タンデム質量分析法 (HPLC-MSMS) の臨床診断への応用。 臨床診断におけるタンデム質量分析 (HPLC-MSMS) の応用 HPLC MS とは

Clinical Biochemist Reviews に掲載されたレビューによると、臨床検査室におけるタンデム質量分析計と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー (HPLC-MS/MS) の使用は、過去 10 ～ 12 年間で大幅に増加しました。 著者らは、HPLC-MS/MS 分析の特異性は、低分子量分子の分析において免疫学的手法や従来の高速液体クロマトグラフィー (HPLC) よりも大幅に優れており、ガスクロマトグラフィー質量分析 (GC) よりも大幅に高いスループットを備えていることに注目しています。 -MS）。 日常的な臨床分析におけるこの手法の人気は、現在、この手法の独自の機能によって説明されています。

HPLC-MS/MS メソッドの主な利点は次のとおりです。
• 低分子の正確な定量分析の可能性。
• 複数のターゲット化合物の同時分析。
• 独特の特異性。
• 解析速度が速い。

近年、分析時間、そしてその結果として研究室の生産性の向上に多くの注意が払われています。 HPLC/MS/MS 用の短い分析カラムを使用することにより、分析時間の大幅な短縮が可能になると同時に、分析の特異性が劇的に向上します。 大気圧イオン化 (API)、タンデム トリプル四重極質量分析計、高度な高速液体クロマトグラフィー、および関連するサンプル前処理技術の使用により、HPLC-MS/MS は臨床研究のための最新の分析法の最前線に押し上げられました。

臨床医学における HPLC/MS/MS の主な応用分野:
• ステロイドパネル、プリン、ピリミジン、その他の化合物の完全な代謝プロファイルを取得する
  新生児の先天性代謝異常のスクリーニング（1回の検査で数十の病気を検出）。
• メーカーのキットの入手可能性に関係なく、免疫抑制剤、経痛性けいれん剤、抗レトロウイルス薬、抗凝固薬などの薬物の治療モニタリング。 物質ごとに高価なキットを購入する必要はありません。独自の方法を開発できます。
• 臨床毒物学 - 確認分析を行わずに、500 を超える麻薬化合物とその代謝産物を 1 回の分析で分析します。
  プロテオミクスとメタボロミクス。

さらに、HPLC-MSMS は、尿中オリゴ糖、スルファチド、長鎖脂肪酸、長鎖胆汁酸、メチルマロン酸、ポルフィリン症の研究のスクリーニング、およびプリンおよびピリミジン代謝障害患者のスクリーニングにも使用されます。

液体クロマトグラフィーの応用例
臨床分析ではタンデム質量分析と組み合わせて使用​​します。

新生児スクリーニング:臨床診断における HPLC-MS/MS の広範な使用の最初の例は、新生児の先天性代謝異常のスクリーニングでした。 現在、先進国ではこの方法が日常的な方法となっており、アセデミア、アミノアシドパシー、脂肪酸酸化欠陥など 30 種類以上の疾患をカバーしています。 特に注目すべきは、迅速に対処しないと深刻な問題（心臓や肝臓の肥大、脳の腫れなど）につながる可能性がある先天異常に関する研究です。 新生児スクリーニングに HPLC-MS/MS を使用する利点は、すべてのアミノ酸とアシルカルニチンを迅速かつ安価で特異性の高い方法で同時に分析できることです。

治療薬のモニタリング:移植後の臓器拒絶反応を防ぐための免疫抑制薬シロリムス (ラパマイシン) の開発と導入は、臨床検査室への HPLC-MS/MS 導入の主な推進力の 1 つです。 最新の HPLC-MS/MS メソッドを使用すると、タクロリムス、シロリムス、シクロスポリン、エベロリムス、およびミコフェノイン酸を同時に測定できます。

HPLC-MS/MS は、細胞毒性薬、抗レトロウイルス薬、三環系抗うつ薬、抗けいれん薬、および個別の投与量を必要とするその他の薬剤の分析にも使用されます。

HPLC-MSMS メソッドを使用すると、0.1 ～ 500 ng/ml の濃度範囲でワルファリンの R-鏡像異性体と S-鏡像異性体の分離と定量が可能になります。

麻薬と鎮痛剤: HPLC-MS/MS は、サンプル前処理が容易で分析時間が短いため、これらの化合物の分析に広く使用されています。 この方法は現在、臨床検査室で広範囲の薬物の存在をスクリーニングするために使用されています。 このメソッドの独自の特異性と感度により、最小限のサンプル前処理で、1 つのサンプルに含まれるさまざまなクラスの 500 を超える化合物を同時に分析することができます。 したがって、尿分析の場合は、サンプルを50〜100倍に単純に希釈するだけで十分です。 毛髪を分析する場合、100 ～ 200 本の毛髪の束ではなく、1 本の毛髪だけで薬物使用の事実を確実に特定できます。

内分泌学とステロイドの分析: HPLC-MS/MS は、テストステロン、コルチゾール、アルデステロン、プロゲステロン、エストリオールなどのステロイドの分析に多くの内分泌研究室で広く使用されています。

ビタミン D3 および D2 の血中濃度を測定するために HPLC-MS/MS を使用し始めている研究室が増えています。

I. ステロイドの決定 (ステロイド プロファイル)。

病院や診療所の研究室では、HPLC/MS/MS を使用して複数のステロイドを同時に測定できるようになりました。 この場合、大量のサンプルを必要としませんが、これは小児サンプルを分析する場合に特に重要です。

複数の（プロファイリング）ステロイドを決定することが望ましい場合:
• 先天性副腎過形成 (CAH) は、ステロイド生合成における先天性欠陥です。 これは、副腎皮質の酵素の不適切な活性によって引き起こされる遺伝性の疾患群であり、コルチゾールの産生の減少につながります。 NAS の信頼できる診断のためには、コルチゾール、アンドロステンジオン、および 17-ヒドロキシプロゲステロンを測定することが推奨されます。 HPLC/MS/MS を使用すると、1 回の分析で 3 つのステロイドすべてを 100% の信頼性で正確に定量できます。
• イムノアッセイを使用した定期的な新生児スクリーニングは、高い割合で陽性結果と偽陰性結果が発生するという特徴があります。 HPLC/MS/MS によるコルチゾールだけでなく、アルドステロンや 11-デオキシコルチゾールの測定により、原発性副腎不全と続発性副腎不全を区別することが可能になります。
• HPLC/MS/MS により、前立腺炎および慢性骨盤痛症候群におけるステロイドの測定が可能になります。
• HPLC-MS/MS は、ステロイド プロファイルを決定し、幼児における副腎皮質関連の思春期早発症の原因を特定できます。 これらの子供たちのテストステロン、アンドロステンジオン、デヒドロエピアンドロステロン (DHEA) およびその硫酸塩の濃度は、年長の対照子供よりもわずかに高いことが判明しました。
• 能動喫煙者、受動喫煙者、非喫煙者の血清を分析して、15 種類のステロイド ホルモンと甲状腺ホルモンの存在を調べ、患者の煙への曝露とホルモン濃度の関係を調査します。
• HPLC/MS/MS は、尿中の一部の女性ステロイド ホルモンのプロファイリングに使用されます。
• HPLC/MS/MS は、糖尿病性神経障害の予防のための神経活性ホルモンの濃度を評価するために使用されました。

II. 甲状腺ホルモンの測定

甲状腺ホルモンを測定するための日常的な方法は、通常、放射免疫測定法に依存していますが、これは高価であり、T3 と T4 のみを検出するため、甲状腺機能を測定して完全に調節する能力が制限される可能性があります。

• 現在、HPLC-MSMS を使用して、チロキシン (T4)、3,3',5-トリヨードチロニン (T3)、3,3',5'- (rT3) を含む、血清サンプル中の 5 つの甲状腺ホルモンの同時分析が実行されています。 、１〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲の３，３’−ジヨードチロニン（３，３’−Ｔ２）および３，５−ジヨードチロニン（３，５−Ｔ２）。
• HPLC/MS/MS 法は、甲状腺切除術を受けた患者のホルモン組成の分析にも使用されます。 手術後のチロキシン (T4)、トリヨードチロニン (T3)、遊離 T4、および甲状腺刺激ホルモン (TSH) の濃度レベルが測定されます。 HPLC/MS/MS は、TSH と甲状腺ホルモン濃度の関係を確立する優れた方法であることがわかっています。
• HPLC/MS/MS 法を使用して、ヒトの唾液および血清中のチロキシン (T4) を測定しました。 このメソッドは、高い再現性、精度、および 25 pg/ml の検出限界を特徴としています。 研究により、甲状腺機能正常の被験者とバセドウ病患者との間には、唾液中のT4濃度に診断上の関係があることが示されています。

HPLC/MS/MS メソッドは、体液中のすべてのステロイドを確実に測定するために必要な感度、特異性、精度を備えているため、特に一連のステロイドを測定する場合の診断能力が向上しています。

Ⅲ． HPLC/MS/MS による 25-ヒドロキシビタミン D の測定

25-ヒドロキシ ビタミン D (25OD) は、ビタミン D の主な循環形態であり、その活性型の前駆体です。 (1,25-ジヒドロキシビタミンD)。 半減期が長いため、25OD の測定は患者の体内のビタミン D の状態を判断するために重要です。 ビタミンDは、ビタミンD3（コレカルシフェロール）とビタミンD2（エルゴカルシフェロール）の2つの形態で存在します。 両方の形態はそれぞれの 25OD 形態に代謝されます。 診断にとって非常に重要なのは、ビタミンの両方の形態を高精度で測定し、ビタミンD欠乏症患者のモニタリングを可能にする分析方法の利用可能性であるが、これまでに使用された方法では、ビタミンD2とD3を別々に測定することはできなかった。 さらに、高濃度のビタミン D2 では、検出可能な D3 量が過小評価されます。 もう 1 つの欠点は、放射性同位体の使用です。 HPLC/MS/MS 法の使用により、放射性同位体の使用を回避できるだけでなく、ビタミンの両方の活性型を別々に測定することも可能になりました。

この方法は次の患者に適用できます。
1. 体内のビタミン D レベルの低下が疑われる場合。
2. 説明できない毒性が疑われる場合。
3. ビタミンDレベルが低いため治療を受けている患者を検査する場合。
4. HPLC/MS/MS を使用すると、患者をモニタリングする際に両方の形態を個別に測定することができました。

IV. HPLC/MS/MS による免疫抑制剤の測定

臓器移植後は、拒絶反応を避けるために免疫抑制剤を生涯服用しなければなりません。 免疫抑制剤は治療範囲が非常に狭く、毒性が高いため、最大の効果を得るには個別の投与が必要です。 したがって、血液中の薬物濃度に応じて個々の患者の薬物投与量を調整するには、主要な免疫抑制薬であるシクロスポリン A、タクロリムス、シロリムス、エベロリムスをモニタリングすることが不可欠です。

これらの薬剤を監視するために免疫測定法が今でも使用されていますが、これらの方法は高価であり、特異性、精度、再現性が限られています。 免疫学的方法を使用して得られた結果に基づいて、免疫抑制剤の誤った投与により患者が死亡した例があります。 現在、臨床検査室ではイムノアッセイが HPLC/MS/MS に置き換えられています。 したがって、ミュンヘン大学クリニックでは、HPLC/MS/MS システムを使用して、シロリムスとシクロス​​ポリン A の含有量について毎日約 70 のサンプルが分析されています。 すべてのサンプルの準備と機器の制御は 1 人の従業員によって実行されます。 同研究所は、この方法を使用したタクロリムスの検査にも切り替えている。

• 血液中のタクロリムス、シロリムス、アスコマイシン、デメチキシシロリムス、シクロスポリン A およびシクロスポリン G の日常的な同時測定における HPLC/MS/MS の使用について説明します。 濃度による範囲は1.0～80.0ng/mlです。 シクロスポリンの場合は 25 ～ 2000 ng/ml。 年間を通じて、研究所は 50,000 を超えるサンプルを分析しました。
• タクロリムスとシロリムスの同時使用にはプラスの治療効果があることが判明したため、臨床分析用に血液中のそれらを別々に測定するための簡単で効果的な HPLC/MS/MS 方法が開発されました。 1 つのサンプルの分析には 2.5 分かかり、検量線全体の精度はタクロリムスで 2.46% ～ 7.04%、シロリムスで 5.22% ～ 8.30% です。 タクロリムスの検出下限は 0.52 ng/ml、シロリムスの検出下限は 0.47 ng/ml です。

V. HPLC/MS/MS によるホモシステインの測定

ホモシステインは、心血管疾患（血栓塞栓症、心臓病、アテローム性動脈硬化症）やその他の臨床症状（うつ病、アルツハイマー病、骨粗鬆症、妊娠合併症など）に興味深いものです。 イムノアッセイを含む現在のホモシステイン分析方法は高価です。 ホモシステイン分析のための高速 HPLC/MS/MS メソッドは、大量のサンプルの分析における日常的な臨床使用のために開発されました。 イオン化はエレクトロスプレー法により行った。 この方法は再現性があり、特異性が高く、正確です。 この方法の利点は、試薬のコストが低いこととサンプル調製が簡単なことです。 1日あたり500検体以上の分析が可能です。

結論

現在、大幅に改良されたイムノアッセイ法が使用されていますが、技術的な基本的な制限により、この方法は、特に代謝物の存在下では、HPLC-MSMS に匹敵する標的物質に対する精度と特異性を決して持たないことに注意する必要があります。 これは、ELISA 法の精度が低く、偽陽性および偽陰性の結果の割合が高くなるだけでなく、ELISA 法を使用して異なる診療科で得られた結果を比較することもできません。 HPLC-MS/MS を使用すると、この欠点が解消され、代謝産物が存在し、血漿や血液中に存在する付随物質や内因性物質による干渉がない状態で、信頼性の高い多数のサンプルの特異性が高く、正確かつ迅速な分析が可能になります。患者の。

世界の慣習が示すように、この装置複合体のコストは明らかに高いにもかかわらず、適切に操作すれば、この複合体は 1 ～ 2 年で元が取れます。 これは、まず第一に、数十、数百の化合物を同時に分析できるため 1 回の分析のコストが低く、高価な診断キットを購入する必要がないためです。 さらに、研究室には、キットメーカーに依存せずに、必要な分析方法を独自に開発する機会があります。

正しいインスツルメンテーション構成の選択

数十万ダルトンの重さの複雑なタンパク質高分子の構造同定から、小分子の日常的なハイスループット定量分析まで、さまざまな問題を解決するために設計された、さまざまな質量分析方法や質量分析計の種類が多数あります。

この問題をうまく解決するには、主な条件の 1 つは、適切なタイプの機器を選択することです。 あらゆる範囲の分析問題を解決できる万能のデバイスはありません。 したがって、微生物を識別するという問題を解決するために設計された装置は、小分子の定量分析を行うことはできません。 およびその逆。 実際のところ、共通の名前にもかかわらず、これらは異なる物理原理で動作するまったく異なるデバイスです。 最初のケースでは、これはレーザーイオン化源 - MALDI-TOF を備えた飛行時間型質量分析計であり、2 番目のケースでは - エレクトロスプレーイオン化を備えたトリプル四重極 - HPLC-MSMS です。

2 番目に重要なパラメータは、正しいシステム構成を選択することです。 質量分析装置の大手メーカーはいくつかあります。 各メーカーのデバイスには、それぞれの強みだけでなく、通常は沈黙を守ることを好む弱点もあります。 各メーカーは独自のデバイス製品ラインを製造しています。 1 つの分析複合体のコストは 100,000 ドルから 1,000,000 ドル以上の範囲です。 最適なメーカーと正しい機器構成を選択すると、大幅な財務リソースが節約されるだけでなく、タスクをより効果的に解決できます。 残念ながら、これらの要素を考慮せずに実験装置が実行された例が数多くあります。 その結果、設備が遊休し、お金が無駄になります。

研究所の運営の成功を決定する 3 番目の要素は人材です。 質量分析計の操作には、高度な資格を持つ人材が必要です。 残念なことに、ロシアには、特に臨床応用に関連した現代の実用的な質量分析のコースを持っている大学は一つもなく、各研究室の人材育成の課題は自力で解決しなければなりません。 当然のことながら、機器の発売後にメーカーが実施する2～3日の導入研修だけでは、基本的な方法を理解し、機器の操作スキルを習得することはできません。

4 番目の要因は、既製の分析手法が存在しないことです。 各研究室には独自の優先タスクがあり、そのために独自の手法を開発する必要があります。 これは、デバイスの操作経験が少なくとも 2 ～ 3 年ある人が行うことができます。 メーカーは、推奨的な性質の一般的な方法を 1 つまたは 2 つ提供する場合がありますが、それらを研究室の特定のタスクに適合させることはできません。

で BioPharmExpert LLC当社では、さまざまなタイプの質量分析計の開発、メソッドの開発、ハイスループット分析の実行に長年の経験を持つ専門家を雇用しています。 そのため、弊社では以下のサービスを提供しております。

1. クライアントの特定のタスクに最適なデバイス構成を選択します。
2. タンデム質量分析計の大手メーカーからの機器の購入、供給、発売 機器の発売日から 1 年以内の段階的な人材トレーニング。
3. 基本的な臨床問題を解決するための既製の技術とデータベースのセット。
4. 分析手法を開発し、スタッフの参加を得て研究室でクライアントの特定の問題を解決します。
5. 仕事のあらゆる段階における方法論的なサポート。

高速液体クロマトグラフィー (HPLC) は、固定相 (吸着剤) が充填されたクロマトグラフィー カラム中を移動する液体である移動相 (MP) を使用するカラム クロマトグラフィー法です。 HPLC カラムはカラム入口での高い水圧が特徴であり、これが HPLC が「高圧液体クロマトグラフィー」と呼ばれることがある理由です。

物質の分離機構に応じて、吸着、分配、イオン交換、サイズ排除、キラルなどの HPLC オプションが区別されます。

吸着クロマトグラフィーでは、シリカゲルなどの発達した表面を持つ吸着剤の表面に吸着および脱着するそれぞれの能力の違いにより、物質の分離が行われます。

分配 HPLC では、固定相 (通常、固定担体の表面に化学的にグラフトされている) と移動相の間で分離される物質の分配係数の違いにより分離が発生します。

極性に基づいて、PF および NP HPLC は順相と逆相に分類されます。

順相は、極性吸着剤 (シリカゲル、または NH 2 または CN 基がグラフトされたシリカゲルなど) と非極性 PF (さまざまな添加剤を含むヘキサンなど) を使用するクロマトグラフィーの一種です。 逆相バージョンのクロマトグラフィーでは、非極性の化学修飾吸着剤 (たとえば、非極性アルキルラジカル C 18) と極性移動相 (たとえば、メタノール、アセトニトリル) が使用されます。

イオン交換クロマトグラフィーでは、溶液中でカチオンとアニオンに解離した物質の混合物の分子は、吸着剤（カチオン交換体またはアニオン交換体）中を移動する際に、吸着剤のイオン基との交換速度の違いにより分離されます。

サイズ排除（ふるい、ゲル透過、ゲルろ過）クロマトグラフィーでは、固定相の細孔に浸透する能力の違いにより、物質の分子がサイズによって分離されます。 この場合、固定相の最小数の細孔に浸透できる最大の分子 (分子量が最も大きい) が最初にカラムから排出され、分子サイズの小さな物質が最後に排出されます。

多くの場合、分離は 1 つのメカニズムではなく、複数のメカニズムによって同時に発生します。

HPLC メソッドは、非ガス状分析物の品質を管理するために使用できます。 分析を実行するには、液体クロマトグラフなどの適切な機器が使用されます。

液体クロマトグラフには通常、次の主要コンポーネントが含まれています。

– 移動相が入った容器（または移動相に含まれる個々の溶媒が入った容器）および PF 脱気システムを含む PF 調製ユニット。

– ポンプシステム;

– 移動相ミキサー (必要な場合);

– サンプル導入システム (インジェクター);

– クロマトグラフィーカラム (サーモスタットに設置可能);

– 検出器;

– データ収集および処理システム。

ポンプシステム

ポンプは、PF を一定の速度でカラムに供給します。 移動相の組成は分析中に一定である場合もあれば、変化する場合もあります。 最初のケースでは、プロセスはアイソクラティックと呼ばれ、2番目のケースでは勾配と呼ばれます。 移動相を濾過するために、孔径 0.45 µm のフィルターがポンプ システムの前に設置される場合があります。 最新の液体クロマトグラフのポンプ システムは、1 つまたは複数のコンピューター制御ポンプで構成されています。 これにより、グラジエント溶出中に特定のプログラムに従って PF の組成を変更できます。 ミキサー内での PF 成分の混合は、低圧 (ポンプ前) と高圧 (ポンプ後) の両方で発生します。 ミキサーは PF の調製や定組成溶出中に使用できますが、定組成プロセス用に PF 成分を事前に混合することで、より正確な成分比が得られます。 分析用 HPLC 用ポンプを使用すると、カラム入口の圧力が最大 50 MPa の場合に、カラムへの PF の流量を 0.1 ～ 10 ml/分の範囲で一定に維持することができます。 ただし、この値は 20 MPa を超えないようにすることをお勧めします。 圧力脈動は、ポンプの設計に組み込まれた特別なダンパー システムによって最小限に抑えられます。 ポンプの作動部品は耐食性材料で作られているため、PF 組成物に強力な成分を使用できます。

新規の 1,3,4-チアジアゾール アミノ酸誘導体 LXT7-09 を同定および定量するために、検証済みの HPLC-MS/MS メソッドが開発されました。 LHT7-09 の質量分析検出の最大感度は、エレクトロスプレー電圧 5500 V、クラスター除去電位 36 V の陽イオン検出モードで達成されました。同定された MRM 遷移により、1 の新しいアミノ酸誘導体の化学構造が確認されました。 、3,4-チアジアゾール。 チアジアゾリルアミドの多成分混合物から LXT7-09 を効果的に単離するために、アセトニトリルと脱イオン水の異なる比率の混合物を溶離液として使用する高速液体クロマトグラフィーのグラジエントモードが開発されました。 これらのクロマトグラフィー条件では、化合物 LHT7-09 の保持時間は 11 分と測定されました。 LHT7-09 化合物の定量測定のために、クロマトグラフィーのピーク面積の溶液濃度への依存性を考慮した校正溶液が開発されました。

HPLC-ms/ms

クロマトグラフィー

質量分析

チアジアゾール

1. カザイシュビリ・ユ・G.、ポポフ N.S. ラットのホルマリン誘発足浮腫における新しいチアジアゾール誘導体の抗炎症活性の研究 / Yu.G. ニューサウスウェールズ州カザイシビリ ポポフ // 科学と教育の現代の問題。 – 2013. – 第 3 位. www..

2. 抗真菌活性を有する新規チアジアゾール誘導体 / A.S. Koshevenko [et al.] // 医学真菌学の進歩。 – 2015. – T. 14. – P. 348-351。

3. 新しいフリル-2-置換 1,3,4-チアジアゾール、1,2,4-トリアゾールの合成と抗腫瘍活性 / T.R. Hovsepyan [他] // 化学薬品ジャーナル。 – 2011. – T. 45. – No. 12. – P. 3-7.

4. ポポフ N.S.、デミドバ M.A. チアジアゾールの新規アミノ酸誘導体をマウスに腹腔内投与した場合の急性毒性の評価 / N.S. マサチューセッツ州ポポフ デミドバ // アッパー ヴォルガ医学ジャーナル。 – 2016. – T. 15、発行。 1. – ページ 9-12。

5. ポポフ N.S.、デミドバ M.A. ラットに胃内投与した場合のチアジアゾールの新規アミノ酸誘導体の潰瘍形成性の評価 / N.S. マサチューセッツ州ポポフ デミドバ // 博士課程の学生。 – 2017. – No. 1(80)。 – ページ 71-78。

6. 2-アミノ-5-アルキル(アリールアルキル)-1,3,4-チアジアゾールに基づくフェニルチオ-およびベンジルスルホニル酢酸のアミドの合成と抗菌活性 / S.A. Serkov [et al.] // 化学薬品ジャーナル。 – 2014. – T. 48、No. 1. – P. 24-25。

7. Arpit K.、Basavaraj M.、Sarala P.、Sujeet K.、Satyaprakash K. イミダゾチアジアゾール誘導体の合成と薬理学的活性 // Acta Poloniae Pharmaceutica、Drug Research。 2016.Vol. 73.いいえ。 4. P.937-947。

8. Eman M. Flefel、Wael A. El-Sayed、Ashraf M. Mohamed. 新しい 1-チア-4-アザスピロデカン、その誘導体チアゾロピリミジンおよび 1,3,4-チアジアゾール チオグリコシド // 分子の合成と抗がん活性。 2017.いいえ。 22(1)． 170ページ。

9. ホルヘ R.A. ディアス、ヘラルド・エンリケ・カミ。 アセタゾラミドの構造類似体である 5-アミノ-2-スルホンアミド-1,3,4-チアジアゾールの塩は、興味深い炭酸脱水酵素阻害特性、利尿作用、抗けいれん作用を示します。 2016.Vol. 12.いいえ。 6. P.1102-1110。

10. Naiyuan Chen、Wengui D.、Guishan L.、Luzhi L. デヒドロアビエチン酸ベースの 1,3,4-チアジアゾール-チアゾリジノン化合物の合成と抗真菌活性 // 分子の多様性。 2016.Vol. 20.いいえ。 4. P. 897-905。

11. ヨムナ、I. エル・ガザール、ハナン・H・ジョージイ、シャヘンダ・M・エル・メッセリー。 DHFR阻害剤としてのキナゾリン-4(3H)-オンの新規(1,2,4-トリアゾールまたは1,3,4-チアジアゾール)-メチルチオ誘導体の合成、生物学的評価および分子モデリング研究 // 生物有機化学。 2017.Vol. 72. P. 282-292。

質量分析検出を備えた高速液体クロマトグラフィーは、さまざまな生体物体中の薬物を同定および定量するための最も有望な方法の 1 つです。 この方法は、高い特異性、精度、および最小濃度で物質を測定できることを特徴としており、臨床検査診断にとって重要な薬物動態研究および薬物モニタリング中の薬物の定量測定に使用できます。 そのためには、HPLC-MS/MS法に基づく、革新的な医薬品を含む様々な医薬品の定量手法の開発と検証が必要です。

非ステロイド系抗炎症薬のグループの元の薬剤は、1,3,4-チアジアゾールアミドとアセキサム酸の新しい誘導体であるアセキサゾラミドです。 この化合物の重要な利点は、毒性が低く、潰瘍形成性が低いことです。 薬物動態研究を実施し、さまざまな投与経路を通じてこの薬物のバイオアベイラビリティを評価するには、体液中の薬物を定量するための信頼できる方法を開発する必要があります。

この研究の目的は、HPLC-MS/MS を使用して、チアジアゾール誘導体のグループからの新しい非ステロイド性抗炎症薬を同定および定量するための技術の開発でした。

材料と方法

研究の目的は、OJSC「VNTs BAV」（Staraya Kupavna）で教授によって合成された、研究室コードLHT 7-09を持つチアジアゾールの新しい誘導体でした。 S.Ya. スカチロワ (図 1)。

2-(5-エチル-1,3,4-チアジアゾリル)アミド 2-アセチルアミノヘキサン酸

米。 1. LHT 7-09 の化学構造（総式：C 12 H 20）N 4 O2S; モル質量 284.4グラム/モル)

化合物ＬＨＴ ７－０９は、外観上は白色の粉末であり、水にはほとんど溶けず、アルコールには可溶で、アセトニトリルには易溶である。

検証済みの質量分析検出を備えた高速液体クロマトグラフィー (HPLC-MS/MS) メソッドを使用して、LCT 7-09 を同定および定量しました。

クロマトグラフィーは、Agilent 1260 InfinityII 高速液体クロマトグラフ (Agilent Technologies、ドイツ) を使用して実行されました。 この研究では、Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 µm 2.1 x 10 mm 分析カラムを使用しました。 研究中の化合物を単離するために、勾配クロマトグラフィー モードを開発しました。 アセトニトリル、脱イオン水、および酢酸アンモニウムをさまざまな比率で溶離液として使用しました。

質量分析には、エレクトロスプレー イオン源 (TurboIonSpray プローブを備えた TurboV) を備えた ABSciexQTrap 3200 MD トリプル四重極質量分析計 (ABSciex、シンガポール) を使用しました。 質量分析計は、6.1×10 -2 mg/lの濃度のレセルピン試験溶液を使用して校正した。

研究サンプルの質量分析は、サンプルとクロマトグラフによって供給される溶出液を直接注入するエレクトロスプレー モードで実行されました。 質量クロマトグラフへの試験サンプルの直接注入は、直径4.61mmのシリンジポンプを用いて10μl/分の速度で実施した。

新しいチアジアゾール誘導体を同定および定量する方法を開発する際には、高速液体クロマトグラフィーおよび質量検出に最適な条件が選択されました。 クロマトグラフィーカラムからの物質の放出時間とMRM遷移が考慮されました（登録が実行されました） メートル/z最初の分析四重極 Q1 上のプリカーサー イオンと メートル/z 2 番目の分析四重極のプロダクト イオン Q3)。 LCT 7-09 を定量化するために、0.397 ～ 397 ng/ml の濃度範囲で検量線グラフを作成しました。

ソフトウェアとしてAnalystMD 1.6.2.Software(ABSciex)を使用した。

結果と考察

実験研究の第一段階では、シリンジポンプを用いて試験サンプルを質量検出器に直接導入して質量検出を行いました。 サンプル調製段階では、アセトニトリルとイオン水の２：１の混合物に酢酸アンモニウム（０．１％）を加えて、ＬＨＴ ７－０９の溶液（５００ｎｇ／ｍｌ）を調製した。

予備実験では、陽イオンの登録モードでは、陰イオンの登録モードよりも LHT 7-09 の測定感度が高く、質量スペクトルがより強力で有益であることが示されました。 この点に関して、さらなる研究では、正イオン化モードのみが使用されました。

強いピークを得るために、次の質量検出条件が選択されました。 : 正分極、エレクトロスプレー電圧５５００．０Ｖ、デクラスタリング電位および注入電位－それぞれ３６．０Ｖおよび６．５Ｖ、カーテンガス圧力２０．０ｐｓｉおよび噴霧ガス圧力４０．０ｐｓｉ、速度１０μｌ／分。 スキャン範囲は 270 ～ 300 Da でした。

最初の分析用四重極 Q1 で得られた質量スペクトルの分析により、これらの条件下では、水素プロトンの追加により、研究対象の化合物のプロトン化分子 + が次の値で形成されることがわかりました。 メートル/ z 285.2 はい（図 2）。

米。 2. プロトン化分子 LHT 7-09 の質量スペクトル (陽イオン + スキャンモード)

2 番目の分析四重極 Q3 では、プリカーサー イオンのプロダクト イオンが次の値で記録されました。 m/z 285.2 はい。 二次質量スペクトルの分析により、多くのピークの存在が示され、そのうちの 3 つが最も強度が高かった - m/z 114.2Da、 m/z 130.2Daと m/z 75.1 Da (図 3)。

米。 3. プロダクトイオンの質量スペクトル（正イオンスキャンモード、プリカーサーイオン）メートル/ z285.2 はい）

高強度のイオン信号を取得するために、Q2 コリジョン セルの最適なエネルギー値が選択されました (0 ～ 400 V のエネルギー範囲が考慮されました)。 値を持つプロダクトイオンの場合 メートル/ z 114.2 Da、130.2 Da、75.1 Da。衝突セル内の最適エネルギーはそれぞれ 27 V でした。 23Vと49V。

値を持つプロダクトイオンが存在すると仮定します。 メートル/ z他の 1,3,4-チアジアゾール誘導体の断片化でも同じ値のプロダクト イオンが明らかになるため、114.2 Da は 5-アミノ-2-エチル-1,3,4-チアジアゾールの断片です。 メートル/ z。 意味のあるプロダクトイオン メートル/ z 130.2 Da はおそらくアセキサム酸のプロトン化部分です。 したがって、研究中のサンプルの質量検出の結果により、新しい 1,3,4-チアジアゾール誘導体の化学構造が確認されました。

実験研究の次の段階では、試験化合物を HPLC 質量分析法で分析しました。

HPLC-MS/MS モードでは、次のイオン化条件を使用しました:エレクトロスプレー電圧 5500.0 V、移動相流量 400 μL/分、窒素温度 400 °C、カーテンガスとスプレーフロー圧力それぞれ 20.0 と 50.0 psi。 単一質量スペクトルの記録速度は 1 秒あたり 100 スペクトルでした。 要約された質量スペクトルを取得するために、クロマトグラム上で 10.5 ～ 11.5 分の時間を選択しました。 プロダクトイオンの信号の強度に基づいて、イオン電流の時間依存性の曲線と、研究対象の化合物に対応する個々の信号のピーク面積が構築されました。 分析カラムに導入されたサンプルの量は10μlであった。

研究中の化合物を単離するために、高速液体クロマトグラフィーのグラジエントモードが使用されました。これは、分析カラムの入口で溶離液の組成を変更することによって保証されました。 アセトニトリル、脱イオン水、および酢酸アンモニウムをさまざまな比率で溶離液として使用しました。 グラジエントクロマトグラフィーモードを選択した理由は、定組成溶出モード（異なる濃度のアセトニトリルを使用する場合を含む）の条件下では、保持時間の対称形状の被験物質のピークを得ることができなかったためです。分析に適しています。 研究によると、最適な溶離液供給モードは次のとおりでした。0 ～ 4 分、アセトニトリル濃度は 1%。 4 分から 8 分まで、アセトニトリル濃度は 99% まで直線的に増加します。 8〜12分間 - 定組成セクション（1％アセトニトリル）。 研究が完了したら、クロマトグラフィーカラムを 30% アセトニトリル溶液で 5 分間洗浄しました。

上記のクロマトグラフィー モードを使用すると、研究対象の化合物について十分な強度の対称ピークが得られました (図 4)。

米。 4. クロマトグラム LHT 7-09（分析カラム）アジレントPoroshell 120 EC-C18 2.7 μm 2.1×10 mm; グラジエントクロマトグラフィーモード)

異なる濃度の LCT 7-09 溶液について得られたクロマトグラムの分析により、これらの溶出条件下での保持時間 (tR) は 11 分であり、研究対象の物質の濃度に依存しないことが示されました。 この点において、保持時間の値は、多成分混合物中の LHT 7-09 の信頼性を確認するための追加の基準として使用できます。 注目すべきは、これらのクロマトグラフィー パラメーターを質量検出器だけでなく、測光などの他の検出器を使用して LHT 7-09 を識別するために使用できるという事実です。

新しいチアジアゾール誘導体を定量するために、0.397 ng/ml ～ 397 ng/ml の濃度範囲で検量線グラフを作成しました (図 5)。

米。 5. LCT 7-09の濃度を決定するための検量線グラフ（横軸に沿ってLCT 7-09の濃度（ng/ml）、縦軸に沿ってパルス（パルス）のピーク面積）

キャリブレーション溶液を開発するために、LHT 7-09 の溶液を 0.397 の濃度で使用しました。 1.980; 3.970; 19.8; 39.7; 198.0; 397.0ng/ml。 研究対象の化合物の濃度に対するピーク面積の依存性は、次の回帰式で説明されます。

y= 8.9e 5 ・x 0.499、回帰係数の値は r=0.9936 でした。

なお、今回開発した校正液により、広範囲の濃度において対象化合物の高精度な定量が可能となり、医薬品の品質評価や薬物動態研究への応用が可能となります。

したがって、研究の結果は、HPLC-MS/MS を使用してチアジアゾールの新しいアミノ酸誘導体を同定および定量するための方法の開発でした。

結論

1. HPLC-MS/MS を使用すると、チアジアゾールの新規アミノ酸誘導体を高精度で同定および定量できます。
2. 新しいチアジアゾール誘導体 LHT 7-09 の質量検出は、陽イオンスキャン モード (MRM 遷移 - プリカーサー イオン Q1) で実行する必要があります。 メートル/ z 285.2 はい。 プロダクトイオン Q3 メートル/ z 114.2Da、 メートル/ z 130.2Daと メートル/ z 75.1Da）。
3. 多成分混合物から LCT 7-09 を分離するために、高速液体クロマトグラフィー技術が開発されました (分析カラム Agilent Poroshell 120 EC-C18 2.7 μm 2.1×10 mm、溶離液 アセトニトリル: 脱イオン水: 酢酸アンモニウム、グラジエント モード)。

書誌リンク