Analýza Rsk. Sérologické metódy laboratórnej diagnostiky syfilisu

Nepriame metódy diagnostiky syfilisu.

Na diagnostiku syfilisu sa používa veľa výskumných metód, ktoré sa líšia technikou a účelom. Priame metódy sú zamerané na detekciu patogénu v skúmanom materiáli pomocou mikroskopie (mikroskopia v tmavom poli atď.) alebo PCR.

Okrem metód priamej detekcie treponema pallidum (T. pallidum) sa pri vyšetrovaní syfilisu široko používajú nepriame metódy ( sérologické) výskumné metódy, ktoré zisťujú protilátky proti pôvodcovi syfilisu v krvnom sére a mozgovomiechovom moku. Medzi nepriame metódy diagnostiky syfilisu patria sérologické reakcie ELISA, RPHA, DAC, RIF a RIF-abs, RIBT, PCR, expresná metóda, imunoblot a iné.

Sérologické metódy diagnostiky infekčných chorôb.

Sérologické diagnostické kritériá na základe špecifických reakcií antigén-protilátka. Antigény (zložky bunkových stien, bičíky, kapsuly, DNA a toxíny) ​​tých mikroorganizmov, ktoré je potrebné stanoviť, reagujú s protilátkami obsiahnutými v sére. Medzi antigénmi a im zodpovedajúcimi protilátkami dochádza k väzbe, ktorá je základom pre sérologické diagnostické metódy. Sérologické testy slúžia na stanovenie neznámeho antigénu (ktorého zdrojom je baktéria, vírus, toxín a pod.) pomocou známej protilátky alebo na stanovenie protilátky v sére pomocou známeho antigénu.

Sérologické reakcie sú klasifikované v závislosti od stavu antigénu a charakteristík prostredia, v ktorom antigén a protilátka interagujú, ako aj podľa spôsobu implementácie.

Na uskutočnenie sérologických reakcií sa používajú mnohé laboratórne metódy, ako je aglutinácia, precipitácia, fixácia komplementu, imunofluorescencia, enzýmová imunoanalýza a rádioimunoanalýza a iné. Tieto reakcie umožňujú účinnú predbežnú identifikáciu mikroorganizmov.

Séra, ktoré sú potrebné na vykonávanie sérologických reakcií, sa získavajú experimentálne, vyrábajú ich najmä vakcínové a sérové ​​ústavy a sú ponúkané ako súčasť komerčných diagnostických súprav.

Sérologické metódy sú dôležitým nástrojom v diagnostike a liečbe infekčných chorôb ľudí a zvierat, pretože s ich pomocou je možné nielen identifikovať pôvodcu choroby, ale aj detegovať špecifické protilátky proti zodpovedajúcim patogénom v krvi. pacientov a pozostalých. Sérologické metódy sú v súčasnosti najúčinnejšími diagnostickými metódami, keď je nemožné alebo ťažké izolovať patogén a relatívne zriedkavo poskytujú falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky.

Použitie sérologických metód na diagnostiku syfilisu

Sérologické laboratórne metódy na diagnostikovanie syfilisu sú založené na schopnosti tela poskytnúť imunitnú odpoveď na objavenie sa patogénu. Pomocou sérologických reakcií v krvnom sére (plazme) (alebo mozgomiešnom moku) sa zisťujú stopy imunitnej odpovede na infekciu, a to protilátky proti antigénom treponema pallidum, alebo samotné antigény.

Aby sa stanovila špecifická povaha existujúcich klinických prejavov (t. j. že sú dôsledkom syfilisu) a v budúcnosti bola kontrolovaná dynamika patologického procesu, bolo navrhnuté veľké množstvo sérologických výskumných metód. Rovnaké metódy sa tiež široko používajú na skríning populácie.

V súlade so súčasnými národnými smernicami a klinickými smernicami sa v mnohých krajinách sveta používajú pokročilé sérologické metódy v populačných prieskumoch na identifikáciu pacientov so syfilisom a na stanovenie klinickej diagnózy. Používajú sa ako v prítomnosti klinických príznakov ochorenia u pacientov, tak aj počas latentných období.

Sérologické testy sú jednou z najspoľahlivejších metód diagnostiky syfilisu. Štandardizované sérologické testy s regulovaným postupom sa nazývajú sérologické testy na syfilis. Vzhľadom na to, že takmer všetky sérologické reakcie na syfilis môžu byť za určitých podmienok falošne pozitívne alebo falošne negatívne, mali by sa brať v kombinácii a, ak je to potrebné, v dynamike.

Sérologické reakcie, ktoré sa používajú na stanovenie protilátok v krvnom sére pacienta, sa navzájom líšia v citlivosti, špecifickosti, zložitosti a cene. Na efektívnu sérodiagnostiku syfilisu sa okrem klasických metód využívajú imunologické testy a technológie, ktoré v 21. storočí dostali nový impulz pre rozvoj.

Protilátky sa detegujú rôznymi imunochemickými (sérologickými) metódami, vrátane sedimentárnych reakcií, enzýmových imunotestov, chemiluminiscenčných imunotestov, imunochromatografických testov, lineárneho imunoblottingu, štúdií pomocou prietokovej fluorometrie, technológie imunočipov a iných.

Sérodiagnostika (výskum pomocou sérologických metód) sa používa na:

• potvrdenie klinickej diagnózy syfilis,
• stanovenie diagnózy latentného syfilisu,
• sledovanie účinnosti liečby ako jedného z kritérií na vyliečenie pacientov so syfilisom,
• prevencia syfilisu (skríningové vyšetrenie určitých skupín obyvateľstva na identifikáciu patológie).

Najdôležitejšie vlastnosti požadované pre sérologické testy sú senzitivita, špecifickosť, reprodukovateľnosť

Rozhodujúcim kritériom pri výbere laboratórnej diagnostickej metódy je jej účinnosť - senzitivita, špecifickosť a reprodukovateľnosť.

Citlivosť je podiel pozitívnych výsledkov u pacientov. Citlivosť metódy je určená percentom pozitívnych výsledkov testov na vzorkách, o ktorých je známe, že obsahujú špecifické markery patogénov (napríklad antigény patogénov alebo protilátky proti nim).

Špecifickosť- podiel negatívnych výsledkov testov u zdravých pacientov. Špecifickosť metódy je určená percentom negatívnych výsledkov testov na vzorkách, o ktorých je známe, že neobsahujú špecifické markery patogénu. Čím vyššia je teda citlivosť a špecificita, tým je výskumná metóda spoľahlivejšia a spoľahlivejšia.

Dôležité diagnostické kritériá tiež zahŕňajú reprodukovateľnosť výsledky z opakovaných štúdií tých istých vzoriek. Je potrebné poznamenať, že napriek výraznému pokroku v oblasti špičkových technológií neexistujú žiadne metódy, ktoré by poskytovali 100 % (absolútnu) citlivosť a špecifickosť vo všetkých testovaných biologických testoch.

V súčasnosti sú v Rusku oficiálne registrované testovacie systémy, súpravy a prísady, ktoré majú menej ako 95 % senzitivitu a špecifickosť pri nastavovaní reakcie. Preto vždy existuje možnosť získať neadekvátny výsledok.

Klasifikácia testov podľa typu použitého antigénu. Treponemálne a netreponemálne testy na syfilis

V modernej venerológii sa na diagnostické účely používa viac ako tucet variantov sérologických reakcií na syfilis, ktoré možno rozdeliť do rôznych kategórií podľa rôznych kritérií. Klasifikácia sa uskutočňuje podľa metodiky výskumu, rozsahu, rýchlosti, nízkej ceny, požiadaviek na vybavenie laboratória a pod.

Treponemálne testy sú teoreticky špecifickejšie, ale prinášajú aj falošne pozitívne výsledky. Navyše neumožňujú rozlíšenie medzi neliečeným a vyliečeným syfilisom. Výsledky treponémových reakcií budú v oboch prípadoch pozitívne. Netreponemálne reakcie rozlišujú medzi neliečenou alebo nedávnou infekciou a vyliečenou infekciou.

Počas vyšetrenia sa odporúča vykonať treponémové aj netreponémové reakcie. Na stanovenie a potvrdenie diagnózy syfilisu sú potrebné pozitívne výsledky oboch typov testov – treponémového aj netreponémového. Preto sa netreponemálne testy používajú v kombinácii s treponemálnymi testami a vykonávajú sa pred, počas a po ukončení liečby v určitých časových intervaloch.

1. Netreponémové testy

Najznámejšie z netreponemálnych testov s vizuálnou interpretáciou výsledkov sú

• RW - Wassermanova reakcia s lipidovými antigénmi (doplnková fixačná reakcia s kardiolipínovým antigénom, PCK)
• Kanna reakcia (v súčasnosti sa nepoužíva),
• cytocholická Sachsova-Vitebského reakcia (v súčasnosti sa nepoužíva),
• mikroprecipitačná reakcia s plazmou alebo inaktivovaným sérom (MPR alebo RMP),
• RPR (Rapid Plasma Reagin Test),
• DÔVERUJTE (test s toluidínovou červenou a neohrievaným sérom, toluidínový červený neohrievaný sérový test).

Medzi netreponemálnymi testami sú 2 testy s mikroskopickým odčítaním výsledkov reakcie:

1. VDRL - (Laboratórium pre výskum pohlavných chorôb);

2. USR - test na stanovenie aktívnych reaginov v plazme (Unheated Serum Reagins).

Reaktivita v netreponemálnych testoch zvyčajne indikuje poškodenie tkaniva a nie je vždy špecifická pre syfilis. Jednoduchosť implementácie a nízke náklady umožňujú ich použitie ako skríningové reakcie pri stanovení predbežnej diagnózy syfilisu.

2. Treponémové testy

Treponemové testy používajú špecifické treponémové antigény. Tieto testy sú potrebné na potvrdenie diagnózy (RPGA, RIT, RIF a ELISA). Sú zložitejšie a drahšie ako testy skupiny 1, ale sú aj špecifickejšie a citlivejšie. Protilátky v mozgovomiechovom moku sa zisťujú aj pomocou treponémových testov.

Tradičné treponémové testy, ktoré potvrdzujú diagnózu syfilisu, vyžadujú drahé laboratórne vybavenie a skúsený personál, preto sa len zriedka vykonávajú mimo špecializovaných laboratórií. Tieto však teraz môžu byť nahradené jednoduchými a rýchlymi treponémovými reakciami, ktoré možno vykonať lokálne a použiť plnú krv. Uskutočnenie týchto reakcií si nevyžaduje zdĺhavé školenie ani špeciálne podmienky na skladovanie činidiel a zariadení.

Porovnávacia lacnosť, pohodlie a praktickosť treponémových expresných reakcií priťahuje pozornosť nielen ako metódy potvrdenia diagnózy. Tieto testy možno použiť na skríning syfilisu v primárnej starostlivosti (môžu sa vykonávať lokálne v tom istom zdravotníckom zariadení) alebo v oblastiach, kde nie sú dostupné laboratóriá. Keďže sa však protilátky proti T. pallidum detegujú v priebehu niekoľkých rokov, bez ohľadu na to, či bol pacient liečený alebo nie, nemožno použiť rýchle treponémové reakcie na posúdenie účinnosti liečby a diferenciálnej diagnostiky neliečeného a vyliečeného syfilisu.

Klasifikácia sérologických metód na diagnostiku syfilisu podľa typu zistených protilátok

V modernej dermatovenerológii sa na diagnostiku využívajú rôzne sérologické reakcie na syfilis. Niektoré metódy, ktoré boli relevantné pred desiatimi rokmi, sa už nepoužívajú z dôvodu zložitosti alebo nedostatku špecifickosti. V závislosti od zistených protilátok sú metódy sérologickej diagnostiky syfilisu rozdelené do troch skupín:

I. Lipidové (reagin) reakcie - stanovujú sa protilátky proti lipidovým antigénom (reagin):

1) flokulácia: mikroreakcia na skle s lipidovými antigénmi - expresná diagnostická metóda (precipitačné mikroreakcie - MRP), VDRL, CMF (kardiolipínový mikroflokulačný test), RPR atď.;

2) reakcia fixácie komplementu (CRF) s lipidovými antigénmi: Wassermanova reakcia (WR), kvalitatívne a kvantitatívne metódy, termostatické a studené (Kolmerova reakcia);

3) sedimentárne reakcie, ktoré sa v súčasnosti nepoužívajú: Cahnova zrážacia reakcia, cytocholická Sachsova-Vitebského reakcia atď.;

II. Skupinové treponémové reakcie - stanovujú sa protilátky proti skupinovým treponémovým antigénom (súčasť mikrobiálnej bunky patogénnych aj saprofytických treponémov):

1) RSC s Reiterovým proteínovým antigénom;

2) imunofluorescenčná reakcia (RIF);

3) imunitná adhézna reakcia (IAR).

III. Druhovo špecifické proteínové treponémové reakcie – stanovujú sa protilátky proti špecifickým druhovým antigénom Treponema pallidum:

1) imobilizačná reakcia Treponema pallidum (TRE);

2) imunofluorescenčná reakcia RIF-abs a jej varianty (IgM-FTA-ABS, 19S-IgM-FTA-ABS, atď.);

3) nepriama hemaglutinačná reakcia Treponema pallidum (IPHA) a jej modifikácia TPPA.

4) enzýmový imunotest (ELISA);

5) imunoblotovanie.

Praktické využitie sérologických testov na syfilis

Na rôzne praktické účely sa používajú rôzne sérologické reakcie.

V zahraničí sa pri hromadných prieskumoch populácie a pri nevyhnutnosti núdzového záchytu syfilisu využívajú netreponémové selekčné reakcie (VDRL, RPR a pod.). Diagnóza vyžaduje potvrdenie treponémovými testami FTA-ABS, FTA-ABS alebo TPPA. V súčasnosti sa odporúča používať ELISA ako náhradu za VDRL pri skríningových testoch. Je to spôsobené tým, že test ELISA sa vyznačuje citlivosťou, špecifickosťou, schopnosťou automatizovať výskum, ako aj vývojom diagnostických testovacích súprav. Okrem toho je opodstatnená opačná schéma poradia testovania na syfilis, keď sa najskôr použijú treponémové testy.

Na monitorovanie účinnosti terapie a na posúdenie aktivity infekcie sa odporúča kvantitatívna VDRL. Ako potvrdzujúci/doplnkový test sa používa test ELISA na antitreponemálne IgM protilátky.

V domácej praxi sa používa komplex sérologických reakcií (CSR) vrátane mikroprecipitačnej reakcie (MPR) s kardiolipínovým antigénom a RSC s kardiolipínovými a treponémovými antigénmi. Nedávno sa v DAC odporúča nahradiť RSK ELISA alebo RPGA. Používajú sa aj RIF (a jeho modifikácie - RIF-Abs a iné), RIBT.

RIBT sa používa ako vyšetrovacia reakcia v prípadoch nezrovnalostí v treponemálnych reakciách.

Prístupy k laboratórnej sérologickej diagnostike syfilisu v Ruskej federácii

Zavedenie jednotných metód klinického laboratórneho výskumu v ZSSR a Ruskej federácii do praxe umožnilo zaviesť progresívnejšie diagnostické metódy, zefektívniť prácu klinických diagnostických laboratórií, zvýšiť produktivitu práce, znížiť duplicitu laboratórnych vyšetrení a stalo sa základom na vývoj racionálnych foriem hotových reagenčných súprav.

V roku 1985 bola v ZSSR na zlepšenie diagnostiky syfilisu z diagnostického komplexu vylúčená netreponemálna reakcia RSC s nešpecifickým (Wassermannovým) antigénom a sedimentové reakcie (cytocholické a Cana), ako menej citlivé a ne poskytnutie dodatočných informácií.

Namiesto toho bolo v rámci komplexu sérologických reakcií na syfilis (CSR) poskytnuté použitie komplementovej fixačnej reakcie s treponémovými a kardiolipínovými antigénmi (RSKt) a mikroprecipitačnej reakcie s kardiolipínovým antigénom (RMA). Vyššia citlivosť a informačný obsah tohto súboru reakcií zabezpečili detekciu nielen reaginov, ale aj antitreponemálnych protilátok.

1985

1. RMP s kardiolipínovým antigénom s krvnou plazmou a inaktivovaným krvným sérom. Skríningový test na izolované použitie.

2. RSC s treponémovými a kardiolipidovými antigénmi; kvalitatívne a kvantitatívne metódy inscenovania, termostatické a studené;

3. imobilizačná reakcia Treponema pallidum (TRE); skúmavka a spôsob výroby melanže;

4. Imunofluorescenčná reakcia (RIF) v týchto modifikáciách: RIF s absorpciou (RIF-abs) s krvným sérom a kapilárnou krvou, RIF-200, RIF s celým likvorom (RIF-c); kvalitatívne a kvantitatívne metódy formulácie. Diagnostika latentnej a neskorej formy syfilisu, rozpoznanie DM (falošne pozitívne výsledky)

5. Komplex klasických sérologických reakcií (CSR): CSR (Wassermannova reakcia) s kardiolipínovými a treponemálnymi antigénmi + RMP. Preventívne vyšetrenie populácie na syfilis, diagnostika všetkých foriem syfilisu, sledovanie účinnosti liečby, vyšetrenie osôb kontaktovaných syfilisom.

V roku 2001 Ministerstvo zdravotníctva Ruskej federácie schválilo nový regulačný dokument upravujúci postup pri vykonávaní diagnostických testov - nariadenie Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie č. 87 z 26. marca 2001 „O zlepšení sérologickej diagnostiky syfilisu. .“

Pre zlepšenie laboratórnej diagnostiky syfilisu, zlepšenie kvality práce a zabránenie ďalšiemu šíreniu výskytu syfilisu sa odporúča pri diagnostike syfilisu ELISA a RPGA ako skríning nahradiť RSC v komplexe séroreakcií (SSR). a potvrdzujúce testy, pretože Tieto testovacie systémy sú vysoko citlivé, špecifické a reprodukovateľné.

Nariadenie č. 87 z 26. marca 2001 „O zlepšení sérologickej diagnostiky syfilisu“ stanovuje použitie nasledujúcich metód na séro- a likérovú diagnostiku syfilisu v Rusku:

1. RMP a cudzie analógy (VDRL, RPR a podobné mikroreakcie) ako skríningové testy na skríning populácie na syfilis. RMP sa vykonáva s plazmou alebo inaktivovaným krvným sérom.
2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Antigén z kultivovaného alebo patogénneho Treponema pallidum. Diagnostické reakcie vrátane diagnostiky likéru. Vzhľadom na jednoduchosť výroby a dostupnosť komerčných testovacích systémov je možné ich použiť ako skríningové testy.
3. Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA). Antigén z kultivovaného alebo patogénneho Treponema pallidum. Skríningové a diagnostické reakcie.
4. Kvalitatívne a kvantitatívne varianty RIF (RIF-abs, RIF-ts, RIF s kapilárnou krvou z prsta). Antigén - patogénny Treponema pallidum kmeň Nichols.
5. Komplex sérologických reakcií (CSR) na syfilis pozostávajúci z reakcie fixácie komplementu (CFR) s treponemálnymi a kardiolipínovými antigénmi a rakoviny močového mechúra. Reakciu fixácie komplementu je možné nahradiť ELISA alebo RPHA, aj v kombinácii s rakovinou močového mechúra. DAC označuje diagnostické testy.
6. Treponema pallidum imobilizačná reakcia (TRI), pri ktorej sa ako antigén používa patogénny Treponema pallidum kmeňa Nichols. RIBT sú diagnostické potvrdzujúce testy.

Preto sa odporúča naplánovať poradie vyšetrenia pacientov na syfilis v zdravotníckych zariadeniach takto:

1. Pri vstupnom vyšetrení sa vykonáva výberová (skríningová) mikroprecipitačná reakcia (RMP) alebo jej modifikácia (RPR, TRUST, VDRL) v kvantitatívnych a kvalitatívnych verziách a v prípade pozitívneho výsledku akýkoľvek špecifický potvrdzujúci treponémový test ( RPGA, ELISA, DAC, RIF), RIT);

2. Po ukončení terapie sa diagnostikuje RMP alebo jej modifikácia a podľa poklesu titra sa posudzuje dynamika infekčného procesu a účinnosť terapie. Za potvrdenie účinnosti terapie sa považuje zníženie titra 4 a viackrát v priebehu 1 roka.

Recepcia po dohode! sobota, nedeľa.

Sérologická metóda je súbor reakcií založených na interakcia antigén-protilátka (Ag-Ab) a zamerané na identifikáciu protilátok proti antigénom patogénov infekčných chorôb alebo samotných mikrobiálnych antigénov v krvnom sére a iných telesných tekutinách. Sérologická metóda sa vyznačuje vysokou citlivosťou a špecifickosťou. Väčšina reakcií tejto metódy sa dá ľahko uskutočniť a zaznamenať, je dostupná širokému spektru laboratórií, je zvyčajne bezpečná, ekonomická a podlieha štandardizácii. TO nedostatky Sérologická metóda zahŕňa: 1) nepriamu povahu výsledku, keď sa etiológia ochorenia neposudzuje podľa izolácie patogénu, ale podľa reakcie (imunity) tela na patogén; 2) potreba parenterálneho zásahu do tela pacienta; 3) vo väčšine prípadov neskorá diagnóza, ktorá sa vysvetľuje prirodzenou dynamikou humorálnej imunitnej odpovede; 4) možnosť zámeny anamnestických Abs (v dôsledku predchádzajúcej choroby alebo očkovania) s Abs so súčasnou infekciou. Pri určovaní mikrobiálnych antigénov 3 a 4 neexistujú žiadne nevýhody, ale je potrebné vziať do úvahy cirkulačné vlastnosti antigénov rôznych mikróbov a korelovať tieto vlastnosti s možnosťou odberu materiálu na výskum.

Etapy sérologickej metódy:

1) brať materiály na výskum. Vo väčšine prípadov ide o materiál krvné sérum. Získava sa po vytvorení krvnej zrazeniny, krv by sa mala odoberať za prísne aseptických podmienok podľa štandardných techník,

2) výber sérologickej reakcie pre daný prípad závisí od účelu štúdie, predpokladaného ochorenia, fázy ochorenia, materiálu pre štúdiu, citlivosti reakcie a schopností konkrétneho laboratória. Na detekciu Abs, ako aj Ags sa používajú aglutinačné reakcie ( RA) pasívna hemaglutinácia ( RPGA)), imunofluorescencia (REEF) inhibícia hemaglutinácie ( RTGA), zrážok, flokulácia, reakcia fixácie komplementu (FFR) atď.

3) nastavenie sérologickej reakcie,

4) registrácia sérologickej reakcie za účelom stanovenia prítomnosti sérologických markerov infekcie.

Rôzne sérologické reakcie sú charakterizované niekoľkými všeobecné vlastnosti:

1) keďže akékoľvek sérologické reakcie sú reakciami interakcie medzi Ab a Ag, potom vo všetkých prípadoch na stanovenie prítomnosti Ab v skúmanom substráte sa použije súbor známych štandardných korpuskulárnych alebo rozpustných Ag, tzv. diagnostika. Na druhej strane, aby sa zistila prítomnosť Ag, súbor imunitné diagnostické séra,

2) k interakcii Ag a Ab dochádza iba v prítomnosti elektrolytu, ktorým je zvyčajne izotonický roztok chloridu sodného alebo zmesi pufrov, pH systému by malo byť približne 7;

3) tvorba komplexu Ag-At si vyžaduje inkubačnú dobu za špeciálnych teplotných podmienok (od +4 °C do 37 °C). Tvorba špecifického imunitného komplexu nastáva rýchlo; jav viditeľný voľným okom (aglutinácia, lýza atď.) - pomaly, po niekoľkých hodinách alebo dokonca dňoch,

4) obe zložky sérologickej reakcie (antigén a protilátky) musia byť prítomné v ekvivalentných pomeroch. Nadbytok ktorejkoľvek zo zložiek blokuje tvorbu komplexu Ag-At a prispieva k falošne negatívnym výsledkom.

Sérologické reakcie sa zaznamenávajú vizuálne, niekedy pomocou lupy. Podstata zohľadnenia sérologickej reakcie spočíva v určení fenoménu väzby Ag a Ab tvorbou komplexu Ag-At. Vizuálne je vznik komplexu Ag-At sprevádzaný dvoma hlavnými javmi – aglutináciou a precipitáciou. Rozdiely medzi nimi sú určené charakteristikami antigénov a protilátok pre ne špecifických. Zároveň medzi mikrobiálnymi antigénmi existujú aj tie, ktoré vyvolávajú syntézu neprecipitujúcich, tvorba komplexu Ag-Ab v tomto prípade nie je sprevádzaná ani fenoménom aglutinácie, ani fenoménom precipitácie a identifikácie; skutočnosť, že vzniká komplex Ag-Ab, vyžaduje označenie diagnostickej zložky reakcie špeciálnymi značkami alebo prenos diagnostického antigénu do iného stavu agregácie.

Pri hodnotení reakcie sa používajú 3 hlavné kritériá: 1) prítomnosť a intenzita reakcie (v plusoch atď.); 2) diagnostický titer, 3) zvýšenie titra Ab v priebehu ochorenia 4-krát alebo viac. Prítomnosť reakcie je určená vizuálnymi javmi alebo väzbou imunochemického markera. Na posúdenie intenzity sérologickej reakcie sa používa princíp 4 „+“ (tabuľka 7).

Tabuľka 7.

Systém na hodnotenie sérologických reakcií pomocou 4 "+" pre aglutinačné a precipitačné reakcie

Na kvantitatívne vyjadrenie výsledkov sérologickej reakcie sa používa koncept titra protilátky alebo antigénu. Na stanovenie hladiny Ab (alebo titra Ag) je potrebné vykonať sérologickú reakciu prípravou série riedení krvného séra alebo iného materiálu (titrovať). Pri príprave riedení krvného séra sa používa roztok elektrolytu (najčastejšie izotonický roztok chloridu sodného). Krok riedenia (titrácia) je nastavený pomerom objemu roztoku elektrolytu a objemu krvného séra. Napríklad pri postupných riedeniach s krokom 2-krát sa v prvej skúmavke zmiešajú rovnaké objemy roztoku elektrolytu a krvného séra, s krokom 5-krát sa 1 objem séra pridá k 4 objemovým dielom elektrolytu. roztoku, s krokom 10-krát - s 9 1 objemom krvného séra sa pridá k objemu roztoku elektrolytu (tabuľka 8).

Stránka poskytuje referenčné informácie len na informačné účely. Diagnóza a liečba chorôb sa musí vykonávať pod dohľadom špecialistu. Všetky lieky majú kontraindikácie. Vyžaduje sa konzultácia s odborníkom!

Študovaný materiál

• krvné sérum
• sliny
• fekálne hmoty

• pôdy

Metóda analýzy alebo odberu krvi

Vlastnosti transportu krvi a skladovania séra

Na čo slúžia sérologické testy?

Základné metódy sérologickej diagnostiky

Imunofluorescenčná reakcia (RIF)

Imunofluorescenčná reakcia je veľmi náročný proces, ktorý si vyžaduje veľa času a zodpovednosti od špecialistu. Reakcia začína prípravou roztokov, potom sa séra a ich kontrolné vzorky titrujú ( proces, ktorý umožňuje určiť obsah určitej látky postupným miešaním testovaného roztoku s kontrolovaným množstvom činidla). Predtým pripravené riedenia a ich kontrolné vzorky sa opatrne nanesú na podložné sklíčka s antigénom. Potom sa prípravky inkubujú, nasleduje premytie a sušenie na vzduchu. Na podložné sklíčka s antigénom sa nanesie tenká vrstva antiséra, po ktorej sa uskutoční sekundárna inkubácia preparátov a celý predchádzajúci reťazec akcií sa zopakuje, končiac vysušením preparátu. V dôsledku toho sa prípravok na podložnom sklíčku ošetrí glycerolom a vyšetrí sa pod fluorescenčným mikroskopom.

Výsledky reakcie sa hodnotia na štvorbodovej stupnici, ktorá je charakterizovaná intenzitou povrchovej žltozelenej žiary antigénových buniek:
+ veľmi slabá žiara bunky, badateľná len na jej okraji
++ slabá žiara bunkovej periférie, ale s jasne viditeľným zeleným odtieňom
+++/++++ jasne zelená žiara bunkovej periférie
Za reakčný titer sa považuje riedenie séra, pri ktorom aspoň 50 % antigénových buniek vykazuje číru povrchovú žiaru, čo je výsledok reakcie +++ alebo ++++ . Hodnota reakčného rozsahu je od 1/80 do 1/100.

Intenzita reakcie závisí od počtu vyzrážaných červených krviniek na dne vytvorených otvorov:
– negatívna reakcia, ktorá sa vyznačuje ukladaním červených krviniek na dno jamiek vo forme malého krúžku s hladkými okrajmi alebo „tlačidla“
+ nízka intenzita, táto reakcia sa vyznačuje malými jednotlivými usadeninami na dne otvoru. Neaglutinované červené krvinky tvoria „malý prstenec“ v strede jamky
++ stredná intenzita, je charakterizovaná tvorbou „širokého hustého prstenca“ neaglutinovaných erytrocytov na dne otvoru
+++ intenzívna reakcia, aglutinované erytrocyty tvoria takzvané „dáždniky“, v strede ktorých sú jasne viditeľné prstence tvorené usadenými neaglutinovanými erytrocytmi
++++ prudko intenzívna reakcia, pri ktorej sa všetky červené krvinky zhlukujú a vytvoria „dáždniky“ vyložia dno jamiek.
Titer tejto reakcie sa považuje za posledné riedenie séra, pri ktorom sa deteguje zjavná aglutinácia erytrocytov min. +++ , teda s intenzívnou alebo prudko intenzívnou reakciou.

Spoľahlivosť a kvalita sérologických diagnostických metód závisí od organizácie internej a externej laboratórnej kontroly, ktorá pozostáva z niekoľkých nezávislých postupov určených na posúdenie kvality výsledkov analýzy.

Treponema pallidum imobilizačná reakcia(RIBT). Predpokladom je, aby pacient pred vyšetrením neužíval antibiotiká, ktoré pôsobia toxicky na Treponema pallidum a spôsobujú ich nešpecifickú imobilizáciu.

Pozitívne výsledky RIBT sa detegujú približne od polovice sekundárneho čerstvého obdobia syfilisu a môžu pretrvávať dlho po liečbe. V prípade potreby sa metóda používa na detekciu AT v CSF, táto štúdia sa vyznačuje vysokou špecifickosťou, ale nízkou senzitivitou (asi 40 %).

RIBT je málo užitočný na diagnostiku skorých foriem syfilisu v dôsledku neskorého (nie skôr ako 8-9 týždňov od okamihu infekcie) objavenia sa AT-imobilizínov; metóda môže poskytnúť falošne pozitívne výsledky, najmä u pacientov s autoimunitnou patológiou, malígnymi ochoreniami a cukrovkou. Okrem toho je RIBT pomerne zložitá, pracovne náročná a nákladná analýza, ktorá si vyžaduje vysoko kvalifikovaný personál a prítomnosť vivária, a preto sa v posledných rokoch používa iba v niektorých laboratóriách. V diagnostike sa RIBT používa ako reakčný rozhodca pri nezrovnalostiach vo výsledkoch iných sérologických štúdií, na odlíšenie falošne pozitívnych výsledkov a pri stanovení diagnózy neskorých foriem syfilisu.

Fixačná reakcia komplementu s treponémovým antigénom (RSC s TA) Senzitivita metódy je asi 80 %, špecificita 98 ​​%. Metóda bola súčasťou súboru štandardných sérologických reakcií na syfilis, upravených nariadením Ministerstva zdravotníctva ZSSR č. 1161 z 2. septembra 1985 „O zlepšení sérologickej diagnostiky syfilisu“. V súčasnosti je použitie tejto reakcie, podobne ako CSC s kardiolipínovým antigénom, obmedzené na jednotlivé laboratóriá.

Imunofluorescenčná reakcia (RIF). Na diagnostiku syfilisu sa používa niekoľko modifikácií RIF: RIF-c - na detekciu AT v CSF, RIF-200 (testovacie sérum sa pred reakciou zriedi 200-krát); RIF-abs (RIF s absorpciou), IgM-RIF-abs (na stanovenie IgM AT). Pokiaľ ide o citlivosť a špecifickosť, RIF-abs nie je horší ako RIBT, ale implementácia tejto metódy je oveľa jednoduchšia. Výsledky RIF-abs sa stávajú pozitívnymi od 3. týždňa po infekcii (pred objavením sa chancre alebo súčasne s ním), je to metóda na včasnú diagnostiku syfilisu. Pozitívne výsledky výskumu sa často zistia mnoho rokov po úplnej liečbe skorého syfilisu a u pacientov s neskorým syfilisom po celé desaťročia.

Indikácie na vykonávanie RIF-ab:

• pozitívne výsledky NTT u tehotných žien pri absencii klinických a anamnestických údajov indikujúcich syfilis;
• vyšetrenie osôb s rôznymi somatickými a infekčnými ochoreniami, pri ktorých sú zaznamenané pozitívne výsledky NTT;
• vyšetrenie osôb s klinickými prejavmi charakteristickými pre syfilis, ale s negatívnymi výsledkami NTT;
• včasná diagnostika syfilisu;
• v niektorých prípadoch - ako kritérium úspešnosti antisyfilitickej liečby: prechod pozitívneho RIF-abs na negatívny po liečbe je 100% kritériom na vyliečenie syfilisu.

IgM-RIF-abs sa používa na samostatnú detekciu protilátok tried Ig, čo je obzvlášť zaujímavé v diagnostike vrodeného syfilisu, keď protilátky proti treponému, syntetizované v tele dieťaťa, sú reprezentované IgM a IgG protilátky sú materské pôvodu. Indikácie pre túto štúdiu sú: diagnóza vrodeného syfilisu; hodnotenie výsledkov liečby včasného syfilisu.

RIF má vysokú senzitivitu (98,5 %) a špecificitu (99,6 %) pre takmer všetky formy syfilisu. Nevýhody RIF sú: nemožnosť automatizácie výskumu a zaznamenávania výsledkov; ťažkosti pri príprave vysokokvalitného antigénu zo suspenzie Treponema pallidum získanej zo semenníkov infikovaného králika; subjektivita pri hodnotení výsledkov.

Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA). Porovnanie výsledkov získaných pomocou RPGA a RIBT, RIF-abs, CSR, MRP ukázalo vysokú senzitivitu a špecifickosť RPGA pri diagnostike syfilisu, čo sa zhoduje s výsledkami RIF-abs.

RPGA je možné vykonávať v kvalitatívnych a kvantitatívnych verziách, existujú ich makro- a mikromodifikácie. Kvantitatívna metóda RPGA umožňuje odhadnúť koncentráciu špecifických protilátok proti treponemu v krvi. Titre 1:640 a nižšie sú typické pre pacientov liečených na syfilis v minulosti. Vyššie titre sú bežné pre aktívnu, neliečenú infekciu.

Pozitívne výsledky RPGA sa zvyčajne zaznamenávajú 3 týždne po objavení sa chancre a potom u pacientov, ktorí majú syfilis mnoho rokov, často celý život.

Citlivosť RPGA je 76 % pre primárny syfilis; 100 % pre sekundárny syfilis; 97 % pre latentný syfilis; 94 % na neskorý syfilis. Špecifickosť RPGA je vyššia ako špecifickosť RIF–abs, je 99 %.

Vďaka pomeru vysokej špecificity, senzitivity, jednoduchosti výkonu a štandardizácie reagencií medzi treponémovými testami na sérodiagnostiku syfilisu, RPGA trvalo zaujíma popredné miesto v klinickej praxi vo svete.

Špeciálne výhody ELISA sú: vysoká citlivosť a špecifickosť metódy; automatizácia nastavenia reakcie; vysoký stupeň štandardizácie; schopnosť študovať veľké množstvo vzoriek séra; v kvantitatívnom účtovníctve a objektívnej dokumentácii získaných výsledkov; možnosť súčasného stanovenia titra antitreponemálnych protilátok rôznych tried (IgG a IgM) v jednej vzorke; vhodnosť na včasnú diagnostiku syfilisu a diagnostiku vrodeného syfilisu; v jednoduchosti použitia na testovanie krvi v rámci transfúznej služby; použiteľnosť ako potvrdzujúci špecifický treponémový test. Senzitivita ELISA je 98–100 %, špecificita 96–100 %.

Nevýhody ELISA zahŕňajú: nevhodnosť na štúdium jednotlivých vzoriek; dlhšie obdobie pred dosiahnutím výsledku a kratšiu dobu použiteľnosti súprav ELISA, napríklad v porovnaní s RPGA.

Imunitný blot (IB). Jednou z moderných metód diagnostiky syfilisu je IB na stanovenie IgG alebo IgM protilátok proti niektorým protilátkam proti Treponema pallidum.

Metóda má vysokú senzitivitu (až 100 %), špecifickosť (98 %) a reprodukovateľnosť (100 %). Štúdia umožňuje študovať spektrum protilátok proti niekoľkým antigénom T. pallidum naraz pomocou vysoko purifikovaných rekombinantných a peptidových antigénov, ktoré znižujú nešpecifickú reaktivitu séra na minimum.

To všetko podmieňuje možnosť uprednostniť použitie metódy IB pred inými treponemálnymi testami na overenie diagnózy syfilis v zložitých prípadoch, najmä na diagnostiku syfilisu v druhej polovici inkubačnej doby, latentného vrodeného syfilisu v prvých dňoch r. života dieťaťa, na identifikáciu latentného syfilisu u osôb so slabou humorálnou odpoveďou, ako aj na odlíšenie falošne pozitívnych výsledkov od iných testov.

Infekčné choroby spúšťajú tvorbu vhodných protilátok v krvi chorého človeka. Takto funguje imunitná obrana tela.

Stanovenie prítomnosti protilátok proti špecifickému vírusu alebo baktérii umožňuje zistiť začiatok ochorenia skôr, ako sa objavia jeho hlavné príznaky. Najucelenejší obraz dnes poskytujú sérologické testy. Preto v tomto článku budeme hovoriť o sérologickom testovaní.

Čo sú sérologické testy

Metódy na štúdium biologických materiálov ľudí a zvierat, ktoré v nich dokážu detegovať protilátky alebo antigény, ktoré telo produkuje ako ochrannú reakciu v boji proti infekciám, sa nazývajú sérologické štúdie.

• Takéto metódy sa používajú na určenie pôvodcu infekcie, ako aj na účely:
• stanovenie krvnej skupiny,
• štúdium imunity prostredníctvom stanovenia úrovne jej humorálnej zložky,

stanovenie tkanivových antigénov.

Komu je predpísaný?

prečo to robiť?

• Metóda je odborníkmi oceňovaná ako spôsob, ako kvalitne diagnostikovať ochorenie.
• Ak je pacient v štádiu ochorenia, potom sa odporúča vykonať opakované štúdie v približne týždňových intervaloch, aby sa monitorovala účinnosť použitej liečby.

Sérologické testy sa často používajú na určenie, ktorý patogén spôsobil ochorenie po tom, čo ho pacient utrpel.

Typy procedúr

• Metódy sérologického výskumu sú založené na rôznych reakciách: Neutralizačná reakcia
• sa spolieha na vlastnosť protilátok imunitného séra pôsobiť ako neutralizačné činidlo proti toxínom alebo samotným mikroorganizmom, čím bráni ich škodlivým účinkom. Aglutinačná reakcia
  • , ktorý je zase rozdelený do nasledujúcich podtypov:
  • priame reakcie – používajú sa na testovanie krvného séra na prítomnosť protilátok. Do skúmanej kompozície sa pridávajú usmrtené mikróby a ak sa zrazenina objaví vo forme vločiek, znamená to, že reakcia na tento typ mikróbov je pozitívna;
• nepriama hemaglutinačná reakcia sa uskutočňuje zavedením erytrocytov do krvného séra, na ktorých sú adsorbované antigény; Tieto činidlá interagujú s rovnakým druhom antigénov prítomných v krvnom sére, čo vedie k vzniku vrúbkovanej zrazeniny. Reakcia zahŕňajúca komplement
• používa sa na detekciu infekčných chorôb. Metóda je implementovaná prostredníctvom aktivácie komplementu a pozorovania reakcií vyskytujúcich sa v skúmanom médiu. Zrážacia reakcia
• sa uskutočňuje navrstvením roztoku antigénu na tekuté médium - imunitné sérum. Antigén použitý pre túto metódu je rozpustný. Reakciou je, že komplex antigén-protilátka podlieha precipitácii; výsledná zrazenina sa nazýva zrazenina. je založená na skutočnosti, že mikróby alebo tkanivové antigény, spracované určitým spôsobom, získavajú schopnosť vyžarovať svetlo pod vplyvom ultrafialových lúčov. Metóda sa používa nielen na diagnostiku antigénov, ale aj na stanovenie liečivých látok, enzýmov a hormónov.

Kontraindikácie pre

Vzhľadom na to, že metóda zahŕňa štúdium biologického materiálu pacienta, nemôže mať negatívny vplyv na človeka. Preto neexistujú žiadne kontraindikácie na použitie.

Štúdia je úplne bezpečná.

Nižšie popíšeme, ako prebieha sérologický test.

Indikácie na testovanie

Metóda sa používa na určenie pôvodcu infekcie vrátane nasledujúcich chorôb:

• HIV infekcia,
• toxoplazmóza,
• infekčné choroby získané sexuálnym kontaktom;
• záškrt,
• dostupnosť;
• brucelóza,
• stafylokokové infekcie,
• hepatitída.

Táto metóda sa používa aj na identifikáciu nasledujúcich chorôb:

• opisthorchiáza,
• amébóza,
• cysticerkóza,
• giardiáza,
• zápal pľúc.

Príprava na postup

Na postup nie sú potrebné žiadne špeciálne prípravy. Musí sa dodržať jedna podmienka: odber krvi sa robí nalačno.

Algoritmus na odber vzoriek krvi (materiálu) na sérologické testovanie je opísaný nižšie.

Vykonávanie analýzy

Krv sa odoberá z ulnárnej žily. Aby štúdia fungovala, krv sa odoberá nie injekčnou striekačkou, ale gravitáciou. Ihla bez injekčnej striekačky sa zavedie do žily a do skúmavky sa odoberie až 5 ml krvi.

Počas postupu pacient pociťuje mierne nepohodlie, keď sa ihla zavádza do žily. Nasledujúce kroky nie sú vôbec znepokojujúce.

Interpretácia výsledkov sérologického krvného testu je popísaná nižšie.

Dekódovanie výsledkov

Získané výsledky by sa mali posudzovať v spojení s klinickým obrazom ochorenia, pričom by sa mala predpokladaná diagnóza skontrolovať pomocou niekoľkých testov. Je to spôsobené tým, že štúdie sú špecifické a niekedy nemajú absolútnu citlivosť na infekčné choroby.

Cena za komplexný sérologický krvný test je popísaná nižšie.

Priemerné náklady na postup

Cena zákroku bude závisieť od typu štúdia. Pozostáva z nákladov na vykonanie analýzy a nákladov na protilátky proti konkrétnemu patogénu. Priemerné náklady na postup sú do 700 rubľov.

Sérologické reakcie sú opísané vo videu nižšie: