Aplikácia tandemovej hmotnostnej spektrometrie (HPLC-MSMS) v klinickej diagnostike. Aplikácia tandemovej hmotnostnej spektrometrie (HPLC-MSMS) v klinickej diagnostike HPLC MS čo

Používanie vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie spojenej s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (HPLC-MS/MS) v klinických laboratóriách za posledných 10 až 12 rokov ohromne vzrástlo, podľa prehľadu publikovaného v Clinical Biochemist Reviews. Autori poznamenávajú, že špecifickosť analýzy HPLC-MS/MS je výrazne lepšia ako imunologické metódy a klasická vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) na analýzu molekúl s nízkou molekulovou hmotnosťou a má výrazne vyššiu priepustnosť ako plynová chromatografia-hmotnostná spektrometria (GC -PANI). Obľúbenosť tejto metódy v rutinných klinických analýzach sa v súčasnosti vysvetľuje jedinečnými schopnosťami metódy.

Hlavné výhody metódy HPLC-MS/MS sú:
• Možnosť presnej kvantitatívnej analýzy malých molekúl;
• Simultánna analýza viacerých cieľových zlúčenín;
• Jedinečná špecifickosť;
• Vysoká rýchlosť analýzy.

V posledných rokoch sa veľká pozornosť venovala času analýzy a v dôsledku toho zvyšovaniu produktivity laboratórií. Významné skrátenie času analýzy je možné vďaka použitiu krátkych analytických kolón pre HPLC/MS/MS, pričom sa dramaticky zvyšuje špecifickosť analýzy. Použitie ionizácie za atmosferického tlaku (API), tandemového trojitého kvadrupólového hmotnostného spektrometra a pokročilej vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, ako aj súvisiacich techník prípravy vzoriek prinieslo HPLC-MS/MS do popredia moderných analytických metód klinického výskumu.

Hlavné oblasti použitia HPLC/MS/MS v klinickej medicíne:
• Získanie úplného metabolického profilu panelov steroidov, purínov a pyrimidínov a iných zlúčenín,
  skríning novorodencov na vrodené chyby metabolizmu (záchyt niekoľkých desiatok ochorení jedným testom);
• Terapeutické monitorovanie liekov - imunosupresíva, perotikonvulzíva, antiretrovírusové, antikoagulanciá a iné - bez ohľadu na dostupnosť súprav výrobcu. Nie je potrebné kupovať drahé súpravy pre každú látku - môžete si vyvinúť vlastné metódy;
• Klinická toxikológia – analýza viac ako 500 omamných látok a ich metabolitov v jednej analýze, bez konfirmačnej analýzy
  proteomika a metabolomika.

Okrem toho sa HPLC-MSMS používa na skríning močových oligosacharidov, sulfatidu, mastných kyselín s dlhým reťazcom, žlčových kyselín s dlhým reťazcom, kyseliny metylmalónovej, štúdie porfýrie a skríning pacientov s poruchami metabolizmu purínov a pyrimidínov.

Príklady aplikácií kvapalinovej chromatografie
v kombinácii s tandemovou hmotnostnou spektrometriou v klinických analýzach.

Skríning novorodencov: Prvým príkladom širokého využitia HPLC-MS/MS v klinickej diagnostike bol skríning vrodených porúch metabolizmu u novorodencov. V súčasnosti je to vo vyspelých krajinách rutinná metóda a pokrýva viac ako 30 rôznych ochorení vrátane acedémie, aminoacidopatie a defektov oxidácie mastných kyselín. Zvlášť pozoruhodné sú štúdie vrodených chýb, ktoré môžu viesť k vážnym problémom, ak nie sú okamžite riešené (napríklad zväčšenie srdca alebo pečene alebo opuch mozgu). Výhodou použitia HPLC-MS/MS na skríning novorodencov je schopnosť súčasne analyzovať všetky aminokyseliny a acylkarnitíny rýchlym, nenákladným a vysoko špecifickým spôsobom.

Terapeutické monitorovanie liekov: Vývoj a zavedenie imunosupresívneho lieku sirolimus (rapamycín) na prevenciu odmietnutia orgánu po transplantácii bol jedným z hlavných hnacích síl pre zavedenie HPLC-MS/MS do klinických laboratórií. Moderná metóda HPLC-MS/MS umožňuje súčasné stanovenie takrolimu, sirolimu, cyklosporínu, everolimu a kyseliny mykofenovej.

HPLC-MS/MS sa používa aj na analýzu cytotoxických, antiretrovírusových liečiv, tricyklických antidepresív, antikonvulzív a iných liečiv, ktoré vyžadujú individuálne dávkovanie.

Metóda HPLC-MSMS umožňuje separáciu a kvantifikáciu R- a S-enantiomérov warfarínu v koncentračnom rozsahu 0,1-500 ng/ml.

Narkotiká a lieky proti bolesti: HPLC-MS/MS sa široko používa na analýzu týchto zlúčenín kvôli ľahkej príprave vzorky a krátkemu času analýzy. Metóda sa v súčasnosti používa v klinických laboratóriách na skríning na prítomnosť širokého spektra liečiv. Jedinečná špecifickosť a citlivosť metódy umožňuje súčasne analyzovať viac ako 500 zlúčenín rôznych tried v jednej vzorke s minimálnou prípravou vzorky. Takže v prípade rozboru moču stačí jednoduché zriedenie vzorky 50-100 krát. Pri analýze vlasov namiesto zväzku 100-200 vlasov stačí jediný vlas na spoľahlivú identifikáciu faktov o užívaní drog.

Endokrinológia a analýza steroidov: HPLC-MS/MS je široko používaný v mnohých endokrinologických laboratóriách na analýzu steroidov - testosterónu, kortizolu, aldesterónu, progesterónu, estriolu a mnohých ďalších.

Čoraz viac laboratórií začína používať HPLC-MS/MS na stanovenie hladín vitamínu D3 a D2 v krvi.

I. Stanovenie steroidov (profil steroidov).

Nemocničné a klinické laboratóriá majú teraz možnosť vykonávať simultánne stanovenie viacerých steroidov pomocou HPLC/MS/MS. V tomto prípade nie je potrebný veľký objem vzorky, čo je obzvlášť dôležité pri analýze pediatrických vzoriek.

Prípady, v ktorých je vhodné určiť niekoľko (profilujúcich) steroidov:
• Vrodená adrenálna hyperplázia (CAH) je vrodená chyba biosyntézy steroidov. Ide o dedičnú skupinu ochorení spôsobených nesprávnou aktivitou enzýmov v kôre nadobličiek, čo vedie k zníženej produkcii kortizolu. Pre spoľahlivú diagnostiku NAS sa odporúča merať kortizol, androstendión a 17-hydroxyprogesterón. HPLC/MS/MS umožňuje presnú kvantifikáciu všetkých troch steroidov v jedinej analýze so 100% spoľahlivosťou.
• Rutinný novorodenecký skríning pomocou imunotestov sa vyznačuje vysokou mierou pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov. Stanovenie pomocou HPLC/MS/MS nielen kortizolu, ale aj aldosterónu a 11-deoxykortizolu umožňuje odlíšiť primárnu od sekundárnej adrenálnej insuficiencie.
• HPLC/MS/MS umožňuje stanovenie steroidov pri prostatitíde a syndróme chronickej panvovej bolesti.
• HPLC-MS/MS dokáže určiť profily steroidov a identifikovať príčiny predčasnej puberty súvisiacej s kôrou nadobličiek u malých detí. Zistilo sa, že koncentrácie testosterónu, androstendiónu, dehydroepiandrosterónu (DHEA) a jeho sulfátu u týchto detí boli o niečo vyššie ako u starších kontrolných detí.
• Sérum aktívnych fajčiarov, pasívnych fajčiarov a nefajčiarov sa analyzuje na prítomnosť 15 steroidných hormónov a hormónov štítnej žľazy, aby sa preskúmal vzťah medzi expozíciou pacientov fajčeniu a koncentráciami hormónov.
• HPLC/MS/MS sa používa pri profilovaní niektorých ženských steroidných hormónov v moči.
• HPLC/MS/MS sa použila na vyhodnotenie koncentrácií neuroaktívnych hormónov na prevenciu diabetickej neuropatie.

II. Stanovenie hormónov štítnej žľazy

Rutinné metódy na stanovenie hormónov štítnej žľazy sa zvyčajne spoliehajú na rádioimunotesty, ktoré sú drahé a detegujú iba T3 a T4, čo môže obmedziť schopnosť určiť a plne regulovať funkciu štítnej žľazy.

• V súčasnosti sa pomocou HPLC-MSMS vykonáva simultánna analýza piatich hormónov štítnej žľazy vo vzorkách séra, vrátane tyroxínu (T4), 3,3′,5-trijódtyronínu (T3), 3,3′,5′- (rT3) 3,3'-dijódtyronín (3,3'-T2) a 3,5-dijódtyronín (3,5-T2) v koncentračnom rozmedzí 1 - 500 ng/ml.
• Metóda HPLC/MS/MS sa používa aj na analýzu zloženia hormónov u pacientov, ktorí podstúpili tyreoidektómiu. Stanovia sa hladiny koncentrácií tyroxínu (T4), trijódtyronínu (T3), voľného T4 a hormónu stimulujúceho štítnu žľazu (TSH) po operácii. Zistilo sa, že HPLC/MS/MS je vynikajúcim spôsobom na stanovenie vzťahu medzi koncentráciami TSH a hormónov štítnej žľazy.
• Na stanovenie tyroxínu (T4) v ľudských slinách a sére bola použitá metóda HPLC/MS/MS. Metóda sa vyznačuje vysokou reprodukovateľnosťou, presnosťou a detekčným limitom 25 pg/ml. Štúdie ukázali, že medzi euthyroidnými subjektmi a pacientmi s Gravesovou chorobou existuje diagnostický vzťah v koncentráciách T4 v slinách.

Metóda HPLC/MS/MS má teraz citlivosť, špecifickosť a presnosť potrebnú na spoľahlivé stanovenie všetkých steroidov v biologických tekutinách a zlepšuje tak diagnostické možnosti, najmä v prípade stanovenia sád steroidov.

III. Stanovenie 25-hydroxyvitamínu D pomocou HPLC/MS/MS

25-hydroxy vitamín D (25OD) je hlavnou cirkulujúcou formou vitamínu D a prekurzorom jeho aktívnej formy. (1,25-dihydroxyvitamín D). Stanovenie 25OD je vzhľadom na jeho dlhý polčas dôležité pre stanovenie stavu vitamínu D v tele pacienta. Vitamín D existuje v dvoch formách: vitamín D3 (cholekalciferol) a vitamín D2 (ergokalciferol). Obe formy sa metabolizujú na svoje príslušné 25OD formy. Veľký význam pre diagnostiku má dostupnosť analytických metód, ktoré dokážu s vysokou presnosťou stanoviť obe formy vitamínu a umožňujú sledovanie pacientov s deficitom vitamínu D. Doteraz používané metódy neumožňovali samostatné stanovenie vitamínu D2 a D3. Navyše, pri vysokých koncentráciách vitamínu D2 je detekovateľné množstvo D3 podhodnotené. Ďalšou nevýhodou je použitie rádioaktívnych izotopov. Použitie metódy HPLC/MS/MS umožnilo nielen vyhnúť sa použitiu rádioaktívnych izotopov, ale aj vykonať oddelené stanovenie oboch aktívnych foriem vitamínu.

Metóda je vhodná pre nasledujúcich pacientov:
1. Ak máte podozrenie na nízku hladinu vitamínu D v tele;
2. Ak existuje podozrenie na nevysvetliteľnú toxicitu;
3. Pri vyšetrovaní pacientov podstupujúcich liečbu na nízku hladinu vitamínu D;
4. Použitie HPLC/MS/MS umožnilo oddelené stanovenie oboch foriem pri monitorovaní pacientov.

IV. Stanovenie imunosupresív pomocou HPLC/MS/MS

Po transplantácii orgánov sa musia doživotne užívať imunosupresívne lieky, aby nedošlo k odmietnutiu. Pri veľmi úzkom terapeutickom rozmedzí a vysokej toxicite vyžadujú imunosupresíva individuálne dávkovanie, aby sa dosiahol maximálny účinok. Preto je dôležité monitorovanie hlavných imunosupresívnych liekov: cyklosporínu A, takrolimu, sirolimu a everolimu, aby sa upravila dávka liekov pre každého jednotlivého pacienta v závislosti od koncentrácie lieku v krvi.

Na monitorovanie týchto liekov sa stále používajú imunotesty, ale tieto metódy sú drahé a majú obmedzenú špecifickosť, presnosť a reprodukovateľnosť. Existujú prípady úmrtia pacientov na nesprávne dávkovanie imunosupresív na základe výsledkov získaných pomocou imunologických metód. V súčasnosti sa imunotesty v klinických laboratóriách nahrádzajú HPLC/MS/MS. Na Mníchovskej univerzitnej klinike sa teda denne analyzuje približne 70 vzoriek na obsah sirolimu a cyklosporínu A pomocou systému HPLC/MS/MS. Celú prípravu vzoriek a kontrolu prístroja vykonáva jeden zamestnanec. Laboratórium tiež prechádza na testovanie takrolimu pomocou tejto metódy.

• Je opísané použitie HPLC/MS/MS na rutinné simultánne stanovenie takrolimu, sirolimu, askomycínu, demetixisirolimu, cyklosporínu A a cyklosporínu G v krvi. Rozsah určený koncentráciou je 1,0 - 80,0 ng/ml. Pre cyklosporín 25 - 2000 ng/ml. Počas roka laboratórium analyzovalo viac ako 50 000 vzoriek.
• Keďže sa zistilo, že súčasné použitie takrolimu a sirolimu má pozitívny terapeutický účinok, bola vyvinutá jednoduchá a účinná metóda HPLC/MS/MS na ich samostatné stanovenie v krvi na klinickú analýzu. Analýza jednej vzorky trvá 2,5 minúty s presnosťou v rozsahu od 2,46 % - 7,04 % pre takrolimus a 5,22 % - 8,30 % pre sirolimus pre celú analytickú krivku. Spodná hranica detekcie pre takrolimus je 0,52 ng / ml, pre sirolimus - 0,47 ng / ml.

V. Stanovenie homocysteínu pomocou HPLC/MS/MS

Homocysteín je zaujímavý pri srdcovo-cievnych ochoreniach (tromboembolizmus, srdcové choroby, ateroskleróza) a iných klinických stavoch (depresia, Alzheimerova choroba, osteoporóza, tehotenské komplikácie atď.). Súčasné metódy analýzy homocysteínu, vrátane imunotestov, sú drahé. Rýchla metóda HPLC/MS/MS na analýzu homocysteínu bola vyvinutá pre rutinné klinické použitie pri analýze veľkého počtu vzoriek. Ionizácia bola uskutočnená elektrosprejovou metódou. Metóda je reprodukovateľná, vysoko špecifická a presná. Výhodou metódy sú aj nízke náklady na činidlá a jednoduchosť prípravy vzorky. Za deň je možné analyzovať 500 alebo viac vzoriek.

Záver

Je potrebné poznamenať, že aj keď sa v súčasnosti používajú výrazne vylepšené metódy imunoanalýzy, v dôsledku technických základných obmedzení táto metóda nikdy nebude mať presnosť a špecifickosť pre cieľovú látku porovnateľnú s HPLC-MSMS, najmä v prítomnosti metabolitov. To vedie nielen k nízkej presnosti metódy ELISA a vysokému percentu falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov, ale tiež neumožňuje porovnávanie výsledkov získaných na rôznych klinických oddeleniach metódou ELISA. Použitie HPLC-MS/MS odstraňuje túto nevýhodu a umožňuje vysoko špecifickú, presnú a rýchlu analýzu veľkého počtu vzoriek s vysokou spoľahlivosťou v prítomnosti metabolitov a bez interferencie sprievodných a endogénnych látok nachádzajúcich sa v plazme a krvi. pacientov.

Napriek zjavne vysokým nákladom na komplex nástrojov, ako ukazuje svetová prax, pri správnej prevádzke sa tento komplex vyplatí za 1-2 roky. K tomu dochádza predovšetkým v dôsledku nízkych nákladov na jednu analýzu v dôsledku simultánnej analýzy desiatok a stoviek zlúčenín a absencie potreby nákupu drahých diagnostických súprav. Okrem toho má laboratórium možnosť nezávisle vyvinúť akékoľvek potrebné analytické metódy a nezávisí od výrobcu súpravy.

Výber správnej konfigurácie prístrojového vybavenia

Existuje veľké množstvo rôznych metód hmotnostnej spektrometrie a typov hmotnostných spektrometrov navrhnutých na riešenie širokého spektra problémov – od štrukturálnej identifikácie komplexných proteínových makromolekúl s hmotnosťou stovky tisíc daltonov až po rutinnú vysokovýkonnú kvantitatívnu analýzu malých molekúl.

Na úspešné vyriešenie problému je jednou z hlavných podmienok výber správneho typu zariadenia. Neexistuje žiadne univerzálne zariadenie, ktoré by vám umožnilo vyriešiť celý rad analytických problémov. Zariadenie určené na riešenie problému identifikácie mikroorganizmov teda nie je schopné vykonávať kvantitatívnu analýzu malých molekúl. A naopak. Faktom je, že napriek zaužívanému názvu ide o úplne odlišné zariadenia fungujúce na iných fyzikálnych princípoch. V prvom prípade ide o hmotnostný spektrometer doby letu s laserovým ionizačným zdrojom - MALDI-TOF a v druhom o trojitý kvadrupól s elektrosprejovou ionizáciou - HPLC-MSMS.

Druhým najdôležitejším parametrom je výber správnej konfigurácie systému. Existuje niekoľko významných výrobcov zariadení na hmotnostnú spektrometriu. Zariadenia každého výrobcu majú nielen svoje silné stránky, ale aj slabiny, o ktorých väčšinou radšej mlčia. Každý výrobca vyrába svoj vlastný rad zariadení. Náklady na jeden analytický komplex sa pohybujú od 100 000 do 1 000 000 alebo viac dolárov. Výber optimálneho výrobcu a správnej konfigurácie zariadenia nielen ušetrí značné finančné prostriedky, ale aj efektívnejšie vyrieši úlohu. Bohužiaľ, existuje veľa príkladov, kedy sa laboratórne vybavenie vykonalo bez zohľadnenia týchto faktorov. Výsledkom je nečinné vybavenie a vyhodené peniaze.

Tretím faktorom, ktorý rozhoduje o úspešnom fungovaní laboratória, je personál. Obsluha hmotnostných spektrometrov si vyžaduje vysokokvalifikovaný personál. Žiaľ, ani jedna univerzita v Rusku nemá kurz modernej praktickej hmotnostnej spektrometrie, najmä vo vzťahu ku klinickým aplikáciám, a úlohy školenia personálu v každom laboratóriu sa musia riešiť samostatne. Prirodzene, 2-3 dni úvodného školenia, ktoré vedie výrobca po uvedení zariadenia na trh, absolútne nestačia na pochopenie základov metódy a nadobudnutie zručností pri obsluhe zariadenia.

Štvrtým faktorom je nedostatok hotových analytických metód. Každé laboratórium má svoje prioritné úlohy, pre ktoré je potrebné vyvinúť vlastné metódy. Môže to urobiť osoba, ktorá má aspoň 2-3 roky skúseností s obsluhou zariadenia. Výrobcovia niekedy dodávajú jednu alebo dve všeobecné metódy odporúčacieho charakteru, ale neprispôsobujú ich špecifickým úlohám laboratória.

IN BioPharmExpert LLC Zamestnávame špecialistov s dlhoročnými skúsenosťami s prácou na rôznych typoch hmotnostných spektrometrov, ako aj vývojom metód a vykonávaním vysokovýkonných analýz. Preto poskytujeme nasledovné služby:

1. Výber optimálnej konfigurácie zariadenia pre špecifické úlohy klienta.
2. Nákup, dodávka a spustenie zariadení od popredných výrobcov tandemových hmotnostných spektrometrov Postupné zaškolenie personálu do jedného roka od dátumu spustenia zariadenia.
3. Súbor hotových techník a databáz na riešenie základných klinických problémov.
4. Vývoj analytických metód a riešenie špecifických problémov klienta v jeho laboratóriu so zapojením jeho personálu.
5. Metodická podpora vo všetkých fázach práce.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je metóda stĺpcovej chromatografie, pri ktorej mobilná fáza (MP) je kvapalina, ktorá sa pohybuje cez chromatografickú kolónu naplnenú stacionárnou fázou (sorbent). HPLC kolóny sa vyznačujú vysokým hydraulickým tlakom na vstupe do kolóny, a preto sa HPLC niekedy nazýva "vysokotlaková kvapalinová chromatografia".

V závislosti od mechanizmu separácie látok sa rozlišujú tieto možnosti HPLC: adsorpcia, delenie, iónová výmena, vylučovanie veľkosti, chirálna atď.

Pri adsorpčnej chromatografii dochádza k separácii látok v dôsledku ich rôznych schopností adsorbovať a desorbovať z povrchu adsorbenta s vyvinutým povrchom, napríklad silikagélu.

Pri deliacej HPLC dochádza k separácii v dôsledku rozdielu v distribučných koeficientoch separovaných látok medzi stacionárnou fázou (zvyčajne chemicky naočkovanou na povrch stacionárneho nosiča) a mobilnou fázou.

Na základe polarity sa PF a NP HPLC delia na normálnu fázu a reverznú fázu.

Normálna fáza je variant chromatografie, ktorý používa polárny sorbent (napríklad silikagél alebo silikagél s naočkovanými skupinami NH2 alebo CN) a nepolárny PF (napríklad hexán s rôznymi prísadami). Vo verzii chromatografie s reverznou fázou sa používajú nepolárne chemicky modifikované sorbenty (napríklad nepolárny alkylový radikál C18) a polárne mobilné fázy (napríklad metanol, acetonitril).

Pri iónomeničovej chromatografii sa molekuly zmesi látok, disociované v roztoku na katióny a anióny, pri pohybe cez sorbent (katiónomenič alebo aniónomenič) oddeľujú v dôsledku ich rôznych rýchlostí výmeny s iónovými skupinami sorbentu.

Pri veľkostnej vylučovacej (sietová, gélová permeácia, gélová filtrácia) chromatografii sa molekuly látok oddeľujú podľa veľkosti v dôsledku ich rozdielnej schopnosti prenikať do pórov stacionárnej fázy. V tomto prípade kolónu ako prvé opúšťajú najväčšie molekuly (s najvyššou molekulovou hmotnosťou) schopné preniknúť do minimálneho počtu pórov stacionárnej fázy a ako posledné opúšťajú látky s malou molekulovou hmotnosťou.

k oddeleniu často dochádza nie jedným, ale viacerými mechanizmami súčasne.

Metódu HPLC možno použiť na kontrolu kvality akéhokoľvek analytu, ktorý nie je plynný. Na vykonanie analýzy sa používajú vhodné prístroje - kvapalinové chromatografy.

Kvapalný chromatograf zvyčajne obsahuje tieto hlavné komponenty:

– jednotka na prípravu PF vrátane nádoby s mobilnou fázou (alebo nádob s jednotlivými rozpúšťadlami zahrnutými v mobilnej fáze) a odplyňovacieho systému PF;

- čerpací systém;

– mixér mobilnej fázy (ak je to potrebné);

– systém zavádzania vzorky (injektor);

– chromatografická kolóna (môže byť inštalovaná v termostate);

- detektor;

– systém zberu a spracovania údajov.

Čerpací systém

Čerpadlá dodávajú PF do kolóny pri danej konštantnej rýchlosti. Zloženie mobilnej fázy môže byť konštantné alebo sa môže počas analýzy meniť. V prvom prípade sa proces nazýva izokratický av druhom - gradient. Na filtrovanie mobilnej fázy sa niekedy pred čerpací systém inštalujú filtre s priemerom pórov 0,45 µm. Moderný čerpací systém kvapalinového chromatografu pozostáva z jedného alebo viacerých počítačom riadených čerpadiel. To vám umožňuje zmeniť zloženie PF podľa špecifického programu počas gradientovej elúcie. Miešanie zložiek PF v mixéri môže prebiehať ako pri nízkom tlaku (pred čerpadlami), tak aj pri vysokom tlaku (za čerpadlami). Miešač možno použiť na prípravu PF a počas izokratickej elúcie, avšak presnejší pomer zložiek sa dosiahne predmiešaním zložiek PF pre izokratický proces. Čerpadlá pre analytickú HPLC umožňujú udržiavať konštantný prietok PF do kolóny v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min pri tlaku na vstupe kolóny do 50 MPa. Odporúča sa však, aby táto hodnota neprekročila 20 MPa. Tlakové pulzácie sú minimalizované špeciálnymi tlmiacimi systémami, ktoré sú súčasťou konštrukcie čerpadiel. Pracovné časti čerpadiel sú vyrobené z materiálov odolných voči korózii, čo umožňuje použitie agresívnych komponentov v zložení PF.

Bola vyvinutá validovaná metóda HPLC-MS/MS na identifikáciu a kvantifikáciu nového derivátu 1,3,4-tiadiazolovej aminokyseliny LXT7-09. Maximálna citlivosť hmotnostnej spektrometrickej detekcie LHT7-09 bola dosiahnutá v režime detekcie kladných iónov pri elektrosprejovom napätí 5500 V a deklastrovom potenciáli 36 V. Identifikované MRM prechody potvrdili chemickú štruktúru nového derivátu aminokyseliny 1. ,3,4-tiadiazol. Na efektívnu izoláciu LXT7-09 z viaczložkových zmesí tiadiazolylamidov bol vyvinutý gradientový režim vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s použitím zmesi acetonitrilu a deionizovanej vody v rôznych pomeroch ako eluentu. Pre tieto chromatografické podmienky bol retenčný čas zlúčeniny LHT7-09 stanovený na 11 minút. Na kvantitatívne stanovenie zlúčeniny LHT7-09 bol vyvinutý kalibračný roztok pre závislosť plochy chromatografického píku od koncentrácie roztoku.

HPLC-ms/ms

chromatografia

hmotnostná spektrometria

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Štúdia protizápalovej aktivity nových tiadiazolových derivátov pri formalínom vyvolanom edéme labky u potkanov / Yu.G. Kazaišvili, N.S. Popov // Moderné problémy vedy a vzdelávania. – 2013. – č. 3. www..

2. Nové tiadiazolové deriváty s antifungálnou aktivitou / A.S. Koshevenko [et al.] // Pokroky v lekárskej mykológii. – 2015. – T. 14. – S. 348-351.

3. Syntéza a protinádorová aktivita nových furyl-2-substituovaných 1,3,4-tiadiazolov, 1,2,4-triazolov / T.R. Hovsepyan [et al.] // Chemicko-farmaceutický časopis. – 2011. – T. 45. – č. 12. – S. 3-7.

4. Popov N.S., Demidová M.A. Hodnotenie akútnej toxicity nového aminokyselinového derivátu tiadiazolu pri intraperitoneálnom podaní myšiam / N.S. Popov, M.A. Demidova // Lekársky časopis Horná Volga. – 2016. – T. 15, číslo. 1. – S. 9-12.

5. Popov N.S., Demidová M.A. Hodnotenie ulcerogenity nového aminokyselinového derivátu tiadiazolu pri intragastrickom podaní potkanom / N.S. Popov, M.A. Demidová // Doktorandka. – 2017. – Číslo 1(80). – s. 71-78.

6. Syntéza a antimikrobiálna aktivita amidov fenyltio- a benzylsulfonyloctových kyselín na báze 2-amino-5-alkyl(arylalkyl)-1,3,4-tiadiazolov / S.A. Serkov [et al.] // Chemicko-farmaceutický časopis. – 2014. – T. 48, č. 1. – S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Syntéza a farmakologická aktivita derivátov imidazotiadiazolu // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Zv. 73.č. 4. S. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed. Syntéza a protirakovinová aktivita nového 1-tia-4-azaspirodekánu, ich odvodených tiazolopyrimidínových a 1,3,4-tiadiazolových tioglykozidov // Molekuly. 2017. Č. 22 ods. S. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Soli 5-amino-2-sulfónamid-1,3,4-tiadiazolu, štruktúrneho a analógu acetazolamidu, vykazujú zaujímavé inhibičné vlastnosti na karboanhydrázu, diuretický a antikonvulzívny účinok // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Zv. 12.č. 6. S. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Syntéza a antifungálna aktivita 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinónových zlúčenín na báze kyseliny dehydroabietovej // Molekulárna diverzita. 2016. Zv. 20.č. 4. S. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Syntéza, biologické hodnotenie a štúdium molekulového modelovania nových (1,2,4-triazol alebo 1,3,4-tiadiazol)-metyltio-derivátov chinazolín-4(3H)-ónu ako inhibítorov DHFR // Bioorganic Chemistry. 2017. Zv. 72. S. 282-292.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s hmotnostnou spektrometrickou detekciou je jednou z najsľubnejších metód na identifikáciu a kvantitatívne stanovenie liečiv v rôznych biologických objektoch. Metóda sa vyznačuje vysokou špecifickosťou, presnosťou a schopnosťou stanoviť látky v minimálnych koncentráciách, čo umožňuje jej využitie na kvantitatívne stanovenie liečiv pri farmakokinetických štúdiách a monitorovaní liečiv, čo je významné pre klinickú laboratórnu diagnostiku. Na tento účel je potrebné vyvinúť a validovať metódy kvantitatívneho stanovenia rôznych liečivých látok, vrátane inovatívnych, na báze metódy HPLC-MS/MS.

Pôvodným liekom zo skupiny nesteroidných antiflogistík je acexazolamid, nový derivát 1,3,4-tiadiazolamidu a kyseliny acetamovej. Významnou výhodou tejto zlúčeniny je nízka toxicita a nízka ulcerogenita. Na uskutočnenie farmakokinetických štúdií a posúdenie biologickej dostupnosti tohto liečiva rôznymi spôsobmi podávania je potrebné vyvinúť spoľahlivú metódu na jeho kvantitatívne stanovenie v biologických tekutinách.

Účel tejto štúdie bol vývoj techniky na identifikáciu a kvantitatívne stanovenie nového nesteroidného protizápalového liečiva zo skupiny tiadiazolových derivátov pomocou HPLC-MS/MS.

Materiály a metódy

Predmetom štúdie bol nový derivát tiadiazolu s laboratórnym kódom LHT 7-09, syntetizovaný v OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) prof. S.Ya. Škačilovej (obr. 1).

2-(5-etyl-1,3,4-tiadiazolyl)amid 2-acetylaminohexánová kyselina

Ryža. 1. Chemická štruktúra LHT 7-09 (hrubý vzorec: C12H20N 4 O 2S; molárna hmotnosť 284,4g/mol)

Zlúčenina LHT 7-09 vzhľadom je biely prášok, ktorý je prakticky nerozpustný vo vode, rozpustný v alkohole a ľahko rozpustný v acetonitrile.

Na identifikáciu a kvantifikáciu LCT 7-09 bola použitá validovaná metóda vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s hmotnostnou spektrometrickou detekciou (HPLC-MS/MS).

Chromatografia sa uskutočnila s použitím vysokovýkonného kvapalinového chromatografu Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Nemecko). V štúdii sa použila analytická kolóna Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 um 2,1 x 10 mm. Na izoláciu skúmanej zlúčeniny sme vyvinuli režim gradientovej chromatografie. Ako eluenty boli použité acetonitril, deionizovaná voda a octan amónny v rôznych pomeroch.

Na hmotnostnú spektrometriu bol použitý trojitý kvadrupólový hmotnostný spektrometer ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) s elektrosprejovým iónovým zdrojom (TurboV so sondou TurboIonSpray). Hmotnostný spektrometer bol kalibrovaný pomocou rezerpínového testovacieho roztoku s koncentráciou 6,1 x 10-2 mg/l.

Hmotnostná spektrometrická analýza študovaných vzoriek sa uskutočnila v režime elektrosprej s priamym vstrekovaním vzorky a eluátu dodávaného chromatografom. Priame vstrekovanie testovaných vzoriek do hmotnostného chromatografu bolo uskutočnené pomocou injekčnej pumpy s priemerom 4,61 mm pri rýchlosti 10 μl/min.

Pri vývoji metódy identifikácie a kvantifikácie nového tiadiazolového derivátu boli zvolené optimálne podmienky pre vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu a hmotnostnú detekciu. Zohľadnil sa čas uvoľnenia látky z chromatografickej kolóny a prechod MRM (registrácia bola vykonaná m/z prekurzorový ión na prvom analytickom kvadrupóle Q1 a m/z produktové ióny na druhom analytickom kvadrupóle Q3). Na kvantifikáciu LCT 7-09 bol vytvorený kalibračný graf v koncentračnom rozsahu od 0,397 do 397 ng/ml.

Ako softvér bol použitý AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Výsledky a diskusia

V prvej fáze experimentálnej štúdie sa uskutočnila hromadná detekcia testovanej vzorky jej priamym zavedením do hmotnostného detektora pomocou injekčnej pumpy. V štádiu prípravy vzorky bol pripravený roztok LHT 7-09 (500 ng/ml) v zmesi acetonitrilu a ionizovanej vody v pomere 2:1 s prídavkom octanu amónneho (0,1 %).

Predbežné experimenty ukázali, že v režime registrácie kladných iónov bola citlivosť stanovenia LHT 7-09 vyššia a hmotnostné spektrum intenzívnejšie a informatívnejšie ako v režime registrácie záporných iónov. V tomto ohľade sa v ďalších štúdiách použil iba pozitívny ionizačný režim.

Na získanie intenzívneho píku boli vybrané nasledujúce podmienky detekcie hmotnosti: : pozitívna polarizácia, elektrosprejové napätie 5500,0 V, deklastračný potenciál a vstrekovací potenciál - 36,0 a 6,5 ​​V, v tomto poradí, s tlakom clonového plynu 20,0 psi a tlakom rozprašovacieho plynu 40,0 psi, rýchlosťou 10 μl/min. Rozsah skenovania bol 270-300 Da.

Analýza získaného hmotnostného spektra prvého analytického kvadrupólu Q1 ukázala, že za týchto podmienok v dôsledku pridania protónu vodíka vzniká protónovaná molekula študovanej zlúčeniny + s hodnotou m/ z 285,2 Áno (obr. 2).

Ryža. 2. Hmotnostné spektrum protónovanej molekuly LHT 7-09 (v pozitívnom iónovom + skenovacom režime)

Na druhom analytickom kvadrupóle Q3 boli zaznamenané ióny produktu pre prekurzorový ión s hodnotou m/z 285,2 Áno. Analýza hmotnostného spektra 2. rádu ukázala prítomnosť mnohých píkov, z ktorých 3 boli najintenzívnejšie - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da a m/z 75,1 Da (obr. 3).

Ryža. 3. Hmotnostné spektrum produktových iónov (v režime skenovania kladných iónov, prekurzorový iónm/ z285,2 áno)

Na získanie iónového signálu s vysokou intenzitou boli zvolené optimálne hodnoty energie v kolíznej bunke Q2 (uvažoval sa energetický rozsah od 0 do 400 V). Pre produktové ióny s hodnotami m/ z 114,2 Da, 130,2 Da a 75,1 Da Optimálna energia v kolíznom článku bola 27 V; 23 V a 49 V.

Predpokladá sa, že produkt ión s hodnotou m/ z 114,2 Da je fragment 5-amino-2-etyl-1,3,4-tiadiazolu, pretože fragmentácia iných derivátov 1,3,4-tiadiazolu tiež odhaľuje produktový ión s rovnakou hodnotou m/ z. Produktový ión s významom m/ z 130,2 Da je pravdepodobne protónovaná časť kyseliny acetamovej. Výsledky hromadnej detekcie skúmanej vzorky teda potvrdili chemickú štruktúru nového derivátu 1,3,4-tiadiazolu.

V ďalšom štádiu experimentálnej štúdie sa testovaná zlúčenina analyzovala pomocou HPLC-hmotnostnej spektrometrie.

V režime HPLC-MS/MS sa použili nasledujúce podmienky ionizácie: napätie elektrospreja 5500,0 V, prietok mobilnej fázy 400 ul/min, teplota dusíka 400 °C, clonový plyn a tlak prietoku spreja 20,0 a 50,0 psi. Rýchlosť záznamu jednotlivých hmotnostných spektier bola 100 spektier za sekundu. Na získanie súhrnného hmotnostného spektra sa na chromatograme zvolil časový úsek 10,5 až 11,5 minúty; Na základe intenzity signálu produktových iónov boli skonštruované krivky časovej závislosti iónového prúdu a vrcholová plocha jednotlivých signálov zodpovedajúcich skúmanej zlúčenine. Objem vzorky zavedenej do analytickej kolóny bol 10 μl.

Na izoláciu skúmanej zlúčeniny sa použil gradientový režim vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie, ktorý bol zabezpečený zmenou zloženia eluentu na vstupe do analytickej kolóny. Ako eluenty boli použité acetonitril, deionizovaná voda a octan amónny v rôznych pomeroch. Výber režimu gradientovej chromatografie bol spôsobený skutočnosťou, že za podmienok izokratického elučného režimu (vrátane použitia rôznych koncentrácií acetonitrilu) nebolo možné získať pík testovanej látky symetrického tvaru s retenčným časom vhodné na analýzu. Podľa štúdie bol optimálny režim dodávky eluentu: od 0 do 4 minút, koncentrácia acetonitrilu bola 1 %; od 4 do 8 minút lineárne zvýšenie koncentrácie acetonitrilu na 99 %; od 8 do 12 minút - izokratická sekcia (1% acetonitril). Po dokončení štúdie sa chromatografická kolóna premývala 30 % roztokom acetonitrilu počas 5 minút.

Pri použití opísaného chromatografického režimu sa pre študovanú zlúčeninu získal symetrický pík dostatočnej intenzity (obr. 4).

Ryža. 4. Chromatogram LHT 7-09 (analytická kolónaAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 um 2,1 x 10 mm; gradientová chromatografia)

Analýza získaných chromatogramov pre roztoky LCT 7-09 rôznych koncentrácií ukázala, že retenčný čas (tR) za týchto elučných podmienok bol 11 minút a nezávisel od koncentrácie skúmanej látky. V tomto ohľade môže byť hodnota retenčného času použitá ako dodatočné kritérium na potvrdenie pravosti LHT 7-09 vo viaczložkových zmesiach. Pozoruhodný je fakt, že tieto chromatografické parametre je možné použiť na identifikáciu LHT 7-09 nielen pomocou hmotnostného detektora, ale aj iných detektorov, vrátane fotometrických.

Na kvantifikáciu nového tiadiazolového derivátu bol skonštruovaný kalibračný graf v koncentračnom rozsahu od 0,397 ng/ml do 397 ng/ml (obr. 5).

Ryža. 5. Kalibračný graf na určenie koncentrácie LCT 7-09 (na vodorovnej osi je koncentrácia LCT 7-09 v ng/ml, na zvislej osi je plocha vrcholu v impulzoch)

Na vývoj kalibračného roztoku sa použili roztoky LHT 7-09 v koncentráciách 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Závislosť plochy píku od koncentrácie študovanej zlúčeniny bola opísaná nasledujúcou regresnou rovnicou:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, hodnota regresného koeficientu bola r=0,9936.

Je potrebné poznamenať, že vyvinutý kalibračný roztok umožňuje vysoko presné kvantitatívne stanovenie študovanej zlúčeniny v širokom rozsahu koncentrácií, čo umožňuje použiť túto metódu na hodnotenie kvality liečivej látky a na vykonávanie farmakokinetických štúdií.

Výsledkom štúdie bol teda vývoj metódy na identifikáciu a kvantifikáciu nového aminokyselinového derivátu tiadiazolu pomocou HPLC-MS/MS.

závery

1. HPLC-MS/MS umožňuje identifikáciu a kvantifikáciu nového aminokyselinového derivátu tiadiazolu s vysokou presnosťou.
2. Hromadná detekcia nového tiadiazolového derivátu LHT 7-09 by sa mala vykonávať v režime skenovania pozitívnych iónov (prechod MRM - prekurzorový ión Q1 m/ z 285,2 Áno; produktové ióny Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da a m/ z 75,1 Da).
3. Na izoláciu LCT 7-09 z viaczložkových zmesí bola vyvinutá technika vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (analytická kolóna Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm; eluent acetonitril: deionizovaná voda: octan amónny; gradientový režim).

Bibliografický odkaz