Aplikace tandemové hmotnostní spektrometrie (HPLC-MSMS) v klinické diagnostice. Aplikace tandemové hmotnostní spektrometrie (HPLC-MSMS) v klinické diagnostice HPLC MS co

Použití vysokoúčinné kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS/MS) v klinických laboratořích za posledních 10 až 12 let ohromně vzrostlo, podle přehledu publikovaného v Clinical Biochemist Reviews. Autoři poznamenávají, že specifičnost analýzy HPLC-MS/MS výrazně převyšuje imunologické metody a klasickou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) pro analýzu molekul s nízkou molekulovou hmotností a má výrazně vyšší propustnost než plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (GC -SLEČNA). Popularita této metody v rutinních klinických analýzách je v současné době vysvětlena jedinečnými schopnostmi metody.

Hlavní výhody metody HPLC-MS/MS jsou:
• Možnost přesné kvantitativní analýzy malých molekul;
• Simultánní analýza více cílových sloučenin;
• Jedinečná specifičnost;
• Vysoká rychlost analýzy.

V posledních letech byla věnována velká pozornost času analýzy a v důsledku toho zvýšení produktivity laboratoře. Významné zkrácení doby analýzy je umožněno použitím krátkých analytických kolon pro HPLC/MS/MS, přičemž se dramaticky zvyšuje specifičnost analýzy. Použití ionizace za atmosférického tlaku (API), tandemového trojitého kvadrupólového hmotnostního spektrometru a pokročilé vysokoúčinné kapalinové chromatografie, stejně jako souvisejících technik přípravy vzorků, přineslo HPLC-MS/MS do popředí moderních analytických metod pro klinický výzkum.

Hlavní oblasti použití HPLC/MS/MS v klinické medicíně:
• Získání kompletního metabolického profilu panelů steroidů, purinů a pyrimidinů a dalších sloučenin,
  screening novorozenců na vrozené poruchy metabolismu (detekce několika desítek onemocnění v jednom testu);
• Terapeutické sledování léků - imunosupresiva, perotikonvulziva, antiretrovirika, antikoagulancia a další - bez ohledu na dostupnost sad výrobce. Není třeba kupovat drahé sady pro každou látku – můžete si vyvinout vlastní metody;
• Klinická toxikologie – analýza více než 500 omamných látek a jejich metabolitů v jedné analýze, bez konfirmační analýzy
  proteomika a metabolomika.

Kromě toho se HPLC-MSMS používá pro screening močových oligosacharidů, sulfatidů, mastných kyselin s dlouhým řetězcem, žlučových kyselin s dlouhým řetězcem, kyseliny methylmalonové, studie porfyrie a screening pacientů s poruchami metabolismu purinů a pyrimidinů.

Příklady aplikací kapalinové chromatografie
v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií v klinických analýzách.

Novorozenecký screening: Prvním příkladem širokého použití HPLC-MS/MS v klinické diagnostice byl screening vrozených poruch metabolismu u novorozenců. V současné době je to ve vyspělých zemích rutinní metoda a zahrnuje více než 30 různých onemocnění, včetně acedemie, aminoacidopatie a defektů oxidace mastných kyselin. Za zmínku stojí zejména studie vrozených vad, které mohou vést k vážným problémům, pokud nejsou okamžitě řešeny (například zvětšené srdce nebo játra nebo otok mozku). Výhodou použití HPLC-MS/MS pro screening novorozenců je schopnost současně analyzovat všechny aminokyseliny a acylkarnitiny rychlým, levným a vysoce specifickým způsobem.

Terapeutické monitorování léků: Vývoj a zavedení imunosupresivního léku sirolimus (rapamycin) k prevenci odmítnutí orgánu po transplantaci byl jedním z hlavních hnacích sil pro zavedení HPLC-MS/MS do klinických laboratoří. Moderní metoda HPLC-MS/MS umožňuje současné stanovení takrolimu, sirolimu, cyklosporinu, everolimu a kyseliny mykofenové.

HPLC-MS/MS se také používá pro analýzu cytotoxických, antiretrovirových léků, tricyklických antidepresiv, antikonvulziv a dalších léků, které vyžadují individuální dávkování.

Metoda HPLC-MSMS umožňuje separaci a kvantifikaci R- a S-enantiomerů warfarinu v koncentračním rozmezí 0,1-500 ng/ml.

Narkotika a léky proti bolesti: HPLC-MS/MS je široce používán pro analýzu těchto sloučenin kvůli snadné přípravě vzorku a krátké době analýzy. Metoda se v současnosti používá v klinických laboratořích ke screeningu na přítomnost široké škály léků. Jedinečná specifičnost a citlivost metody umožňuje současně analyzovat více než 500 sloučenin různých tříd v jednom vzorku s minimální přípravou vzorku. Takže v případě rozboru moči stačí 50-100x jednoduché naředění vzorku. Při analýze vlasů místo hromady 100-200 vlasů stačí jediný vlas ke spolehlivé identifikaci faktů o užívání drog.

Endokrinologie a analýza steroidů: HPLC-MS/MS je široce používána v mnoha endokrinologických laboratořích pro analýzu steroidů - testosteronu, kortizolu, aldesteronu, progesteronu, estriolu a mnoha dalších.

Stále více laboratoří začíná používat HPLC-MS/MS ke stanovení krevních hladin vitaminu D3 a D2.

I. Stanovení steroidů (profil steroidů).

Nemocniční a klinické laboratoře mají nyní možnost provádět simultánní stanovení více steroidů pomocí HPLC/MS/MS. V tomto případě není potřeba velký objem vzorku, což je zvláště důležité při analýze pediatrických vzorků.

Případy, kdy je vhodné určit několik (profilujících) steroidů:
• Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) je vrozená vada biosyntézy steroidů. Jedná se o dědičnou skupinu onemocnění způsobenou nesprávnou činností enzymů v kůře nadledvin, která vede ke snížení produkce kortizolu. Pro spolehlivou diagnostiku NAS se doporučuje měřit kortizol, androstendion a 17-hydroxyprogesteron. HPLC/MS/MS umožňuje přesnou kvantifikaci všech tří steroidů v jediné analýze se 100% spolehlivostí.
• Rutinní novorozenecký screening pomocí imunotestů je charakterizován vysokou mírou pozitivních a falešně negativních výsledků. Stanovení pomocí HPLC/MS/MS nejen kortizolu, ale také aldosteronu a 11-deoxykortizolu umožňuje odlišit primární a sekundární adrenální insuficienci.
• HPLC/MS/MS umožňuje stanovení steroidů u prostatitidy a syndromu chronické pánevní bolesti.
• HPLC-MS/MS může určit profily steroidů a identifikovat příčiny předčasné puberty související s kůrou nadledvin u malých dětí. Bylo zjištěno, že koncentrace testosteronu, androstendionu, dehydroepiandrosteronu (DHEA) a jeho sulfátu u těchto dětí byly mírně vyšší než u starších kontrolních dětí.
• Sérum aktivních kuřáků, pasivních kuřáků a nekuřáků je analyzováno na přítomnost 15 steroidních hormonů a hormonů štítné žlázy, aby se prozkoumal vztah mezi expozicí pacientů kouři a koncentracemi hormonů.
• HPLC/MS/MS se používá při profilování některých ženských steroidních hormonů v moči.
• HPLC/MS/MS byla použita k vyhodnocení koncentrací neuroaktivních hormonů pro prevenci diabetické neuropatie.

II. Stanovení hormonů štítné žlázy

Rutinní metody stanovení hormonů štítné žlázy obvykle spoléhají na radioimunotesty, které jsou drahé a detekují pouze T3 a T4, což může omezit schopnost stanovit a plně regulovat funkci štítné žlázy.

• V současné době se pomocí HPLC-MSMS provádí simultánní analýza pěti hormonů štítné žlázy ve vzorcích séra, včetně tyroxinu (T4), 3,3′,5-trijodthyroninu (T3), 3,3′,5′- (rT3) 3,3'-dijodthyronin (3,3'-T2) a 3,5-dijodthyronin (3,5-T2) v koncentračním rozmezí 1-500 ng/ml.
• Metoda HPLC/MS/MS se také používá k analýze složení hormonů u pacientů, kteří podstoupili tyreoidektomii. Stanoví se koncentrace tyroxinu (T4), trijodtyroninu (T3), volného T4 a hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH) po operaci. Bylo zjištěno, že HPLC/MS/MS je vynikající způsob, jak stanovit vztah mezi koncentracemi TSH a hormonů štítné žlázy.
• Ke stanovení tyroxinu (T4) v lidských slinách a séru byla použita metoda HPLC/MS/MS. Metoda se vyznačuje vysokou reprodukovatelností, přesností a detekčním limitem 25 pg/ml. Studie ukázaly, že existuje diagnostický vztah v koncentracích T4 ve slinách mezi euthyroidními subjekty a pacienty s Gravesovou chorobou.

Metoda HPLC/MS/MS má nyní citlivost, specificitu a přesnost potřebnou pro spolehlivé stanovení všech steroidů v biologických tekutinách a zlepšuje tak diagnostické možnosti zejména v případě stanovení sad steroidů.

III. Stanovení 25-hydroxyvitamínu D pomocí HPLC/MS/MS

25-hydroxy vitamin D (25OD) je hlavní cirkulující forma vitaminu D a prekurzor jeho aktivní formy. (1,25-dihydroxyvitamín D). Stanovení 25OD je vzhledem k jeho dlouhému poločasu důležité pro stanovení stavu vitaminu D v těle pacienta. Vitamin D existuje ve dvou formách: vitamin D3 (cholekalciferol) a vitamin D2 (ergokalciferol). Obě formy jsou metabolizovány na své příslušné 25OD formy. Velký význam pro diagnostiku má dostupnost analytických metod, které dokážou s vysokou přesností stanovit obě formy vitaminu a umožňují sledování pacientů s deficitem vitaminu D. Dosud používané metody neumožňovaly samostatné stanovení vitaminu D2 a D3. Navíc při vysokých koncentracích vitaminu D2 je detekovatelné množství D3 podhodnoceno. Další nevýhodou je použití radioaktivních izotopů. Použití metody HPLC/MS/MS umožnilo nejen vyhnout se použití radioaktivních izotopů, ale také provést oddělené stanovení obou aktivních forem vitaminu.

Metoda je vhodná pro tyto pacienty:
1. Pokud máte podezření na nízkou hladinu vitaminu D v těle;
2. Pokud je podezření na nevysvětlenou toxicitu;
3. Při vyšetřování pacientů podstupujících léčbu pro nízkou hladinu vitaminu D;
4. Použití HPLC/MS/MS umožnilo oddělené stanovení obou forem při sledování pacientů.

IV. Stanovení imunosupresiv pomocí HPLC/MS/MS

Po transplantaci orgánů je nutné doživotně užívat imunosupresivní léky, aby nedošlo k rejekci. S velmi úzkým terapeutickým rozsahem a vysokou toxicitou vyžadují imunosupresiva individuální dávkování k dosažení maximálního účinku. Proto je nezbytné monitorování hlavních imunosupresivních léků: cyklosporinu A, takrolimu, sirolimu a everolimu, aby bylo možné upravit dávku léků pro každého jednotlivého pacienta v závislosti na koncentraci léku v krvi.

K monitorování těchto léků se stále používají imunotesty, ale tyto metody jsou drahé a mají omezenou specificitu, přesnost a reprodukovatelnost. Existují případy úmrtí pacientů na nesprávné dávkování imunosupresiv na základě výsledků získaných pomocí imunologických metod. V současné době jsou imunotesty v klinických laboratořích nahrazovány HPLC/MS/MS. Na Univerzitní klinice v Mnichově je tak denně analyzováno asi 70 vzorků na obsah sirolimu a cyklosporinu A pomocí systému HPLC/MS/MS. Veškerou přípravu vzorků a kontrolu přístroje provádí jeden pracovník. Laboratoř také přechází na testování takrolimu touto metodou.

• Je popsáno použití HPLC/MS/MS pro rutinní simultánní stanovení takrolimu, sirolimu, askomycinu, demetixisirolimu, cyklosporinu A a cyklosporinu G v krvi. Rozsah stanovený koncentrací je 1,0 - 80,0 ng/ml. Pro cyklosporin 25 - 2000 ng/ml. Během roku laboratoř analyzovala více než 50 000 vzorků.
• Protože bylo zjištěno, že současné použití takrolimu a sirolimu má pozitivní terapeutický účinek, byla vyvinuta jednoduchá a účinná metoda HPLC/MS/MS pro jejich samostatné stanovení v krvi pro klinickou analýzu. Analýza jednoho vzorku trvá 2,5 minuty s přesností v rozmezí 2,46 % - 7,04 % pro takrolimus a 5,22 % - 8,30 % pro sirolimus pro celou analytickou křivku. Spodní hranice detekce pro takrolimus je 0,52 ng/ml, pro sirolimus - 0,47 ng/ml.

V. Stanovení homocysteinu pomocí HPLC/MS/MS

Homocystein je zajímavý u kardiovaskulárních onemocnění (tromboembolismus, srdeční choroby, ateroskleróza) a dalších klinických stavů (deprese, Alzheimerova choroba, osteoporóza, těhotenské komplikace atd.). Současné metody analýzy homocysteinu, včetně imunotestů, jsou drahé. Rychlá metoda HPLC/MS/MS pro analýzu homocysteinu byla vyvinuta pro rutinní klinické použití při analýze velkého množství vzorků. Ionizace byla provedena elektrosprejovou metodou. Metoda je reprodukovatelná, vysoce specifická a přesná. Výhodou metody je také nízká cena reagencií a snadná příprava vzorku. Za den je možné analyzovat 500 nebo více vzorků.

Závěr

Je třeba poznamenat, že i když se nyní používají výrazně vylepšené imunoanalytické metody, kvůli technickým zásadním omezením nebude mít tato metoda nikdy přesnost a specificitu pro cílovou látku srovnatelnou s HPLC-MSMS, zejména v přítomnosti metabolitů. To vede nejen k nízké přesnosti metody ELISA a vysokému procentu falešně pozitivních a falešně negativních výsledků, ale také neumožňuje srovnání výsledků získaných na různých klinických pracovištích metodou ELISA. Použití HPLC-MS/MS tuto nevýhodu odstraňuje a umožňuje vysoce specifickou, přesnou a rychlou analýzu velkého počtu vzorků s vysokou spolehlivostí v přítomnosti metabolitů a bez interference doprovodných a endogenních látek nacházejících se v plazmě a krvi. pacientů.

Navzdory zjevně vysokým nákladům na nástrojový komplex, jak ukazuje světová praxe, při správném provozu se tento komplex vyplatí za 1-2 roky. K tomu dochází především z důvodu nízkých nákladů na jednu analýzu v důsledku simultánní analýzy desítek a stovek sloučenin a absence nutnosti pořizovat drahé diagnostické soupravy. Kromě toho má laboratoř možnost nezávisle vyvíjet jakékoli potřebné analytické metody a nezávisí na výrobci soupravy.

Výběr správné konfigurace přístrojů

Existuje velké množství různých metod hmotnostní spektrometrie a typů hmotnostních spektrometrů navržených k řešení široké škály problémů – od strukturní identifikace komplexních proteinových makromolekul o hmotnosti stovek tisíc Daltonů až po rutinní vysoce výkonnou kvantitativní analýzu malých molekul.

Pro úspěšné vyřešení problému je jednou z hlavních podmínek výběr správného typu zařízení. Neexistuje žádné univerzální zařízení, které by vám umožnilo řešit celou řadu analytických problémů. Zařízení navržené k řešení problému identifikace mikroorganismů tedy není schopno provádět kvantitativní analýzu malých molekul. A naopak. Faktem je, že navzdory běžnému názvu se jedná o zcela odlišná zařízení fungující na jiných fyzikálních principech. V prvním případě se jedná o hmotnostní spektrometr doby letu s laserovým ionizačním zdrojem - MALDI-TOF a ve druhém o trojitý kvadrupól s elektrosprejovou ionizací - HPLC-MSMS.

Druhým nejdůležitějším parametrem je výběr správné konfigurace systému. Existuje několik hlavních výrobců zařízení pro hmotnostní spektrometrii. Zařízení každého výrobce mají nejen své silné stránky, ale i slabiny, o kterých většinou raději pomlčí. Každý výrobce vyrábí svou vlastní řadu zařízení. Náklady na jeden analytický komplex se pohybují od 100 000 do 1 000 000 nebo více dolarů. Výběr optimálního výrobce a správné konfigurace zařízení nejen ušetří značné finanční prostředky, ale také efektivněji vyřeší úkol. Bohužel existuje mnoho příkladů, kdy bylo laboratorní vybavení provedeno bez zohlednění těchto faktorů. Výsledkem je nečinné zařízení a vyhozené peníze.

Třetím faktorem určujícím úspěšný provoz laboratoře je personál. Provoz hmotnostních spektrometrů vyžaduje vysoce kvalifikovaný personál. Bohužel ani jedna univerzita v Rusku nemá kurz moderní praktické hmotnostní spektrometrie, zejména ve vztahu ke klinickým aplikacím, a úkoly školení personálu v každé laboratoři je třeba řešit samostatně. 2-3 dny úvodního školení prováděného výrobcem po uvedení zařízení na trh samozřejmě absolutně nestačí k pochopení základů metody a získání dovedností v ovládání zařízení.

Čtvrtým faktorem je nedostatek hotových analytických metod. Každá laboratoř má své prioritní úkoly, pro které je nutné vyvinout vlastní metody. To může provést osoba, která má alespoň 2-3 roky zkušeností s obsluhou zařízení. Výrobci někdy dodávají jednu nebo dvě obecné metody doporučujícího charakteru, ale nepřizpůsobují je konkrétním úkolům laboratoře.

V BioPharmExpert LLC Zaměstnáváme specialisty s dlouholetými zkušenostmi s prací na různých typech hmotnostních spektrometrů, vývojem metod a prováděním vysoce výkonných analýz. Proto poskytujeme následující služby:

1. Výběr optimální konfigurace zařízení pro konkrétní úkoly klienta.
2. Nákup, dodávka a spuštění zařízení od předních výrobců tandemových hmotnostních spektrometrů Postupné zaškolení personálu do jednoho roku od data uvedení zařízení na trh.
3. Sada hotových technik a databází pro řešení základních klinických problémů.
4. Vývoj analytických metod a řešení specifických problémů klienta v jeho laboratoři se zapojením jeho pracovníků.
5. Metodická podpora ve všech fázích práce.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je metoda sloupcové chromatografie, ve které je mobilní fází (MP) kapalina procházející chromatografickou kolonou naplněnou stacionární fází (sorbent). HPLC kolony se vyznačují vysokým hydraulickým tlakem na vstupu kolony, proto se HPLC někdy říká "vysokotlaká kapalinová chromatografie".

V závislosti na mechanismu separace látek se rozlišují tyto možnosti HPLC: adsorpce, dělení, iontová výměna, velikostní exkluze, chirální atd.

V adsorpční chromatografii dochází k separaci látek v důsledku jejich různých schopností adsorbovat a desorbovat z povrchu adsorbentu s vyvinutým povrchem, např. silikagelu.

Při rozdělování HPLC dochází k separaci díky rozdílu v distribučních koeficientech separovaných látek mezi stacionární fází (obvykle chemicky naroubovanou na povrch stacionárního nosiče) a mobilní fází.

Na základě polarity se PF a NP HPLC dělí na normální fázi a reverzní fázi.

Normální fáze je varianta chromatografie, která využívá polární sorbent (například silikagel nebo silikagel s naroubovanými skupinami NH 2 nebo CN) a nepolární PF (například hexan s různými přísadami). V reverzní fázi chromatografie se používají nepolární chemicky modifikované sorbenty (například nepolární alkylový radikál C 18) a polární mobilní fáze (například methanol, acetonitril).

Při iontoměničové chromatografii dochází k separaci molekul směsi látek, disociovaných v roztoku na kationty a anionty, při pohybu sorbentem (katexem nebo aniontoměničem) v důsledku jejich různé rychlosti výměny s iontovými skupinami sorbentu.

Při velikostní vylučovací (síto, gelová permeace, gelová filtrace) chromatografii se molekuly látek oddělují podle velikosti díky jejich různé schopnosti pronikat do pórů stacionární fáze. V tomto případě kolonu opouštějí jako první největší molekuly (s nejvyšší molekulovou hmotností) schopné proniknout do minimálního počtu pórů stacionární fáze a jako poslední opouštějí látky s malou molekulovou hmotností.

k oddělení často nedochází jedním, ale několika mechanismy současně.

Metodu HPLC lze použít ke kontrole kvality jakéhokoli neplynného analytu. K provedení analýzy se používají vhodné přístroje - kapalinové chromatografy.

Kapalinový chromatograf obvykle obsahuje následující hlavní součásti:

– jednotka pro přípravu PF včetně nádoby s mobilní fází (nebo nádob s jednotlivými rozpouštědly obsaženými v mobilní fázi) a odplyňovacího systému PF;

– čerpací systém;

– směšovač mobilní fáze (je-li to nutné);

– systém zavádění vzorku (injektor);

– chromatografická kolona (lze instalovat do termostatu);

– detektor;

– systém sběru a zpracování dat.

Čerpací systém

Čerpadla dodávají PF do kolony při dané konstantní rychlosti. Složení mobilní fáze může být konstantní nebo se může během analýzy měnit. V prvním případě se proces nazývá izokratický a ve druhém - gradient. Před čerpací systém se někdy instalují filtry s průměrem pórů 0,45 µm pro filtrování mobilní fáze. Moderní čerpací systém kapalinového chromatografu se skládá z jednoho nebo více počítačově řízených čerpadel. To umožňuje měnit složení PF podle konkrétního programu během gradientové eluce. Míchání složek PF v mísiči může probíhat jak při nízkém tlaku (před čerpadly), tak při vysokém tlaku (za čerpadly). Mixér lze použít k přípravě PF a během izokratické eluce, přesnějšího poměru složek je však dosaženo předmísením složek PF pro izokratický proces. Čerpadla pro analytickou HPLC umožňují udržovat konstantní průtok PF do kolony v rozsahu od 0,1 do 10 ml/min při tlaku na vstupu kolony do 50 MPa. Je však vhodné, aby tato hodnota nepřesáhla 20 MPa. Tlakové pulsace jsou minimalizovány speciálními klapkovými systémy, které jsou součástí konstrukce čerpadel. Pracovní části čerpadel jsou vyrobeny z korozivzdorných materiálů, což umožňuje použití agresivních složek ve složení PF.

Byla vyvinuta validovaná metoda HPLC-MS/MS pro identifikaci a kvantifikaci nového derivátu 1,3,4-thiadiazolové aminokyseliny LXT7-09. Maximální citlivosti hmotnostní spektrometrické detekce LHT7-09 bylo dosaženo v režimu detekce kladných iontů při napětí elektrospreje 5500 V a deklastračním potenciálu 36 V. Identifikované MRM přechody potvrdily chemickou strukturu nového derivátu aminokyseliny 1 ,3,4-thiadiazol. Pro účinnou izolaci LXT7-09 z vícesložkových směsí thiadiazolylamidů byl vyvinut gradientový režim vysokoúčinné kapalinové chromatografie s použitím směsi acetonitrilu a deionizované vody v různých poměrech jako eluentu. Pro tyto chromatografické podmínky byl retenční čas sloučeniny LHT7-09 stanoven na 11 minut. Pro kvantitativní stanovení sloučeniny LHT7-09 byl vyvinut kalibrační roztok pro závislost plochy chromatografického píku na koncentraci roztoku.

HPLC-ms/ms

chromatografií

hmotnostní spektrometrie

thiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Studie protizánětlivé aktivity nových thiadiazolových derivátů u formalínem indukovaného edému tlapky u potkanů ​​/ Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Moderní problémy vědy a vzdělávání. – 2013. – č. 3. www..

2. Nové thiadiazolové deriváty s antifungální aktivitou / A.S. Koshevenko [et al.] // Pokroky v lékařské mykologii. – 2015. – T. 14. – S. 348-351.

3. Syntéza a protinádorová aktivita nových furyl-2-substituovaných 1,3,4-thiadiazolů, 1,2,4-triazolů / T.R. Hovsepyan [et al.] // Chemicko-farmaceutický časopis. – 2011. – T. 45. – č. 12. – S. 3-7.

4. Popov N.S., Děmidová M.A. Hodnocení akutní toxicity nového derivátu aminokyseliny thiadiazolu při intraperitoneálním podání myším / N.S. Popov, M.A. Demidova // Lékařský časopis Horní Volhy. – 2016. – T. 15, vydání. 1. – str. 9-12.

5. Popov N.S., Děmidová M.A. Hodnocení ulcerogenity nového derivátu aminokyseliny thiadiazolu při intragastrickém podání potkanům / N.S. Popov, M.A. Demidova // Student doktorského studia. – 2017. – č. 1(80). – s. 71-78.

6. Syntéza a antimikrobiální aktivita amidů fenylthio- a benzylsulfonyloctových kyselin na bázi 2-amino-5-alkyl(arylalkyl)-1,3,4-thiadiazolů / S.A. Serkov [et al.] // Chemicko-farmaceutický časopis. – 2014. – T. 48, č. 1. – S. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Syntéza a farmakologická aktivita derivátů imidazothiadiazolu // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Sv. 73.č. 4. S. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed. Syntéza a protirakovinná aktivita nového 1-thia-4-azaspirodekanu, jejich odvozených thiazolopyrimidinových a 1,3,4-thiadiazolových thioglykosidů // Molekuly. 2017. Ne. 22(1). str. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Soli 5-amino-2-sulfonamid-1,3,4-thiadiazolu, strukturální a analog acetazolamidu, vykazují zajímavé inhibiční vlastnosti na karboanhydrázu, diuretický a antikonvulzivní účinek // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Sv. 12.Ne. 6. S. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Syntéza a antifungální aktivita 1,3,4-thiadiazol-thiazolidinonových sloučenin na bázi kyseliny dehydroabietové // Molecular Diversity. 2016. Sv. 20.č. 4. S. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Syntéza, biologické hodnocení a studium molekulárního modelování nových (1,2,4-triazol nebo 1,3,4-thiadiazol)-methylthio-derivátů chinazolin-4(3H)-onu jako inhibitorů DHFR // Bioorganic Chemistry. 2017. Sv. 72. str. 282-292.

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí je jednou z nejslibnějších metod pro identifikaci a kvantitativní stanovení léčiv v různých biologických objektech. Metoda se vyznačuje vysokou specificitou, přesností a schopností stanovit látky v minimálních koncentracích, což umožňuje její využití pro kvantitativní stanovení léčiv při farmakokinetických studiích a monitorování léčiv, což je významné pro klinickou laboratorní diagnostiku. Za tímto účelem je nutné vyvíjet a validovat metody pro kvantitativní stanovení různých léčivých látek, včetně inovativních, na bázi metody HPLC-MS/MS.

Původním lékem ze skupiny nesteroidních antirevmatik je acexazolamid, nový derivát 1,3,4-thiadiazolamidu a kyseliny acetamové. Významnou výhodou této sloučeniny je nízká toxicita a nízká ulcerogenita. Pro provádění farmakokinetických studií a hodnocení biologické dostupnosti tohoto léčiva různými cestami podání je nutné vyvinout spolehlivou metodu pro jeho kvantitativní stanovení v biologických tekutinách.

Účel této studie byl vývoj techniky pro identifikaci a kvantitativní stanovení nového nesteroidního antiflogistika ze skupiny thiadiazolových derivátů pomocí HPLC-MS/MS.

Materiály a metody

Předmětem studie byl nový derivát thiadiazolu s laboratorním kódem LHT 7-09, syntetizovaný v OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) prof. S.Ya. Škačilová (obr. 1).

2-(5-ethyl-1,3,4-thiadiazolyl)amid 2-acetylaminohexanová kyselina

Rýže. 1. Chemická struktura LHT 7-09 (hrubý vzorec: C 12 H 20N 4 O 2S; molární hmotnost 284,4g/mol)

Sloučenina LHT 7-09 vzhledu je bílý prášek, který je prakticky nerozpustný ve vodě, rozpustný v alkoholu a snadno rozpustný v acetonitrilu.

K identifikaci a kvantifikaci LCT 7-09 byla použita validovaná metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie s hmotnostní spektrometrickou detekcí (HPLC-MS/MS).

Chromatografie byla prováděna za použití vysoce výkonného kapalinového chromatografu Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Německo). Ve studii byla použita analytická kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 um 2,1 x 10 mm. Abychom izolovali studovanou sloučeninu, vyvinuli jsme režim gradientové chromatografie. Jako eluenty byly použity acetonitril, deionizovaná voda a octan amonný v různých poměrech.

Pro hmotnostní spektrometrii byl použit trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) s elektrosprejovým iontovým zdrojem (TurboV se sondou TurboIonSpray). Hmotnostní spektrometr byl kalibrován pomocí testovacího roztoku reserpinu v koncentraci 6,1 x 10-2 mg/l.

Hmotnostní spektrometrická analýza studovaných vzorků byla provedena v režimu elektrosprej s přímým nástřikem vzorku a eluátu dodávaného chromatografem. Přímé vstřikování testovaných vzorků do hmotnostního chromatografu bylo provedeno pomocí injekční pumpy o průměru 4,61 mm při rychlosti 10 μl/min.

Při vývoji metody pro identifikaci a kvantifikaci nového thiadiazolového derivátu byly zvoleny optimální podmínky pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii a hmotnostní detekci. Byla zohledněna doba uvolnění látky z chromatografické kolony a přechod MRM (registrace byla provedena m/z prekurzorového iontu na prvním analytickém kvadrupólu Q1 a m/z produktové ionty na druhém analytickém kvadrupólu Q3). Pro kvantifikaci LCT 7-09 byl sestrojen kalibrační graf v rozmezí koncentrací od 0,397 do 397 ng/ml.

Jako software byl použit AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Výsledky a diskuse

V první fázi experimentální studie byla provedena hromadná detekce testovaného vzorku jeho přímým zavedením do hmotnostního detektoru pomocí injekční pumpy. Ve fázi přípravy vzorku byl připraven roztok LHT 7-09 (500 ng/ml) ve směsi acetonitrilu a ionizované vody v poměru 2:1 s přídavkem octanu amonného (0,1 %).

Předběžné experimenty ukázaly, že v režimu registrace kladných iontů byla citlivost stanovení LHT 7-09 vyšší a hmotnostní spektrum intenzivnější a informativnější než v režimu registrace záporných iontů. V tomto ohledu byl v dalších studiích použit pouze pozitivní ionizační mód.

Pro získání intenzivního píku byly zvoleny následující podmínky hmotnostní detekce: : pozitivní polarizace, elektrosprejové napětí 5500,0 V, deklastrační potenciál a vstřikovací potenciál - 36,0 a 6,5 ​​V, s tlakem clonového plynu 20,0 psi a tlakem atomizačního plynu 40,0 psi, rychlostí 10 μl/min. Skenovací rozsah byl 270-300 Da.

Analýza získaného hmotnostního spektra prvního analytického kvadrupólu Q1 ukázala, že za těchto podmínek díky přidání protonu vodíku vzniká protonovaná molekula studované sloučeniny + s hodnotou m/ z 285,2 Ano (obr. 2).

Rýže. 2. Hmotnostní spektrum protonované molekuly LHT 7-09 (v pozitivním iontu + skenovací mód)

Na druhém analytickém kvadrupólu Q3 byly zaznamenány produktové ionty pro prekurzorový iont s hodnotou m/z 285,2 Ano. Analýza hmotnostního spektra 2. řádu ukázala přítomnost mnoha píků, z nichž 3 byly nejintenzivnější - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da a m/z 75,1 Da (obr. 3).

Rýže. 3. Hmotnostní spektrum produktových iontů (v režimu skenování kladných iontů, prekurzorový iontm/ z285,2 Ano)

Pro získání iontového signálu o vysoké intenzitě byly zvoleny optimální energetické hodnoty v kolizní buňce Q2 (uvažovalo se o energetickém rozsahu od 0 do 400 V). Pro produkt ionty s hodnotami m/ z 114,2 Da, 130,2 Da a 75,1 Da. Optimální energie v kolizním článku byla 27 V, v uvedeném pořadí; 23V a 49V.

Předpokládá se, že produkt iont s hodnotou m/ z 114,2 Da je fragment 5-amino-2-ethyl-1,3,4-thiadiazolu, protože fragmentace dalších derivátů 1,3,4-thiadiazolu také odhaluje produktový ion se stejnou hodnotou m/ z. Produkt ion s významem m/ z 130,2 Da je pravděpodobně protonovaný zbytek kyseliny acetamové. Výsledky hmotnostní detekce zkoumaného vzorku tedy potvrdily chemickou strukturu nového derivátu 1,3,4-thiadiazolu.

V další fázi experimentální studie byla testovaná sloučenina analyzována pomocí HPLC-hmotnostní spektrometrie.

V režimu HPLC-MS/MS byly použity následující podmínky ionizace: elektrosprejové napětí 5500,0 V, průtok mobilní fáze 400 μl/min, teplota dusíku 400 °C, clonový plyn a tlak průtoku spreje 20,0 a 50,0 psi, v daném pořadí. Rychlost záznamu jednotlivých hmotnostních spekter byla 100 spekter za sekundu. Pro získání souhrnného hmotnostního spektra bylo na chromatogramu zvoleno časové období 10,5-11,5 minut; Na základě intenzity signálu produktových iontů byly sestrojeny křivky časové závislosti iontového proudu a plochy píku jednotlivých signálů odpovídajících zkoumané sloučenině. Objem vzorku zavedeného do analytické kolony byl 10 μl.

K izolaci zkoumané sloučeniny byl použit gradientní režim vysokoúčinné kapalinové chromatografie, který byl zajištěn změnou složení eluentu na vstupu do analytické kolony. Jako eluenty byly použity acetonitril, deionizovaná voda a octan amonný v různých poměrech. Volba režimu gradientové chromatografie byla způsobena skutečností, že za podmínek izokratického elučního režimu (včetně použití různých koncentrací acetonitrilu) nebylo možné získat pík testované látky symetrického tvaru s retenčním časem vhodné pro analýzu. Podle studie byl optimální režim dodávky eluentu: od 0 do 4 minut, koncentrace acetonitrilu byla 1 %; od 4 do 8 minut lineární zvýšení koncentrace acetonitrilu na 99 %; od 8 do 12 minut - izokratický řez (1% acetonitril). Po dokončení studie byla chromatografická kolona promývána 30% roztokem acetonitrilu po dobu 5 minut.

Při použití popsaného chromatografického režimu byl pro studovanou sloučeninu získán symetrický pík dostatečné intenzity (obr. 4).

Rýže. 4. Chromatogram LHT 7-09 (analytická kolonaAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 um 2,1 x 10 mm; gradientová chromatografie)

Analýza získaných chromatogramů pro roztoky LCT 7-09 různých koncentrací ukázala, že retenční čas (tR) za těchto elučních podmínek byl 11 minut a nezávisel na koncentraci zkoumané látky. V tomto ohledu může být hodnota retenčního času použita jako dodatečné kritérium pro potvrzení pravosti LHT 7-09 ve vícesložkových směsích. Pozoruhodný je fakt, že tyto chromatografické parametry lze použít k identifikaci LHT 7-09 nejen pomocí hmotnostního detektoru, ale i dalších detektorů, včetně fotometrických.

Pro kvantifikaci nového thiadiazolového derivátu byl sestrojen kalibrační graf v rozmezí koncentrací od 0,397 ng/ml do 397 ng/ml (obr. 5).

Rýže. 5. Kalibrační graf pro stanovení koncentrace LCT 7-09 (na vodorovné ose je koncentrace LCT 7-09 v ng/ml, na svislé ose je plocha píku v pulzech)

Pro vývoj kalibračního roztoku byly použity roztoky LHT 7-09 v koncentracích 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Závislost plochy píku na koncentraci studované sloučeniny byla popsána následující regresní rovnicí:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, hodnota regresního koeficientu byla r=0,9936.

Je třeba poznamenat, že vyvinutý kalibrační roztok umožňuje vysoce přesné kvantitativní stanovení studované sloučeniny v širokém rozsahu koncentrací, což umožňuje použít tuto metodu pro hodnocení kvality léčivé látky a pro provádění farmakokinetických studií.

Výsledkem studie byl tedy vývoj metody pro identifikaci a kvantifikaci nového aminokyselinového derivátu thiadiazolu pomocí HPLC-MS/MS.

závěry

1. HPLC-MS/MS umožňuje identifikaci a kvantifikaci nového derivátu aminokyseliny thiadiazolu s vysokou přesností.
2. Hmotnostní detekce nového thiadiazolového derivátu LHT 7-09 by měla být provedena v režimu skenování pozitivních iontů (přechod MRM - prekurzorový ion Q1 m/ z 285,2 Ano; produktové ionty Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da a m/ z 75,1 Da).
3. Pro izolaci LCT 7-09 z vícesložkových směsí byla vyvinuta technika vysokoúčinné kapalinové chromatografie (analytická kolona Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm; eluční činidlo acetonitril: deionizovaná voda: octan amonný; gradientní režim).

Bibliografický odkaz