Rsk analiza. Serološke metode laboratorijske dijagnostike sifilisa

Neizravne metode za dijagnosticiranje sifilisa.

Za dijagnosticiranje sifilisa koriste se mnoge metode istraživanja koje se razlikuju po tehnici i svrsi. Izravne metode usmjerene su na otkrivanje patogena u materijalu koji se proučava pomoću mikroskopije (mikroskopija u tamnom polju, itd.) ili PCR.

Uz metode izravnog otkrivanja treponema pallidum (T. pallidum), neizravne metode se naširoko koriste pri ispitivanju na sifilis ( serološki) metode istraživanja koje otkrivaju protutijela na uzročnika sifilisa u krvnom serumu i cerebrospinalnoj tekućini. Neizravne metode za dijagnosticiranje sifilisa uključuju serološke reakcije ELISA, RPHA, DAC, RIF i RIF-abs, RIBT, PCR, ekspresnu metodu, imunoblot i druge.

Serološke metode dijagnostike zaraznih bolesti.

Serološki dijagnostički kriteriji na temelju specifičnih reakcija antigen-protutijelo. Antigeni (dijelovi staničnih stijenki, bičevi, kapsule, DNA i toksini) onih mikroorganizama koje je potrebno odrediti reagiraju s antitijelima sadržanim u serumima. Dolazi do povezivanja antigena i njihovih odgovarajućih protutijela, što je osnova za serološke dijagnostičke metode. Serološki testovi služe za određivanje nepoznatog antigena (čiji je izvor bakterija, virus, toksin i sl.) pomoću poznatog antitijela ili za određivanje antitijela u serumu pomoću poznatog antigena.

Serološke reakcije se klasificiraju ovisno o stanju antigena i karakteristikama okoline u kojoj antigen i protutijelo međusobno djeluju, kao i prema načinu provedbe.

Za izvođenje seroloških reakcija koriste se mnoge laboratorijske metode, kao što su aglutinacija, precipitacija, fiksacija komplementa, imunofluorescencija, enzimski imunotest i radioimunotest i druge. Ove reakcije omogućuju učinkovitu preliminarnu identifikaciju mikroorganizama.

Serumi koji su potrebni za izvođenje seroloških reakcija dobivaju se eksperimentalnim putem, posebice ih proizvode instituti za cjepiva i serume, a nude se kao dio komercijalnih dijagnostičkih kitova.

Serološke metode važan su alat u dijagnostici i liječenju zaraznih bolesti ljudi i životinja, jer je uz njihovu pomoć moguće ne samo identificirati uzročnika bolesti, već i otkriti specifična protutijela na odgovarajuće uzročnike u krvi. pacijenata i preživjelih. Serološke metode trenutno su najučinkovitije dijagnostičke metode kada je uzročnika nemoguće ili teško izolirati, a relativno rijetko daju lažno pozitivne i lažno negativne rezultate.

Korištenje seroloških metoda za dijagnosticiranje sifilisa

Serološke laboratorijske metode za dijagnosticiranje sifilisa temelje se na sposobnosti tijela da pruži imunološki odgovor na pojavu patogena. Serološkim reakcijama u krvnom serumu (plazmi) (ili cerebrospinalnoj tekućini) otkrivaju se tragovi imunološkog odgovora na infekciju, odnosno antitijela na antigene treponeme pallidum ili sami antigeni.

Kako bi se utvrdila specifična priroda postojećih kliničkih manifestacija (tj. Da su posljedica sifilisa) i, u budućnosti, za kontrolu dinamike patološkog procesa, predložen je veliki broj seroloških metoda istraživanja. Iste te metode također se naširoko koriste za probir stanovništva.

Sukladno važećim nacionalnim smjernicama i kliničkim smjernicama, u brojnim zemljama diljem svijeta koriste se napredne serološke metode u populacijskim istraživanjima za identifikaciju bolesnika sa sifilisom i postavljanje kliničke dijagnoze. Koriste se iu prisutnosti kliničkih znakova bolesti u bolesnika i tijekom latentnih razdoblja.

Serološki testovi su jedna od najpouzdanijih metoda za dijagnosticiranje sifilisa. Standardizirane serološke pretrage s reguliranim postupkom nazivaju se serološke pretrage na sifilis. S obzirom da gotovo sve serološke reakcije na sifilis pod određenim uvjetima mogu biti lažno pozitivne ili lažno negativne, potrebno ih je uzimati kombinirano, a po potrebi i dinamički.

Serološke reakcije koje se koriste za određivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika razlikuju se jedna od druge po osjetljivosti, specifičnosti, složenosti i cijeni. Uz klasične metode, za učinkovitu serodijagnostiku sifilisa koriste se imunološki testovi i tehnologije, koje su u 21. stoljeću dobile novi poticaj razvoju.

Protutijela se otkrivaju različitim imunokemijskim (serološkim) metodama, uključujući sedimentne reakcije, enzimske imunotestove, kemiluminescencijske imunotestove, imunokromatografske testove, linearni imunobloting, studije pomoću protočne fluorometrije, tehnologiju imunočipa i druge.

Serodijagnostika (istraživanje serološkim metodama) koristi se za:

• potvrda kliničke dijagnoze sifilisa,
• postavljanje dijagnoze latentnog sifilisa,
• praćenje učinkovitosti liječenja, kao jedan od kriterija za izlječenje bolesnika sa sifilisom,
• prevencija sifilisa (probirni pregled određenih skupina stanovništva za prepoznavanje patologije).

Najvažnija svojstva potrebna za serološke testove su osjetljivost, specifičnost, ponovljivost

Odlučujući kriterij pri izboru laboratorijske dijagnostičke metode je njezina učinkovitost - osjetljivost, specifičnost i ponovljivost.

Osjetljivost je udio pozitivnih rezultata kod pacijenata. Osjetljivost metode određena je postotkom pozitivnih rezultata testa na uzorcima za koje je poznato da sadrže specifične markere patogena (na primjer, antigene patogena ili protutijela na njih).

Specifičnost- udio negativnih rezultata testiranja u zdravih bolesnika. Specifičnost metode određena je postotkom negativnih rezultata testa na uzorcima za koje se zna da ne sadrže specifične markere uzročnika. Dakle, što je veća osjetljivost i specifičnost, to je metoda istraživanja pouzdanija i pouzdanija.

Važni dijagnostički kriteriji također uključuju ponovljivost rezultati ponovljenih istraživanja istih uzoraka. Treba napomenuti da, unatoč značajnom napretku u području visoke tehnologije, ne postoje metode koje pružaju 100% (apsolutnu) osjetljivost i specifičnost u svim testiranim biološkim testovima.

Trenutno su u Rusiji službeno registrirani testni sustavi, setovi i sastojci koji imaju manje od 95% osjetljivosti i specifičnosti pri postavljanju reakcije. Stoga uvijek postoji mogućnost dobivanja neadekvatnog rezultata.

Klasifikacija testova prema vrsti korištenog antigena. Treponemski i netreponemalni testovi za sifilis

U suvremenoj venerologiji u dijagnostičke svrhe koristi se više od desetak varijanti seroloških reakcija na sifilis, koje se prema različitim kriterijima mogu podijeliti u različite kategorije. Razvrstavanje se provodi prema metodologiji istraživanja, opsegu, brzini, niskoj cijeni, zahtjevima za laboratorijsku opremu itd.

Treponemski testovi su teoretski specifičniji, ali također daju lažno pozitivne rezultate. Štoviše, ne dopuštaju razlikovanje neliječenog i izliječenog sifilisa. Rezultati treponemskih reakcija bit će pozitivni u oba slučaja. Netreponemalne reakcije razlikuju neliječenu ili nedavnu infekciju od izliječene infekcije.

Tijekom pregleda preporuča se provesti i treponemsku i netreponemsku reakciju. Za postavljanje i potvrdu dijagnoze sifilisa potrebni su pozitivni rezultati obje vrste pretraga - treponemskih i netreponemskih. Stoga se netreponemski testovi koriste u kombinaciji s treponemskim testovima, a provode se prije, tijekom i nakon završetka liječenja u određenim vremenskim intervalima.

1. Netreponemski testovi

Najpoznatiji od netreponemskih testova s ​​vizualnom interpretacijom rezultata su

• RW - Wassermanova reakcija s lipidnim antigenima (reakcija fiksacije komplementa s kardiolipinskim antigenom, PCK)
• Kanna reakcija (trenutačno se ne koristi),
• citoholna Sachs-Vitebsky reakcija (trenutačno se ne koristi),
• reakcija mikroprecipitacije s plazmom ili inaktiviranim serumom (MPR ili RMP),
• RPR (brzi plazma reagin test),
• TRUST (test s toluidin crvenim i nezagrijanim serumom, Toluidin Red Unheated Serum Test).

Među netreponemskim testovima postoje 2 testa s mikroskopskim očitavanjem rezultata reakcije:

1. VDRL - (Laboratorij za istraživanje spolnih bolesti);

2. USR - test za određivanje aktivnih reagena u plazmi (Unheated Serum Reagins).

Reaktivnost u netreponemskim testovima obično ukazuje na oštećenje tkiva i nije uvijek specifična za sifilis. Jednostavnost primjene i niska cijena omogućuju im da se koriste kao reakcije probira pri postavljanju preliminarne dijagnoze sifilisa.

2. Treponemski testovi

Treponemski testovi koriste specifične treponemske antigene. Ovi testovi su potrebni za potvrdu dijagnoze (RPGA, RIT, RIF i ELISA). Složeniji su i skuplji od testova skupine 1, ali i specifičniji i osjetljiviji. Protutijela u cerebrospinalnoj tekućini također se otkrivaju pomoću treponemskih testova.

Tradicionalni treponemski testovi koji potvrđuju dijagnozu sifilisa zahtijevaju skupu laboratorijsku opremu i iskusno osoblje, pa se rijetko izvode izvan specijaliziranih laboratorija. Međutim, sada ih je moguće zamijeniti jednostavnim i brzim treponemskim reakcijama koje se mogu izvoditi lokalno i koristiti punu krv. Provođenje ovih reakcija ne zahtijeva dugotrajnu obuku niti posebne uvjete za čuvanje reagensa i opreme.

Usporedna jeftinost, praktičnost i praktičnost treponemal ekspresnih reakcija privlače pažnju na njih ne samo kao metode potvrde dijagnoze. Ovi se testovi mogu koristiti za probir na sifilis u primarnoj zdravstvenoj zaštiti (mogu se provoditi lokalno u istoj zdravstvenoj ustanovi) ili u područjima gdje laboratoriji nisu dostupni. No, budući da se protutijela na T. pallidum otkrivaju tijekom niza godina, neovisno o tome je li bolesnik bio liječen ili ne, brze treponemske reakcije ne mogu se koristiti za procjenu učinkovitosti liječenja i diferencijalnu dijagnozu neliječenog i izliječenog sifilisa.

Klasifikacija seroloških metoda za dijagnosticiranje sifilisa prema vrsti otkrivenih protutijela

U suvremenoj dermatovenerologiji za dijagnozu se koriste različite serološke reakcije na sifilis. Neke metode koje su bile relevantne prije deset godina više se ne koriste zbog složenosti ili nespecifičnosti. Ovisno o otkrivenim protutijelima, metode serološke dijagnostike sifilisa dijele se u tri skupine:

I. Lipidne (reagin) reakcije - određuju se protutijela na lipidne antigene (reagin):

1) flokulacija: mikroreakcija na staklu s lipidnim antigenima - ekspresna dijagnostička metoda (precipitacijske mikroreakcije - MRP), VDRL, CMF (kardiolipinski mikroflokulacijski test), RPR i dr.;

2) reakcija vezanja komplementa (CRF) s lipidnim antigenima: Wassermanova reakcija (WR), kvalitativne i kvantitativne metode, termostatska i hladna (Kolmerova reakcija);

3) sedimentne reakcije koje se trenutno ne koriste: Cahnova taložna reakcija, citoholna Sachs-Vitebskyjeva reakcija itd.;

II. Grupne treponemske reakcije - određuju se antitijela na skupne treponemske antigene (dio mikrobne stanice i patogenih i saprofitnih treponema):

1) RSC s Reiterovim proteinskim antigenom;

2) reakcija imunofluorescencije (RIF);

3) reakcija imunološke adhezije (IAR).

III. Specifične proteinske treponemske reakcije – određuju se antitijela na specifične antigene vrste Treponema pallidum:

1) Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TRE);

2) reakcija imunofluorescencije RIF-abs i njegove varijante (IgM-FTA-ABS, 19S-IgM-FTA-ABS, itd.);

3) reakcija neizravne hemaglutinacije Treponema pallidum (IPHA) i njezine modifikacije TPPA.

4) enzimski imunološki test (ELISA);

5) imunobloting.

Praktična primjena seroloških testova za sifilis

Različite serološke reakcije koriste se u različite praktične svrhe.

U inozemstvu, tijekom masovnih istraživanja stanovništva i kada je potrebno hitno otkrivanje sifilisa, koriste se ne-treponemalne selekcijske reakcije (VDRL, RPR, itd.). Za dijagnozu je potrebna potvrda FTA-ABS, FTA-ABS ili TPPA treponemskim testovima. Trenutno se preporučuje korištenje ELISA-e kao zamjene za VDRL u testovima probira. To je zbog činjenice da se ELISA test odlikuje osjetljivošću, specifičnošću, sposobnošću automatizacije studija, kao i razvojem dijagnostičkih testova. Osim toga, potkrijepljena je obrnuta shema redoslijeda testiranja na sifilis, kada se prvi koriste treponemski testovi.

Kako bi se pratila učinkovitost terapije i procijenila aktivnost infekcije, preporučuje se kvantitativni VDRL. Kao potvrdni/dodatni test koristi se ELISA test za antitreponemska IgM protutijela.

U domaćoj praksi koristi se kompleks seroloških reakcija (CSR), uključujući reakciju mikroprecipitacije (MPR) s kardiolipinskim antigenom i RSC s kardiolipinskim i treponemskim antigenima. Nedavno je u DAC-u preporučeno zamijeniti RSK s ELISA ili RPGA. Također se koriste RIF (i njegove modifikacije - RIF-Abs i drugi), RIBT.

RIBT se koristi kao ispitna reakcija u slučajevima odstupanja u treponemskim reakcijama.

Pristupi laboratorijskoj serološkoj dijagnostici sifilisa u Ruskoj Federaciji

Uvođenje u praksu jedinstvenih metoda kliničkih laboratorijskih istraživanja u SSSR-u i Ruskoj Federaciji omogućilo je uvođenje naprednijih dijagnostičkih metoda, racionalizaciju rada kliničkih dijagnostičkih laboratorija, povećanje produktivnosti rada, smanjenje dupliranja laboratorijskih testova i postalo temeljem za razvoj racionalnih oblika gotovih kompleta reagensa.

Godine 1985. u SSSR-u, kako bi se poboljšala dijagnoza sifilisa, ne-treponemalna reakcija RSC s nespecifičnim (Wassermann) antigenom i reakcije sedimenta (citokolična i Cana) isključene su iz dijagnostičkog kompleksa, kao manje osjetljive i ne pružanje dodatnih informacija.

Umjesto toga, u sklopu kompleksa seroloških reakcija na sifilis (CSR), predviđena je uporaba reakcije fiksacije komplementa s treponemskim i kardiolipinskim antigenom (RSKt) i reakcije mikroprecipitacije s kardiolipinskim antigenom (RMA). Veća osjetljivost i sadržaj informacija ovog skupa reakcija osigurali su detekciju ne samo reagina, već i antitreponemskih protutijela.

1985. godine

1. RMP s kardiolipinskim antigenom s krvnom plazmom i inaktiviranim krvnim serumom. Test probira za izoliranu uporabu.

2. RSC s treponemskim i kardiolipidnim antigenima; kvalitativne i kvantitativne metode stupnjevanja, termostatske i hladne;

3. Treponema pallidum reakcija imobilizacije (TRE); epruveta i melange metoda proizvodnje;

4. Reakcija imunofluorescencije (RIF) u sljedećim modifikacijama: RIF s apsorpcijom (RIF-abs) s krvnim serumom i kapilarnom krvlju, RIF-200, RIF s cijelim likvorom (RIF-c); kvalitativne i kvantitativne metode formulacije. Dijagnostika latentnih i kasnih oblika sifilisa, prepoznavanje DM (lažno pozitivni rezultati)

5. Kompleks klasičnih seroloških reakcija (KSR): KSR (Wassermannova reakcija) s kardiolipinom i treponemskim antigenima + RMP. Preventivni pregled stanovništva na sifilis, dijagnostika svih oblika sifilisa, praćenje učinkovitosti liječenja, pregled osoba koje su u kontaktu sa sifilisom.

Godine 2001. Ministarstvo zdravstva Ruske Federacije odobrilo je novi regulatorni dokument koji regulira postupak provođenja dijagnostičkih testova - Naredba Ministarstva zdravstva Ruske Federacije br. 87 od 26. ožujka 2001. „O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa .”

U cilju poboljšanja laboratorijske dijagnostike sifilisa, poboljšanja kvalitete rada i sprječavanja daljnjeg širenja sifilisa, preporuča se zamjena RSC u kompleksu seroreakcija (SSR) kod dijagnosticiranja sifilisa ELISA i RPGA kao testovima probira i potvrde, jer Ovi testni sustavi su vrlo osjetljivi, specifični i ponovljivi.

Naredba br. 87 od 26. ožujka 2001. "O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa" predviđa korištenje sljedećih metoda za sero- i likvornu dijagnostiku sifilisa u Rusiji:

1. RMP i strani analozi (VDRL, RPR i sl. mikroreakcije) kao probirni testovi za probir stanovništva na sifilis. RMP se izvodi s plazmom ili inaktiviranim krvnim serumom.
2. Imunoenzimski test (ELISA). Antigen iz uzgojene ili patogene Treponema pallidum. Dijagnostičke reakcije, uključujući dijagnostiku alkohola. Zbog jednostavnosti proizvodnje i dostupnosti komercijalnih testnih sustava, mogu se koristiti kao testovi probira.
3. Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Antigen iz uzgojene ili patogene Treponema pallidum. Probir i dijagnostičke reakcije.
4. Kvalitativne i kvantitativne varijante RIF-a (RIF-abs, RIF-ts, RIF s kapilarnom krvlju iz prsta). Antigen - patogena Treponema pallidum soj Nichols.
5. Kompleks seroloških reakcija (CSR) na sifilis, koji se sastoji od reakcije fiksacije komplementa (CFR) s treponemskim i kardiolipinskim antigenima, te raka mokraćnog mjehura. Moguće je zamijeniti reakciju vezanja komplementa s ELISA ili RPHA, također u kombinaciji s rakom mokraćnog mjehura. DAC se odnosi na dijagnostičke testove.
6. Reakcija imobilizacije treponeme pallidum (TRI), u kojoj se kao antigen koristi patogena Treponema pallidum soja Nichols. RIBT su dijagnostički potvrdni testovi.

Stoga se preporuča planirati redoslijed pregleda pacijenata na sifilis u zdravstvenim ustanovama na sljedeći način:

1. Tijekom inicijalnog pregleda provodi se selekcijska (screening) mikroprecipitacijska reakcija (RMP) ili njezina modifikacija (RPR, TRUST, VDRL) u kvantitativnoj i kvalitativnoj verziji te, u slučaju pozitivnog rezultata, bilo koji specifični potvrdni treponemski test ( RPGA, ELISA, DAC, RIF), RIT);

2. Nakon završetka terapije dijagnosticira se RMP ili njegova modifikacija te se prema smanjenju titra prosuđuje dinamika infektivnog procesa i učinkovitost terapije. Potvrdom učinkovitosti terapije smatra se smanjenje titra za 4 ili više puta unutar 1 godine.

Prijem po dogovoru! Subota nedjelja.

Serološka metoda je skup reakcija temeljen na interakcija antigen-antitijelo (Ag-Ab) i usmjerena na identifikaciju antitijela na antigene uzročnika zaraznih bolesti ili same mikrobne antigene u krvnom serumu i drugim tjelesnim tekućinama. Serološku metodu karakterizira visoka osjetljivost i specifičnost. Većina reakcija ove metode lako se provodi i bilježi, dostupne su širokom rasponu laboratorija, obično su sigurne, ekonomične i podložne standardizaciji. DO nedostatke Serološka metoda može se pripisati: 1) neizravnoj prirodi rezultata, kada se etiologija bolesti ne procjenjuje izolacijom patogena, već tjelesnim (imunološkim) odgovorom na patogen; 2) potreba za parenteralnom intervencijom u tijelu pacijenta; 3) u većini slučajeva kasna dijagnoza, što se objašnjava prirodnom dinamikom humoralnog imunološkog odgovora; 4) mogućnost pogrešnog tumačenja anamnestičkih abs (kao rezultat prethodne bolesti ili cijepljenja) za abs za trenutnu infekciju. Pri određivanju mikrobnih antigena 3 i 4 nema nedostataka, ali je potrebno uzeti u obzir karakteristike cirkulacije antigena različitih mikroba i korelirati te značajke s mogućnošću uzimanja materijala za istraživanje.

Faze serološke metode:

1) uzimanje materijali za istraživanje. U većini slučajeva materijal je krvni serum. Dobiva se nakon stvaranja krvnog ugruška, krv treba prikupiti u strogo aseptičnim uvjetima prema standardnim tehnikama,

2) izbor serološke reakcije za određeni slučaj ovisi o svrsi istraživanja, sumnji na bolest, fazi bolesti, materijalu za ispitivanje, osjetljivosti reakcije i mogućnostima pojedinog laboratorija. Za otkrivanje Abs, kao i Ag, koriste se reakcije aglutinacije ( RA), pasivna hemaglutinacija ( RPGA)), imunofluorescencija (GREBEN), inhibicija hemaglutinacije ( RTGA), taloženje, flokulacija, reakcija vezanja komplementa (FFR), itd.

3) postavljanje serološke reakcije,

4) registracija serološke reakcije radi utvrđivanja prisutnosti seroloških markera infekcije.

Različite serološke reakcije karakterizira nekoliko opće karakteristike:

1) budući da su sve serološke reakcije reakcije interakcije između Ab i Ag, tada se u svim slučajevima za utvrđivanje prisutnosti Ab u supstratu koji se proučava koristi skup poznatih standardnih korpuskularnih ili topljivih Ag, tzv. dijagnostikumi. S druge strane, za utvrđivanje prisutnosti Ag, skup imunološki dijagnostički serumi,

2) interakcija Ag i Ab događa se samo u prisutnosti elektrolita, koji je obično izotonična otopina natrijevog klorida ili puferske smjese; pH sustava treba biti oko 7,

3) stvaranje kompleksa Ag-At zahtijeva razdoblje inkubacije pod posebnim temperaturnim uvjetima (od +4 ° C do 37 ° C). Stvaranje specifičnog imunološkog kompleksa događa se brzo; pojava vidljiva golim okom (aglutinacija, liza itd.) - polako, nakon nekoliko sati ili čak dana,

4) obje komponente serološke reakcije (antigen i protutijela) moraju biti prisutne u jednakom omjeru. Višak bilo koje od komponenti blokira stvaranje kompleksa Ag-At i pridonosi lažno negativnim rezultatima.

Serološke reakcije bilježe se vizualno, ponekad pomoću povećala. Bit uzimanja u obzir serološke reakcije svodi se na utvrđivanje fenomena vezanja Ag i Ab stvaranjem kompleksa Ag-At. Vizualno, formiranje Ag-At kompleksa prate dva glavna fenomena - aglutinacija i taloženje. Razlike među njima određene su karakteristikama antigena i za njih specifičnih protutijela. U isto vrijeme, među mikrobnim antigenima postoje i oni koji induciraju sintezu ne-precipitirajućih; formiranje Ag-Ab kompleksa u ovom slučaju nije popraćeno ni fenomenom aglutinacije ni fenomenom taloženja, a identificiranje činjenica formiranja kompleksa Ag-Ab zahtijeva označavanje dijagnostičke komponente reakcije posebnim oznakama ili prijenos dijagnostičkog antigena u drugo stanje agregacije.

Pri procjeni reakcije koriste se 3 glavna kriterija: 1) prisutnost i intenzitet reakcije (u plusevima, itd.); 2) dijagnostički titar, 3) porast titra Ab tijekom bolesti 4 puta ili više. Prisutnost reakcije određuje se vizualnim fenomenima ili vezanjem imunokemijskog markera. Za procjenu intenziteta serološke reakcije koristi se princip 4 “+” (Tablica 7).

Tablica 7.

Sustav za procjenu seroloških reakcija s 4 "+" za reakcije aglutinacije i precipitacije

Za kvantitativno predstavljanje rezultata serološke reakcije koristi se koncept titra antitijela ili antigena. Za određivanje razine Ab (odnosno Ag titra) potrebno je provesti serološku reakciju pripremom većeg broja razrjeđenja krvnog seruma ili drugog materijala (titrirati). Pri izradi razrjeđenja krvnog seruma koristi se otopina elektrolita (najčešće izotonična otopina natrijeva klorida). Korak razrjeđivanja (titracija) određuje se omjerom volumena otopine elektrolita i volumena krvnog seruma. Na primjer, uz uzastopna razrjeđivanja s korakom od 2 puta, jednaki volumeni otopine elektrolita i krvnog seruma miješaju se u 1. epruveti, s korakom od 5 puta, 1 volumen seruma dodaje se u 4 volumna dijela elektrolita. otopine, s korakom od 10 puta - s 9 1 volumen krvnog seruma dodaje se volumenu otopine elektrolita (tablica 8).

Stranica pruža referentne informacije samo u informativne svrhe. Dijagnostika i liječenje bolesti moraju se provoditi pod nadzorom stručnjaka. Svi lijekovi imaju kontraindikacije. Obavezna konzultacija sa stručnjakom!

Materijal koji se proučava

• krvni serum
• slina
• fekalne tvari

• tlo

Metoda analize ili uzorkovanja krvi

Značajke transporta krvi i skladištenja seruma

Čemu služe serološke pretrage?

Osnovne metode serološke dijagnostike

Reakcija imunofluorescencije (RIF)

Reakcija imunofluorescencije je vrlo naporan proces koji zahtijeva puno vremena i odgovornosti stručnjaka. Reakcija započinje pripremom otopina, zatim se titriraju serumi i njihovi kontrolni uzorci ( postupak koji vam omogućuje određivanje sadržaja određene tvari postupnim miješanjem ispitne otopine s kontroliranom količinom reagensa). Prethodno pripremljena razrjeđenja i njihovi kontrolni uzorci pažljivo se nanose na stakalce s antigenom. Potom se pripravci inkubiraju, nakon čega slijedi pranje i sušenje na zraku. Na stakalce s antigenom nanosi se tanak sloj antiseruma, nakon čega se provodi sekundarna inkubacija preparata i ponavlja cijeli prethodni lanac radnji koji završava sušenjem preparata. Kao rezultat toga, preparat na stakalcu se tretira glicerolom i ispituje pod fluorescentnim mikroskopom.

Rezultati reakcije procjenjuju se na skali od četiri točke, koja je karakterizirana intenzitetom površinskog žuto-zelenog sjaja antigenskih stanica:
+ vrlo slab sjaj stanice, primjetan samo na njenoj periferiji
++ slab sjaj periferije stanice, ali s jasno uočljivom zelenom nijansom
+++/++++ svijetlozeleni sjaj periferije stanice
Reakcijski titar smatra se razrjeđenjem seruma gdje najmanje 50% antigenskih stanica pokazuje jasan površinski sjaj, to jest rezultat reakcije +++ ili ++++ . Vrijednost raspona reakcije je od 1/80 do 1/100.

Intenzitet reakcije ovisi o broju istaloženih crvenih krvnih stanica na dnu formiranih rupa:
– negativna reakcija, koju karakterizira taloženje crvenih krvnih stanica na dnu jažica u obliku malog prstena s glatkim rubovima ili "gumb"
+ niskog intenziteta, ovu reakciju karakteriziraju male pojedinačne naslage na dnu rupe. Neaglutinirane crvene krvne stanice tvore "mali prsten" u središtu jažice
++ srednjeg intenziteta, karakteriziran je stvaranjem "širokog gustog prstena" neaglutiniranih eritrocita na dnu otvora
+++ intenzivna reakcija, aglutinirani eritrociti stvaraju takozvane „kišobrane“ u čijem središtu su jasno vidljivi prstenovi formirani od nataloženih neaglutiniranih eritrocita
++++ oštro intenzivna reakcija u kojoj sve crvene krvne stanice aglutiniraju i, formirajući "kišobrane", oblažu dno jažica.
Titar ove reakcije smatra se posljednjim razrjeđenjem seruma pri kojem se otkriva najmanje očita aglutinacija eritrocita. +++ , odnosno s intenzivnom ili oštro intenzivnom reakcijom.

Pouzdanost i kvaliteta seroloških dijagnostičkih metoda ovisi o organizaciji unutarnje i vanjske laboratorijske kontrole, koja se sastoji od nekoliko neovisnih postupaka namijenjenih procjeni kvalitete rezultata analize.

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum(RIBT). Preduvjet je da prije pregleda pacijent ne uzima antibiotike koji imaju toksični učinak na Treponema pallidum, uzrokujući njihovu nespecifičnu imobilizaciju.

Pozitivni rezultati RIBT-a otkrivaju se otprilike od sredine sekundarnog svježeg razdoblja sifilisa i mogu trajati dugo nakon liječenja. Ako je potrebno, metoda se koristi za otkrivanje AT u CSF-u, ovu studiju karakterizira visoka specifičnost, ali niska osjetljivost (oko 40%).

RIBT je malo koristan za dijagnosticiranje ranih oblika sifilisa zbog kasnog (ne prije 8-9 tjedana od trenutka infekcije) pojave AT-imobilizina; metoda može dati lažno pozitivne rezultate, osobito kod pacijenata s autoimunom patologijom, malignim bolestima i dijabetesom. Osim toga, RIBT je prilično složena, radno intenzivna i skupa analiza koja zahtijeva visokokvalificirano osoblje i prisutnost vivarija, pa se posljednjih godina koristi samo u određenim laboratorijima. U dijagnostici se RIBT koristi kao arbitar reakcije kada postoje odstupanja u rezultatima drugih seroloških studija, za razlikovanje lažno pozitivnih rezultata i za postavljanje dijagnoze kasnih oblika sifilisa.

Reakcija fiksacije komplementa s treponemskim antigenom (RSC s TA) Osjetljivost metode je oko 80%, specifičnost 98%. Metoda je bila dio skupa standardnih seroloških reakcija za sifilis, reguliranih Naredbom Ministarstva zdravstva SSSR-a br. 1161 od 2. rujna 1985. "O poboljšanju serološke dijagnoze sifilisa". Trenutačno je uporaba ove reakcije, poput CSC s kardiolipinskim antigenom, ograničena na pojedinačne laboratorije.

Reakcija imunofluorescencije (RIF). Za dijagnosticiranje sifilisa koristi se nekoliko modifikacija RIF-a: RIF-c - za otkrivanje AT u CSF-u, RIF-200 (testni serum se razrijedi 200 puta prije reakcije); RIF-abs (RIF s apsorpcijom), IgM-RIF-abs (za određivanje IgM AT). Što se tiče osjetljivosti i specifičnosti, RIF-abs nije inferioran od RIBT-a, ali je provedba ove metode mnogo jednostavnija. Rezultati RIF-abs postaju pozitivni od 3. tjedna nakon infekcije (prije pojave šankroida ili istovremeno s njim), to je metoda za ranu dijagnozu sifilisa. Pozitivni rezultati istraživanja često se nalaze mnogo godina nakon potpunog liječenja ranog sifilisa, au bolesnika s kasnim sifilisom - desetljećima.

Indikacije za izvođenje RIF-abs:

• pozitivni rezultati NTT-a u trudnica u nedostatku kliničkih i anamnestičkih podataka koji ukazuju na sifilis;
• pregled osoba s raznim somatskim i zaraznim bolestima, kod kojih se bilježe pozitivni rezultati NTT-a;
• pregled osoba s kliničkim manifestacijama karakterističnim za sifilis, ali s negativnim rezultatima NTT;
• rana dijagnoza sifilisa;
• u nekim slučajevima - kao kriterij uspjeha antisifilitičkog liječenja: prijelaz pozitivnog RIF-abs u negativni nakon liječenja je 100% kriterij za izlječenje sifilisa.

IgM-RIF-abs se koristi za odvojeno otkrivanje AT klase Ig, što je od posebnog interesa u dijagnostici kongenitalnog sifilisa, kada su AT Treponema sintetizirani u djetetovom tijelu predstavljeni IgM, a AT IgG majčinog podrijetla. Indikacije za ovu studiju su: dijagnoza kongenitalnog sifilisa; procjena rezultata liječenja ranog sifilisa.

RIF ima visoku osjetljivost (98,5%) i specifičnost (99,6%) za gotovo sve oblike sifilisa. Nedostaci RIF-a su: nemogućnost automatizacije istraživanja i bilježenja rezultata; poteškoće u pripremi visokokvalitetnog antigena iz suspenzije Treponema pallidum dobivene iz testisa zaraženog kunića; subjektivnost u ocjenjivanju rezultata.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Usporedba rezultata dobivenih pomoću RPGA i RIBT, RIF-abs, CSR, MRP pokazala je visoku osjetljivost i specifičnost RPGA u dijagnostici sifilisa, što se podudara s rezultatima RIF-abs.

RPGA se može izvesti u kvalitativnoj i kvantitativnoj verziji; postoje njihove makro- i mikro-modifikacije. Kvantitativna RPGA metoda omogućuje procjenu koncentracije specifičnih treponemskih protutijela u krvi. Titri od 1:640 i niži tipični su za pacijente koji su u prošlosti liječeni od sifilisa. Viši titri uobičajeni su za aktivnu, neliječenu infekciju.

Pozitivni rezultati RPGA obično se bilježe 3 tjedna nakon pojave šankra, a zatim u pacijenata koji su imali sifilis dugi niz godina, često doživotno.

Osjetljivost RPGA je 76% za primarni sifilis; 100% za sekundarni sifilis; 97% za latentni sifilis; 94% za kasni sifilis. Specifičnost RPGA veća je od specifičnosti RIF–abs i iznosi 99%.

Zbog omjera visoke specifičnosti, osjetljivosti, jednostavnosti izvođenja i standardiziranosti reagensa među treponemskim testovima za serodijagnostiku sifilisa, RPGA dosljedno zauzima vodeće mjesto u kliničkoj praksi u svijetu.

Posebne prednosti ELISA testa su: visoka osjetljivost i specifičnost metode; automatizacija podešavanja reakcije; visok stupanj standardizacije; sposobnost proučavanja velikog broja uzoraka seruma; u kvantitativnom računovodstvu i objektivnom dokumentiranju dobivenih rezultata; mogućnost istovremenog određivanja titra antitreponemalnih protutijela različitih klasa (IgG i IgM) u jednom uzorku; prikladnost za ranu dijagnostiku sifilisa i dijagnostiku kongenitalnog sifilisa; u jednostavnosti korištenja za testiranje krvi u službi transfuzije krvi; primjenjivost kao potvrdni specifični treponemski test. Osjetljivost ELISA je 98-100%, specifičnost 96-100%.

Nedostaci ELISA uključuju: neprikladnost za proučavanje pojedinačnih uzoraka; dulje razdoblje prije dobivanja rezultata i kraći rok trajanja ELISA kitova, primjerice, u odnosu na RPGA.

Imunološka mrlja (IB). Jedna od suvremenih metoda za dijagnosticiranje sifilisa je IB određivanje IgG ili IgM protutijela na pojedina protutijela Treponema pallidum.

Metoda ima visoku osjetljivost (do 100%), specifičnost (98%) i ponovljivost (100%). Studija omogućuje proučavanje spektra antitijela na nekoliko antigena T. pallidum odjednom, koristeći visoko pročišćene rekombinantne i peptidne antigene koji smanjuju nespecifičnu reaktivnost seruma na minimum.

Sve to određuje mogućnost davanja prednosti IB metodi nad drugim treponemskim testovima za provjeru dijagnoze sifilisa u teškim slučajevima, posebno za dijagnosticiranje sifilisa u drugoj polovici razdoblja inkubacije, latentnog kongenitalnog sifilisa u prvim danima života djeteta, za prepoznavanje latentnog sifilisa kod osoba sa slabim humoralnim odgovorom, kao i za razlikovanje lažno pozitivnih rezultata od drugih testova.

Zarazne bolesti pokreću stvaranje odgovarajućih protutijela u krvi bolesne osobe. Tako funkcionira imunološka obrana organizma.

Određivanje prisutnosti protutijela na određeni virus ili bakteriju omogućuje otkrivanje početka bolesti prije nego što se pojave glavni simptomi. Danas serološki testovi daju najpotpuniju sliku. Stoga ćemo u ovom članku govoriti o serološkim pretragama.

Što su serološki testovi

Metode proučavanja bioloških materijala ljudi i životinja kojima se u njima mogu otkriti protutijela ili antigeni koje tijelo proizvodi kao zaštitnu reakciju u borbi protiv infekcija nazivaju se serološke studije. Takve se metode koriste za određivanje uzročnika infekcije, kao iu svrhu:

• određivanje krvne grupe,
• proučavanje imuniteta određivanjem razine njegove humoralne komponente,
• određivanje tkivnih antigena.

Kome je propisano?

Zašto to učiniti?

Stručnjaci ovu metodu cijene kao način kvalitetne dijagnoze bolesti.

• Ako je pacijent u fazi bolesti, preporučuje se provođenje ponovljenih studija u intervalima od otprilike tjedan dana kako bi se pratila učinkovitost primijenjenog liječenja.
• Serološki testovi često se koriste kako bi se utvrdilo koji je uzročnik uzrokovao bolest nakon što ju je bolesnik prebolio.

Vrste postupaka

Serološke metode istraživanja temelje se na različitim reakcijama:

• Reakcija neutralizacije oslanja se na svojstvo protutijela imunološkog seruma da djeluju kao neutralizirajuće sredstvo protiv samih toksina ili mikroorganizama, sprječavajući njihove štetne učinke.
• Reakcija aglutinacije, koji je pak podijeljen u sljedeće podvrste:
  • izravne reakcije - koriste se za ispitivanje krvnog seruma na prisutnost protutijela. Ubijeni mikrobi dodaju se sastavu koji se proučava, a ako se pojavi talog u obliku pahuljica, to znači da je reakcija na ovu vrstu mikroba pozitivna;
  • reakcija neizravne hemaglutinacije provodi se uvođenjem u krvni serum eritrocita na kojima su adsorbirani antigeni; ovi agensi stupaju u interakciju s istom vrstom antigena prisutnih u krvnom serumu, što rezultira nazubljenim talogom.
• Reakcija koja uključuje komplement koristi se za otkrivanje zaraznih bolesti. Metoda se provodi aktivacijom komplementa i promatranjem reakcija koje se odvijaju u mediju koji se proučava.
• Reakcija taloženja provodi se slojevitim nanošenjem otopine antigena na tekući medij – imunološki serum. Antigen koji se koristi za ovu metodu je topiv. Reakcija je da kompleks antigen-antitijelo prolazi kroz taloženje; nastali talog naziva se talog.
• Reakcija pomoću obilježenih antigena i antitijela temelji se na činjenici da mikrobi ili tkivni antigeni, obrađeni na određeni način, stječu sposobnost emitiranja svjetlosti pod utjecajem ultraljubičastih zraka. Metoda se koristi ne samo za dijagnosticiranje antigena, već i za određivanje ljekovitih tvari, enzima i hormona.

Kontraindikacije za

Budući da metoda uključuje proučavanje biološkog materijala pacijenta, ne može imati negativan učinak na ljude. Stoga nema kontraindikacija za uporabu.

Studija je potpuno sigurna.

U nastavku ćemo opisati kako se provodi serološki test.

Indikacije za ispitivanje

Metoda se koristi za određivanje uzročnika infekcije, uključujući sljedeće bolesti:

• HIV infekcija,
• toksoplazmoza,
• zarazne bolesti stečene seksualnim kontaktom;
• difterija,
• Dostupnost ;
• bruceloza,
• stafilokokne infekcije,
• hepatitis.

Metoda se također koristi za prepoznavanje sljedećih bolesti:

• opistorhijaza,
• amebijaza,
• cisticerkoza,
• giardijaza,
• upala pluća.

Priprema za postupak

Za postupak nisu potrebne posebne pripreme. Mora se poštovati jedan uvjet: uzorkovanje krvi vrši se na prazan želudac.

U nastavku je opisan algoritam uzorkovanja (uzimanja) krvi (materijala) za serološke pretrage.

Provođenje analize

Krv se uzima iz ulne vene. Da bi studija uspjela, krv se ne uzima štrcaljkom, već gravitacijom. Igla bez štrcaljke umetne se u venu i u epruvetu se prikupi do 5 ml krvi.

Tijekom postupka pacijent osjeća blagu nelagodu dok se igla uvodi u venu. Sljedeći koraci nisu nimalo zabrinjavajući.

Tumačenje rezultata serološke pretrage krvi opisano je u nastavku.

Dekodiranje rezultata

Dobivene rezultate treba promatrati zajedno s kliničkom slikom bolesti, provjeravajući sumnju na dijagnozu pomoću nekoliko pretraga. To je zbog činjenice da su testovi specifični i ponekad nemaju apsolutnu osjetljivost na zarazne bolesti.

Cijena sveobuhvatne serološke pretrage krvi opisana je u nastavku.

Prosječna cijena postupka

Cijena zahvata ovisit će o vrsti studije. Sastoji se od troškova analize i troškova antitijela na određeni patogen. Prosječna cijena postupka je unutar 700 rubalja.

Serološke reakcije opisane su u videu ispod: