih limfocita u blast

Mješovita kultura limfocita
Kokultiviranje limfocita koji imaju MHC-II molekule različitih haplotipova uzrokuje njihovu blast transformaciju i proliferaciju. Stanice koje odgovaraju pripadaju T-limfocitima i stimulirane su stranim

Proteini krvne plazme
Više od dvije stotine proteina prisutno je u ljudskoj plazmi, od kojih je većina izolirana i opisana strukturno i funkcionalno. Proteini plazme pretežno su zastupljeni glikoproteinima. S elektrofotom

Globulini
α1-antitripsin je α1-globulin koji čini više od 80% aktivnosti antiproteaze u serumu i glavna je komponenta α-pojasa. U sirutki soda

Globulini
Haptoglobin ima poluživot od 2-4 dana. Normalan sadržaj haptoglobina u serumu je 0,3 - 2,0 g/l. Njegov glavni funkcionalni značaj je vezanje slobodnog hemoglobina u serumu

Metode elektroforeze proteina
Elektroforeza se široko koristi za semikvantitativno određivanje proteina u serumu i za detekciju paraproteina. Elektroforeza se izvodi serumom, a ne plazmom, dakle

Imunoglobulini
Imunoglobulini (Ig) su specifični proteini koje proizvodi imunološki sustav kao rezultat reakcije na strane antigene i nakupljaju se u krvnom serumu i drugim biološkim tekućinama

Ljudski imunoglobulini
Svojstvo IgM IgG IgA IgD IgE Molekulski oblik Pentamer

Metode određivanja imunoglobulina
Za kvantitativno određivanje sadržaja Ig različitih klasa u krvnom serumu i drugim biološkim tekućinama naširoko su korištene različite mogućnosti postavljanja reakcije taloženja u gelu.

Paraproteini
Paraproteini su imunoglobulini ili njihovi fragmenti koje proizvode plazma stanice izvedene iz jedne specifične stanične linije B limfocita (monoklon). Paraproteini često zakažu

Krioglobulini
Krioglobulini su patološki proteini plazme (10-80 mg/ml), koji imaju svojstvo pretvaranja u želatinasto stanje na temperaturama ispod 37°C. Većina krioglobulina su poliklonski kompleksi

Metode određivanja imunoloških kompleksa
Vezanje Ig na antigen je fiziološki proces koji dovodi do stvaranja imunoloških kompleksa (IC) čiji je cilj eliminacija antigena iz tijela. Međutim, pod određenim uvjetima

Određivanje autoantitijela u dijagnostici sistemskih bolesti vezivnog tkiva
Prema suvremenim konceptima, autoimunost se odnosi na stanja u kojima se u tijelu pojavljuju antitijela ili senzibilizirani limfociti protiv normalnih antigena vlastitih tkiva.

Glavni serološki markeri autoimunih bolesti
Antigen Izvorni naziv Molekularna struktura Funkcija Dijagnostička vrijednost

Određivanje ANA u reakciji neizravne imunofluorescencije
U tipičnom testu, pacijentov serum se inkubira s antigenskim supstratima (životinjsko jetreno ili bubrežno tkivo, Hep-2 stanična kultura) kako bi se specifično vezale prisutne tvari.

Neizravna imunofluorescencija
Karakter luminiscencije Specifičnost antigena Klinički značaj Periferna ili marginalna dsDNA, l

Određivanje ANA i ENA ELISA testom na čvrstoj fazi
Test sustav za ELISA ANA (UBI MAGIWELL) - za analizu probira na antinuklearna protutijela omogućuje semikvantitativno određivanje širokog spektra protutijela na kompleks apsorbiran u jažicama

Autoimune bolesti
Vrsta patologije Rezultati imunološkog istraživanja. Vrsta antitijela i njihova učestalost (%)

Citokinski sustav
Citokini su klasa topivih peptidnih medijatora imunološkog sustava neophodnih za njegov razvoj, funkcioniranje i interakciju s drugim tjelesnim sustavima. Oni definiraju

Interleukini
IL-1 je imunoregulacijski medijator koji se oslobađa tijekom upalnih reakcija, lezija tkiva i infekcija (proupalni citokin). IL-1 stimulira proliferaciju i diferencijaciju

Interferoni
Interferon (IFN) je otkriven kao protein s antivirusnim djelovanjem. Antivirusni učinak IFN-a je zbog njegove sposobnosti da spriječi unutarstaničnu replikaciju virusa u fazi

Čimbenici nekroze tumora
Čimbenik tumorske nekroze (TNF) glavni je posrednik koji proizvodi tijelo kao odgovor na gram-negativne bakterije. Djelatna tvar gram-negativnih bakterija je LPS, sastavni dio staničnog sustava.

Čimbenici koji stimuliraju kolonije
Brojni citokini koji nastaju tijekom razvoja imunološkog odgovora imaju stimulativni učinak na diferencijaciju prekursora koštane srži. Ovi citokini nazivaju se citokinima koji stimuliraju kolonije.

Faktori rasta
Transformirajući faktor rasta (TGFβ) je obitelj srodnih peptida s višestrukim učincima na opće procese koji reguliraju rast i morfogenezu. TGFβ - glavni citokin

Metode određivanja citokina
Određivanje sadržaja citokina u različitim biološkim tekućinama od velike je važnosti u procjeni funkcionalne aktivnosti imunokompetentnih stanica i regulaciji imunološkog odgovora. Odvojenim riječima

Sustav komplementa
Sustav komplementa je kompleks proteina krvnog seruma sposobnih za samoorganiziranje i posredovanje u reakcijama humoralne imunosti i fagocitoze. Trenutno je poznato da

Metode određivanja aktivnosti komplementa
Ukupna aktivnost (titar) komplementa određuje se u reakciji hemolize pomoću ovčjih eritrocita. Komplement sadržan u ispitivanom serumu uzrokuje hemolizu kod senzibiliziranih ovaca

Titar komplementa pri 50% HE
Hemoliza, % K Hemoliza, % K Hemoliza, % K Hemoliza, % K

Određivanje komponenti komplementa
Za određivanje komponenti komplementa koriste se ELISA i turbidimetrijska metoda, čija je provedba opisana u uputama priloženim dijagnostičkim testnim sustavima. U kliničkoj praksi

Komponente komplementa
Komponenta komplementa Kliničke manifestacije Nedostatak C1 Obično ne uzrokuje klinički značajne poremećaje, jer jede

Metode proučavanja fagocitne aktivnosti granulocita
Najvažnija karakteristika funkcije granulocita je procjena njihove fagocitne aktivnosti. Njegovo smanjenje može biti rezultat nedostatka opsonizirajućih čimbenika u serumu (protutijela, komplement

NST test
Nitroplavi tetrazolijski test (NBT test) koristi se za identifikaciju takozvanih aktiviranih granulocita i monocita. Aktivacija fagocita temelji se na oštrom povećanju oksidativnih reakcija

Metodologija istraživanja
Potrebni reagensi i materijali: KN 42 OPO 44 0, Na 42 OPO 44 0, NaCI, glukoza, nitroplavi tetrazolij, heparin, metilni alkohol, 1% vodena otopina metilenskog zelenila (u slučaju

Određivanje mijeloperoksidaze
Mijeloperoksidaza oksidira niz supstrata (benzidin, ortofenildiamin) u prisutnosti vodikovog peroksida, što je popraćeno reakcijom boje. Mijeloperoksidaza je enzim sadržan u granulama faga

Kemiluminiscencija
Spontana luminiscencija koja se javlja tijekom kemijskih reakcija zbog energije reagirajućih tvari naziva se kemiluminiscencija (CL). On je svojstven svim tkivima i stanicama živog organizma, sve dok sadrže

Određivanje sadržaja IgE
Među imunološkim metodama za procjenu nespecifičnih parametara imunološkog statusa u većini atopijskih bolesti od najveće je važnosti određivanje količine ukupnog IgE. Međutim, slažem se

Test degranulacije bazofila
U alergičnih bolesnika značajan dio IgE vežu različiti leukociti preko svojih Fc receptora. Prisutnost stanica koje nose antitijela ukazuje na njihovu osjetljivost na odgovarajući alergen. B

Test stimulacije bazofilnog staničnog antigena - CAST
U slučaju alergijskih reakcija posredovanih IgE, mehanizam pokretanja počinje vezanjem alergena na specifične molekule IgE na površini bazofila ili mastocita. E

Reakcija inhibicije migracije leukocita
Reakcija se provodi kako bi se identificirali limfociti senzibilizirani na sumnjivi alergen. Senzibilizirani limfociti u interakciji sa specifičnim alergenom oslobađaju medijatore (FPML

Zadatak br. 1
Pacijent star 23 godine žali se na ponavljajuće čireve lokalizirane na licu i nogama. Primjećuje česte prehlade (do 7-8 puta godišnje), herpetičke osipe na usnama.

Problem br. 2
Pacijent N., 22 godine, obratio se imunologu s pritužbama na rekurentne akutne respiratorne virusne infekcije (do 7 puta godišnje), često praćene pogoršanjem kroničnog opstruktivnog bronhitisa. Proveden antibakterijski

Problem br. 3
Pacijentica T., 27 godina, više puta se obratila liječniku zbog rekurentnih akutnih respiratornih virusnih infekcija, traheobronhitisa, slabosti i slabosti. Iz anamneze je utvrđeno da je tijekom godine patio od ARVI šest puta, dva puta

Problem broj 4
Pacijent K, 45 godina. Dijagnoza: sistemski eritematozni lupus. Imunološka studija pokazala je: Leukociti - 5,5 x 109/l Limfociti -37%, aps. 2,03 x 109

Problem br. 5
Dijete, 5 godina, spada u skupinu često i dugotrajno bolesne djece, recidivi ARVI jednom mjesečno, žarišta kronične infekcije (kronični sinusitis, adenoiditis), povećani cervikalni limfni čvorovi

Tijekom imunološkog pregleda
Testovi prve razine Ukupno bijelih krvnih stanica. Leukoformula T-limfociti B-limfociti

Opća analiza krvi
Norma SI jedinica Hemoglobin M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l

Glavni CD markeri stanica imunološkog sustava
CD marker Stanična populacija % stanica CD2 T i NK stanica

Subpopulacija limfocita u djece
limfociti 4-5 dana - 3 mjeseca 4-8 mjeseci 1-2 godine 2-5 godina preko 5 godina sve

Razina imunoglobulina u krvnom serumu odraslih osoba
IgM IgG IgA IgE 1,3 – 1,7 g/l 12 – 14 g/l 2,1 – 2,9 g/l

Alergijski MAST panel (multiple allergosorbent test) za identifikaciju specifičnih imunoglobulina na alergene različitih skupina
Ig E panel za hranu Ruski prošireni Ig E panel za Ig G za hranu Ruski univerzalni Ig E panel

Rječnik pojmova
Avidnost je snaga vezanja antigena na antitijelo, koja je određena afinitetom i valencijom antitijela. Aglutination – agregacija na

Popis kratica i simbola
AG – antigen AOK – stanica koja stvara antitijela APC – stanica koja predstavlja antigen AT – antitijelo VLS – eferentna limfna žila VVC – zaražena virusom

Markova A.A. 1Kaškina E.I. 1 Rubtsov V.S. 1 Lyakisheva R.V. 1

1 Saratovsko državno medicinsko sveučilište nazvano po. U I. Razumovski, Saratov

Ekspresija markera apoptoze i proliferacije analizirana je u 61 bolesnika s ulceroznim kolitisom ovisno o trajanju, težini bolesti i lokalizaciji upalnog procesa u debelom crijevu. Grupu za usporedbu činilo je 15 praktički zdravih ljudi. Bolesnici su pregledani kliničkim, laboratorijskim, endoskopskim i morfološkim metodama. U uzorcima biopsije sluznice debelog crijeva određena je ekspresija imunohistokemijskih biljega Ki-67, P53, BAX i CEA. Istraživanjem je utvrđeno statistički značajno smanjenje proliferativne aktivnosti sluznice debelog crijeva u bolesnika s ulceroznim kolitisom u usporedbi sa skupinom zdravih osoba, kao i smanjenje proliferacijskih procesa i povećanje ekspresije markera apoptoze s obzirom na trajanje i težinu kliničkih manifestacija bolesti se povećava.

nespecifični ulcerozni kolitis

markeri apoptoze i proliferacije

1. Aruin L.I., Kapuller L.L., Isakov V.A. Morfološka dijagnostika bolesti želuca i crijeva. – M.: Triada-X, 1998. – 496 str.

2. Gastroenterologija i hepatologija: dijagnoza i liječenje: vodič za liječnike / ur. A.V. Kalinina, A.F. Loginova, A.I. Khazanova. – 2. izd., revidirano. i dodatni – M.: MEDpress-inform, 2011. – 864 str.: ilustr.

3. Brown D. Gatter K. Monoklonsko protutijelo Ki-67: njegova uporaba u histopatologiji // Histopathology. – 1990. – br. 17. –

4. Bruno S., Darynkiewich Z. Ekspresija ovisna o staničnom ciklusu i stabilnost nuklearnog proteina otkrivenog Ki-67 antitijelom u HL-60 stanicama // Cell. Prolife. – 1992. – br. 25. –

5. Usporedba markera proliferacije (BrdUrd, Ki-67, PCNA) određenih na svakoj poziciji stanice u kriptama normalne sluznice debelog crijeva čovjeka / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

et al. //Eur. J. Histochem. – 1996. – God. 40. – Str. 89–100.

6. Holt P.R., Moss S.F., Kapetanakis A.M. Je li Ki-67 bolji proliferativni marker u debelom crijevu od nuklearnog antigena proliferirajućih stanica? Rak. Epidimiol // Biomarkeri. Pret. – 1997. –

broj 6. – Str. 131–135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. et al. Detekcija antigena Ki-67 u fiksiranom i voštanom rezu s monoklonskim protutijelom MIB-1 // Histopathology. – 1993. –

broj 22. – Str. 355–360.

8. Reed J. C. Bcl-2 i regulacija programirane stanične smrti // J. Cell. Biol. – 1994. – God. 124. – P. 1–6.

Nespecifični ulcerozni kolitis (UC) jedna je od najtežih bolesti gastrointestinalnog trakta koja dovodi do invaliditeta i smrti bolesnika.

Posljednjih desetljeća u raznim zemljama svijeta bilježi se porast incidencije UC-a, čemu je uvelike pridonijela poboljšana dijagnostika ovog patološkog procesa.

Trenutno, dijagnoza UC koristi integrirani pristup pomoću rendgenskih, endoskopskih i histoloških metoda istraživanja. Jedan od obećavajućih načina procjene stanja sluznice debelog crijeva je imunohistokemija s određivanjem markera proliferacije i apoptoze.

Od metoda imunohistokemijskih istraživanja najviše se koriste markeri apoptoze bcl i p53. Poznato je da su proteini iz obitelji bcl ili induktori apoptoze (Bad, Bax, Bak, itd.) ili inhibitori apoptoze (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, itd.). Treba napomenuti da se protein p53 detektira u mnogim transformiranim stanicama. Njegove su funkcije usmjerene na sprječavanje prijenosa oštećenih genetskih informacija s jedne generacije stanica na drugu, uključujući pokretanje apoptoze. Visok sadržaj p53 dovodi do povećanja koncentracije Baxa u stanici i smanjenja koncentracije bcl-2, koji potiče staničnu smrt apoptozom.

Nekoliko antigena se koristi kao markeri proliferacije. Proliferirajući stanični nuklearni antigen (PCNA) uključen je ne samo u staničnu proliferaciju, već i u popravak DNA nakon oštećenja, što ovaj antigen čini uvjetno specifičnim za stanični ciklus, budući da se popravak DNA može provesti u fazi mirovanja. Drugi antigen pouzdano povezan s fazama staničnog ciklusa je Ki-67. Ekspresija ovog proteina događa se tijekom predsintetske faze, povećava se tijekom staničnog ciklusa i naglo se smanjuje tijekom mitotičke faze. Ovaj protein, za razliku od PCNA, nije uključen u popravak DNK. Ekspresija Ki-67 omogućuje identifikaciju stanica u svim fazama staničnog ciklusa osim faze mirovanja.

Svrha rada je analizirati ekspresiju markera apoptoze i proliferacije u bolesnika s ulceroznim kolitisom ovisno o trajanju, težini bolesti i lokalizaciji upalnog procesa.

Materijali i metode istraživanja

Glavnu skupinu činio je 61 pacijent s UC-om u dobi od 19 do 66 godina (27 žena i 34 muškarca), usporednu skupinu - 15 praktički zdravih ljudi. Bolesnici su pregledani kliničkim, laboratorijskim, endoskopskim, morfološkim metodama, te imunohistokemijskim pregledom bioptata sluznice debelog crijeva.

Bolesnici s UC podijeljeni su u skupine ovisno o težini kliničkih manifestacija, trajanju bolesti i lokalizaciji upalnog procesa.

Proliferativna aktivnost stanica određena je proliferativnim indikatorom Ki-67 po formuli:

Gdje x- broj jezgri u vidnom polju mikroskopa. Brojanje je provedeno u najmanje 10 vidnih polja.

Apoptoza je procijenjena ekspresijom p53 i BAX proteina u površinskom i žljezdanom epitelu debelog crijeva. Za procjenu regenerativnih procesa u sluznici debelog crijeva u UC određena je ekspresija kancerogenog embrionalnog antigena (CEA).

Rezultati istraživanja i rasprava

Imunohistokemijskom studijom utvrđena je ovisnost ekspresije ovih biljega o trajanju UC, težini njegovih kliničkih manifestacija i prevalenciji upalnog procesa u debelom crijevu.

Statističkom obradom dobivenih podataka nakon ispitivanja jednakosti varijanci i normalnosti distribucije, dokazano je da uzorak ne odgovara zakonu normalne distribucije, stoga su za usporedbu skupina korišteni neparametrijski kriteriji. Za opis kvantitativnih karakteristika korišteni su medijan, gornji i donji kvartil.

Tako je u zdravih osoba Ki-67 PI iznosio 54 (46;67), što ukazuje na visoku proliferativnu aktivnost stanica debelog crijeva (tablica).

Indeks proliferacije Ki-67 epitelnih stanica sluznice debelog crijeva (%) u zdravih osoba i bolesnika s ulceroznim kolitisom, ovisno o njegovom trajanju, težini i lokalizaciji

Bilješke:

• R 0 - značajnost razlika u odnosu na kontrolnu skupinu;
• R 1 - značajnost razlika s trajanjem bolesti kraćim od 1 godine;
• R 2 - značaj razlika s blagim tijekom bolesti;
• R 3 - značajnost razlika s distalnom lokalizacijom bolesti.

Ekspresija BAX-a u zdravih osoba izostala je u 80% slučajeva, au 20% je bila niska ekspresija markera. Ekspresija CEA primijećena je u 50% slučajeva i također je bila niska.

Svi su bolesnici, ovisno o trajanju bolesti, podijeljeni u 3 skupine: 1. s UC u trajanju do 1 godine, 2. s trajanjem od 1 do 5 godina i 3. - više od 5 godina.

Kao što slijedi iz tablice, povećanje Ki-67 PI u skupini bolesnika s trajanjem bolesti od 1 do 5 godina u usporedbi sa skupinom 1 ( R≤ 0,02), može se objasniti povećanom proliferativnom aktivnošću stanica, odražavajući reparativne procese u sluznici debelog crijeva. Nizak Ki-67 PI u skupini bolesnika s ulceroznim kolitisom u trajanju do 1 godine, koji iznosi 31(25;36), može ukazivati ​​na izraženo smanjenje proliferativnih procesa u crijevnoj sluznici na početku bolesti.

Proučavanjem indikatora p53 ovisno o trajanju bolesti nije otkriven obrazac ekspresije ovog proteina, međutim postoji razlika u ekspresiji ovog markera između skupine zdravih osoba i skupine bolesnika s trajanjem bolesti. od 1 godine do 5 godina ( R≤ 0,05) i više od 5 godina ( R ≤ 0,03).

Ekspresija BAX-a otkrivena je i u površinskom i u žljezdanom epitelu debelog crijeva. Utvrđeno je da je ekspresija ovog markera u površinskom epitelu iu epitelu žlijezda gotovo ista u svakom pojedinačnom slučaju. Ekspresija BAX-a u bolesnika s UC-om otkrivena je u 100% slučajeva; utvrđene su statistički značajne razlike u ekspresiji markera između usporedne skupine i bolesnika s UC-om ( R ≤ 0,01).

Uspoređujući intenzitet ekspresije CEA, uočen je značajan porast s povećanjem trajanja bolesti. U usporednoj skupini ekspresija CEA se očitovala samo u izoliranim slučajevima ( R ≤ 0,003).

Ovisno o težini kliničkih manifestacija UC-a, otkrivene su i promjene Ki-67 PI (vidi tablicu). Ki-67 PI smanjen u bolesnika s umjerenom bolešću ( R≤ 0,05) i teški oblik ( R≤ 0,02) u usporedbi s bolesnicima s blagim tijekom, također je postojala razlika između skupine zdravih osoba i bolesnika s UC bilo koje težine ( R ≤ 0,004).

Promjene u ekspresiji markera p53 ovisile su o težini egzacerbacije (12,5% za blagu; 35,7% za umjerenu težinu i 50% za tešku). Dobivene su statistički značajne razlike između skupina zdravih osoba i bolesnika s umjerenim i teškim oblikom UC ( R ≤ 0,03).

BAX i CEA izraženi su u 100% slučajeva, ali nije otkrivena ovisnost intenziteta ekspresije ovih biljega o težini kliničkih manifestacija UC. Utvrđene su razlike u ekspresiji markera između usporedne skupine i bolesnika s UC, neovisno o težini kliničkih manifestacija (p≤0,01).

Kada se analizira ovisnost Ki-67 PI o lokalizaciji upalnog procesa, otkriveno je značajno povećanje ekspresije markera u skupini bolesnika s UC u usporedbi sa zdravim ljudima ( R≤ 0,002), međutim, u usporednoj analizi unutar glavne skupine nisu dobivene statistički značajne razlike između ekspresije markera i različitih lokalizacija procesa ( R ≥ 0,05).

Ekspresija p53 nije otkrivena kod svih pacijenata. U bolesnika s distalnim kolitisom pozitivan rezultat dobiven je samo u 20% slučajeva, s lijevostranim kolitisom u 18% bolesnika. S potpunim oštećenjem crijeva, ekspresija p53 otkrivena je u 100% slučajeva ( R≤ 0,03 u usporedbi s distalnim kolitisom). Treba napomenuti da je ekspresija bila najintenzivnija u područjima sa znakovima epitelne metaplazije.

Intenzitet ekspresije BAX u skupini s totalnim kolitisom bio je značajno veći nego u distalnom kolitisu ( R ≤ 0,03).

Ekspresija CEA nije ovisila o mjestu upalnog procesa, ali je bila značajno viša u bolesnika s UC u odnosu na usporednu skupinu ( R ≤ 0,03).

Kod nespecifičnog ulceroznog kolitisa proliferativna aktivnost epitelnih stanica sluznice debelog crijeva značajno je niža, a stope apoptoze veće nego u odsutnosti upalnih promjena.

Povećanje trajanja nespecifičnog ulceroznog kolitisa popraćeno je niskom proliferativnom aktivnošću epitela sluznice debelog crijeva, što može poremetiti njegovu obnovu.

S povećanjem težine kliničkih manifestacija ulceroznog kolitisa, ne dolazi samo do smanjenja stupnja proliferativne aktivnosti epitelnih stanica debelog crijeva, već i do povećanja stope aktivacije apoptoze.

Kada se upalni proces proširi na proksimalne dijelove debelog crijeva, otkriveno je povećanje stope apoptoze.

Recenzenti:

Shvarts Yu.G., doktor medicinskih znanosti, profesor, voditelj. Zavod za fakultetsku terapiju Saratovskog državnog medicinskog sveučilišta nazvan po V.I. Razumovsky" Ministarstvo zdravstva i socijalnog razvoja Rusije, Saratov;

Fedorina T.A., doktor medicinskih znanosti, profesor, voditelj. Odjel za opću i kliničku patologiju: patološka anatomija, patološka fiziologija, Samara State Medical University, Ministarstvo zdravstva i socijalnog razvoja Rusije, Samara.

Rad je zaprimljen u urednici 09.12.2011.

Bibliografska poveznica

CAD (kaspazom aktivirana DNaza) u fragmente višestrukih veličina od 180-200 nukleotida. Kao rezultat apoptoze nastaju apoptotička tijela - membranske vezikule koje sadrže intaktne organele i fragmente jezgrinog kromatina. Ova tjelešca zahvataju susjedne stanice ili makrofagi kroz fagocitozu. Budući da stanični enzimi ne utječu na izvanstanični matriks, čak i s velikim brojem apoptotskih stanica, upala se ne opaža.

Proces apoptoze je neophodan za fiziološku regulaciju broja tjelesnih stanica, za uništavanje starih stanica, za stvaranje limfocita koji nisu reaktivni na svoje antigene (autoantigeni), za jesenje opadanje lišća biljaka, za citotoksični učinak T-limfocita ubojica, za embrionalni razvoj tijela (nestanak kožnih membrana između prstiju u ptičjih embrija) i drugi.

Poremećaj normalne stanične apoptoze dovodi do nekontrolirane stanične proliferacije i pojave tumora.

1. Značenje apoptoze

Apoptoza je sastavni dio života većine višestaničnih organizama. Ima posebno važnu ulogu u razvojnim procesima. Na primjer, udovi tetrapoda formiraju se kao lopatasti rast, a formiranje prstiju nastaje zbog smrti stanica između njih. Stanice koje više nisu potrebne također su podložne apoptozi, tako da je rep kod punoglavaca posebno uništen tijekom metamorfoze. U živčanom tkivu kralježnjaka tijekom embrionalnog razvoja više od polovice neurona umire apoptozom odmah nakon formiranja.

Apoptoza je također dio sustava za kontrolu "kvalitete" stanica, omogućuje vam uništavanje onih koje su nepravilno locirane, oštećene, nefunkcionalne ili potencijalno opasne za tijelo. Primjer su B-limfociti, koji umiru ako ne nose korisne antigen-specifične receptore ili su autoreaktivni. Većina limfocita aktiviranih tijekom infekcije također umire kroz apoptozu nakon što je ona prevladana.

U odraslim organizmima istodobna regulacija stanične proliferacije i apoptoze omogućuje održavanje veličine cijele jedinke i njezinih pojedinačnih organa. Na primjer, nakon primjene lijeka fenobarbital, koji stimulira proliferaciju hepatocita, jetra štakora se povećava. Međutim, odmah nakon prestanka djelovanja ove tvari, sve suvišne stanice prolaze kroz apoptozu, zbog čega se jetra vraća u normalnu veličinu.

Apoptoza se također događa kada stanica "osjeti" veliku količinu unutarnjeg oštećenja koje ne može popraviti. Primjerice, u slučaju oštećenja DNK stanica se može transformirati u kancerogenu, a da se to ne dogodi, u normalnim uvjetima ona “počini samoubojstvo”. Veliki broj stanica zaraženih virusima također umire apoptozom.

2. Markeri apoptotskih stanica

Markeri apoptoze

Detekcija fragmentacije DNA u apoptotskim stanicama metodom TUNEL Uzorak tkiva jetre miša, jezgra apoptotične stanice je smeđe boje, optička mikroskopija.

Detekcija fragmentacije DNA u apoptotičnim stanicama elektroforezom u agaroznom gelu. Lijevo: DNK izolirana iz apoptotskih stanica - vidljive su "ljestve DNK"; sredina: oznake; slučaj: kontrolni uzorak DNK iz netretiranih stanica. Stanična linija H4IIE (štakorski hepatom), induktor apoptoze - parakvat, vizualizacija etidijevim bromidom.

Gore: detekcija kondenzacije i fragmentacije kromatina bojenjem fluorescentnom bojom (Hoechst 34580). Sredina: otkrivanje translokacije fosfadidilserina u vanjski sloj plazmaleme bojanjem s aneksinom V. Dolje: mikrograf svijetlog polja apoptotskih stanica. Stanična linija - Jurkat, induktor apoptoze - TRAIL, konfokalan i svjetlosna optička mikroskopija.

Stanice koje umiru apoptozom mogu se prepoznati po nizu morfoloških karakteristika. Postaju manje i gušće (piknoza), zaobljene i gube pseudopodije, citoskelet u njima je uništen, nuklearna membrana se raspada, kromatin se kondenzira i fragmentira. Na površini stanica pojavljuje se velik broj vezikula, koje se, ako su stanice dovoljno velike, raspadaju na fragmente okružene membranama - apoptotička tjelešca.

U apoptotičnim stanicama, osim morfoloških, dolazi i do velikog broja biokemijskih promjena. Dijelove DNA režu posebne nukleaze u povezničkim regijama između nukleosoma na fragmente jednake duljine. Stoga, kada se elektroforezom odvaja cjelokupna DNA iz apoptotičke stanice, mogu se uočiti karakteristične "ljestve". Druga metoda za otkrivanje fragmentacije DNK je označavanje slobodnih krajeva metodom TUNEL ( T erminalna deoksinukleotidil transferaza d U TP n ick e nd l abeling ) .

Plazma membrana apoptotskih stanica također prolazi kroz promjene. U normalnim uvjetima, negativno nabijeni fosfolipid fosfatidilserin nalazi se samo u svom unutarnjem (vraćenom u citosol) sloju, ali tijekom apoptoze “skače” na vanjski sloj. Ova molekula služi kao signal "pojedi me" obližnjim fagocitima. Fosfatidilserinom inducirano gutanje apoptotskih stanica, za razliku od drugih vrsta fagocitoze, ne rezultira otpuštanjem upalnih medijatora. Opisana promjena u plazmalemi je temelj još jedne metode za identifikaciju stanica koje umiru apoptozom - bojanje aneksinom V koji se specifično veže na fosfatidilserin.

3. Kaspaze – medijatori apoptoze

Stanični sustavi koji posreduju u apoptozi slični su kod svih životinja, a obitelj kaspaznih proteina zauzima središnje mjesto. Kaspaze su proteaze koje imaju cisteinski ostatak u aktivnom centru i režu svoje supstrate na specifičnom ostatku asparaginske kiseline (otuda naziv: c iz cistein I asp iz asparaginska kiselina). Kaspaze se sintetiziraju u stanici kao neaktivne prokaspaze, koje mogu postati supstrati za druge, već aktivirane kaspaze, koje ih režu na jednom ili dva mjesta na ostatku aspartata. Dva formirana fragmenta - veći i manji - međusobno su povezani tvoreći dimer, koji se povezuje s istim dimmerom. Tako formirani tetramer je aktivna proteaza, koja može rezati supstratne proteine. Uz regije koje odgovaraju glavnoj i sporednoj podjedinici, prokaspaze ponekad također sadrže inhibitorne prodomene, koje se razgrađuju nakon cijepanja.

Kao rezultat cijepanja i aktivacije nekih kaspaza od strane drugih, nastaje protealitička kaskada, koja značajno pojačava signal i čini apoptozu ireverzibilnim procesom od određene točke. One prokaspaze koje započinju ovu kaskadu nazivaju se inicijatori, a njihovi supstrati nazivaju se efektori. Jednom aktivirane, efektorske kaspaze mogu cijepati druge efektorske prokapaze ili ciljane proteine. Ciljevi efektorskih kaspaza koje se uništavaju tijekom apoptoze uključuju, posebice, proteine ​​nuklearne lamine, čija razgradnja dovodi do dezintegracije ove strukture. Protein se također razgrađuje i, pod normalnim uvjetima, inhibira CAD endonukleaze, što dovodi do fragmentacije DNA. Kaspaze i citoskeletni i međustanični adhezijski proteini se cijepaju, uzrokujući zaokruživanje apoptotskih stanica i odvajanje od susjednih stanica, te tako postaju lakše mete za fagocite.

Skup kaspaza potrebnih za podvrgavanje apoptozi ovisi o vrsti tkiva i putu kroz koji se aktivira stanična smrt. Na primjer, kod miševa, kada se gen koji kodira efektor kaspazu-3 "isključi", apoptoza se ne događa u mozgu, ali se normalno događa u drugim tkivima.

Geni prokaspaze aktivni su u zdravim stanicama, stoga su proteini stalno prisutni da bi došlo do apoptoze; samo je njihova aktivacija potrebna da bi se pokrenulo samoubojstvo stanice. Inicijatorske prokaspaze uključuju dugu prodomenu koja sadrži CARD ( domena regrutiranja kaspaze , domena zapošljavanja Caspase). CARD omogućuje inicijatorskim prokaspazama da se vežu na adapterske proteine ​​kako bi formirale aktivacijske komplekse kada stanica primi signal koji stimulira apoptozu. U aktivacijskim kompleksima nekoliko molekula prokaspaze nađe se u neposrednoj blizini jedna drugoj, što je dovoljno da pređu u aktivno stanje, nakon čega se međusobno režu.

Dva najbolje proučena signalna puta za aktivaciju kaskade kaspaze u stanicama sisavaca nazivaju se vanjski i unutarnji (mitohondrijski), od kojih svaki koristi vlastite inicijatorske prokaspaze.

4. Putovi za aktiviranje apoptoze

4.1. Vanjski put

Stanica može primiti signal koji inducira apoptozu izvana, na primjer, od citotoksičnih limfocita. U tom slučaju aktivira se tzv. vanjski put ( vanjski put), Počevši od receptora smrti. Receptori smrti su transmembranski proteini koji pripadaju obitelji receptora faktora tumorske nekroze (TNF), kao što je sam TNF receptor i Fas receptor smrti. Oni tvore homotrimere, u kojima svaki monomer ima izvanstaničnu domenu za vezanje liganda, transmembransku domenu i citoplazmatsku domenu smrti, te privlači i aktivira prokaspaze preko adapterskih proteina.

Ligandi receptora smrti također su homotrimeri. One su međusobno povezane i pripadaju obitelji signalnih molekula čimbenika tumorske nekroze. Na primjer, citotoksični limfociti nose Fas ligande na svojoj površini, koji se mogu vezati na Fas receptore smrti na plazmalemi ciljnih stanica. U ovom slučaju, unutarstanične domene ovih receptora povezane su s adapterskim proteinom ( FADD, domena smrti povezana s Fasom ), A one, zauzvrat, privlače inicijatorske prokaspaze 8 i/ili 10. Kao rezultat ovog niza događaja, formira se signalni kompleks koji izaziva smrt - DISC ( signalni kompleks koji izaziva smrt ). Jednom aktivirane u ovom kompleksu, inicijatorske kaspaze prekidaju efektorske prokapaze i pokreću apoptotičku kaskadu.

Mnoge stanice sintetiziraju molekule koje ih u određenoj mjeri štite od aktivacije vanjskog puta apoptoze. Primjer takve zaštite bila bi ekspresija takozvanih receptora mamaca ( receptori mamac), ima izvanstanične domene vezanja liganda, ali ne i citoplazmatske domene smrti, te stoga ne može pokrenuti apoptozu i natjecati se s konvencionalnim receptorima smrti za ligande. Stanice također mogu proizvoditi proteine ​​koji blokiraju vanjski apoptotski put, kao što je FLIP, koji je po strukturi sličan prokaspazama 8 i 10, ali nema proteolitičku aktivnost. On inhibira vezanje inicijatora prokaspaza na DISC kompleks.

4.2. Unutarnji put

Apoptosom

Apoptoza se također može pokrenuti unutar stanice, na primjer zbog ozljede, oštećenja DNK, nedostatka kisika, hranjivih tvari ili signala izvanstaničnog preživljavanja. U kralješnjaka se ovaj signalni put naziva unutarnjim ( intrinzični put) Ili mitohondrijski, ključni događaj u njemu je oslobađanje određenih molekula iz međumembranskog prostora mitohondrija. Prije takvih molekula zocrema nalazi se citrom c, koji u većini slučajeva odlazi u lanjug prijenosa elektrona mitohondrija, protein u citoplazmi ima još jednu funkciju - dolazi do adapterskog proteina Apaf ( faktor aktivacije apoptotičke proteaze-l ), uzrokujući njegovu oligomerizaciju u sedmeročlanu strukturu nalik kotaču koja se naziva apoptosom. Apoptosom regrutira i aktivira inicijator prokaspazu-9, koji zatim može aktivirati inicijator prokaspazu.

U nekim stanicama, vanjski put apoptoze mora aktivirati unutarnji put apoptoze kako bi učinkovito ubio stanicu. Intrinzični put je strogo reguliran proteinima obitelji Bcl-2.

4.2.1. Regulacija intrinzičnog puta pomoću proteina obitelji Bcl-2

Obitelj Bcl-2 uključuje evolucijski očuvane proteine, čija je glavna funkcija regulacija otpuštanja citokroma c i drugih molekula iz intermembranskog prostora mitohondrija. Među njima postoje proapoptotičke i antiapoptotičke molekule koje mogu međusobno djelovati u različitim kombinacijama, potiskujući jedna drugu, ravnotežu između svojih aktivnosti i određujući sudbinu stanice.

Sada je poznato oko 20 proteina iz ove obitelji, od kojih svi sadrže barem jednu od četiri alfa-helikalne Bcl2 homološke domene, nazvane BH1-4 ( bcl2 homologija). Antiapoptotski proteini obitelji Bcl2 sadrže sve četiri domene, uključujući sam Bcl-2, kao i Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 i A1. Proapoptotski proteini se dijele u dvije skupine, od kojih članovi prve sadrže tri BH domene (BH1-3), posebice Bak, Bax i Bok (potonji se eksprimira samo u tkivima reproduktivnih organa). Najbrojnija među obitelji Bcl-2 je druga skupina proapoptotskih proteina koji sadrže samo BH3 domenu (samo BH3), tu spadaju Bim, Bid, Bad, Bik / Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

U normalnim uvjetima (tj. kada stanica ne prolazi kroz apoptozu), anti-apoptotski proteini kao što su Bcl-2 i Bcl-X L vežu se za pro-apoptotske proteine ​​BH123 (Bax i Bak) i sprječavaju njihovu polimerizaciju u vanjskoj mitohondriji. membrana za stvaranje pora. Kao rezultat djelovanja određenog apoptotičkog podražaja, u stanici se aktiviraju ili se počinju sintetizirati proapoptotski proteini koji sadrže samo BH3 domenu. Oni, zauzvrat, inhibiraju anti-apoptotičke proteine, uklanjajući inhibicijski učinak na Bak i Bax, ili izravno stupaju u interakciju s potonjim i potiču njihovu oligomerizaciju i stvaranje pora. Uslijed permeabilizacije vanjske membrane, citokrom c, kao i drugi medijatori apoptoze, poput AIF-a, ulaze u citosol. faktor indukcije apoptoze ).

Na primjer, kada postoji nedostatak signala za preživljavanje u stanici, ekspresija BH3 proteina Bim se aktivira posredstvom MAP kinaze JNK, koja pokreće intrinzični put apoptoze. U slučaju oštećenja DNA dolazi do nakupljanja tumor supresora p53, koji potiče transkripciju gena koji kodiraju BH3 proteine ​​Puma i Noxa, koji također posreduju u apoptozi. Drugi BH3 protein, Bid, osigurava vezu između vanjskih i unutarnjih puteva apoptoze. Nakon aktivacije receptora smrti i, kao posljedica toga, kaspaze-8, potonja reže Bid da bi formirala krnji oblik tBid (krnji Bid), koji se kreće u mitohondrije, gdje potiskuje Bcl-2.