Reakcija neizravne ili pasivne hemaglutinacije (IPHA). Reakcije hemaglutinacije (imunološka metoda) Rnga reakcija neizravne hemaglutinacije

Reakcija neizravne ili pasivne hemaglutinacije (IPHA)

Ova reakcija je bolja u osjetljivosti od reakcije aglutinacije i koristi se u dijagnostici infekcija uzrokovanih bakterijama, rikecijama, protozoama i drugim mikroorganizmima.

RPGA vam omogućuje otkrivanje male koncentracije protutijela.

Ova reakcija uključuje štavljene ovčje eritrocite ili ljudske eritrocite s krvnom grupom I, senzibilizirane antigenima ili antitijelima.

Ako se u ispitivanom serumu otkriju antitijela, tada se koriste crvene krvne stanice senzibilizirane antigenima (eritrocitni dijagnostikum).

U nekim slučajevima, ako je potrebno odrediti različite antigene u ispitivanom materijalu, koriste se eritrociti senzibilizirani imunoglobulinima.

Rezultati RPGA uzimaju se u obzir prema prirodi sedimenta eritrocita.

Rezultat reakcije smatra se pozitivnim kada crvene krvne stanice ravnomjerno prekriju cijelo dno epruvete (obrnuti kišobran).

Kod negativne reakcije crvena krvna zrnca u obliku malog diska (gumbića) nalaze se u središtu dna epruvete.

Reakcija aglutinacije (RA)

Zbog svoje specifičnosti, lakoće izvođenja i demonstrativnosti, reakcija aglutinacije postala je raširena u mikrobiološkoj praksi za dijagnostiku mnogih zaraznih bolesti: trbušni tifus i paratifus (Vidalova reakcija), tifus (Weiglova reakcija) itd.

Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnosti međudjelovanja protutijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama (aglutinogeni). Kao rezultat te interakcije nastaju čestice – nakupine koje se talože (aglutiniraju).

Reakcija aglutinacije može uključivati ​​žive i mrtve bakterije, spirohete, gljivice, protozoe, rikecije, kao i crvena krvna zrnca i druge stanice.

Reakcija se odvija u dvije faze: prva (nevidljiva) - specifična, kombinacija antigena i antitijela, druga (vidljiva) - nespecifična, lijepljenje antigena, tj. stvaranje aglutinata.

Aglutinat nastaje kada se jedan aktivni centar dvovalentnog antitijela spoji s determinantnom skupinom antigena.

Reakcija aglutinacije, kao i svaka serološka reakcija, događa se u prisutnosti elektrolita.

Izvana, manifestacija pozitivne reakcije aglutinacije ima dvojak karakter. Kod mikroba s bičevima koji imaju samo somatski O-antigen, same mikrobne stanice prianjaju izravno. Ova aglutinacija naziva se sitnozrnata. Javlja se unutar 18 - 22 sata.

Mikrobi flagelati imaju dva antigena - somatski O-antigen i flagelarni H-antigen. Ako su stanice zalijepljene bičevima, nastaju velike, rahle ljuskice i ova reakcija aglutinacije naziva se krupnozrnata. Javlja se unutar 2 - 4 sata.

Reakcija aglutinacije može se provesti kako u svrhu kvalitativnog i kvantitativnog određivanja specifičnih protutijela u krvnom serumu bolesnika, tako i u svrhu određivanja vrste izoliranog uzročnika. hemaglutinacija microbiological infectious

Reakcija aglutinacije može se izvesti iu proširenoj verziji, koja vam omogućuje rad sa serumom razrijeđenim na dijagnostički titar, iu indikativnoj reakcijskoj verziji, koja vam u načelu omogućuje otkrivanje specifičnih protutijela ili određivanje vrste patogena. .

Test neizravne ili pasivne hemaglutinacije (IRHA ili RPHA) osjetljiviji je i specifičniji od testa aglutinacije. Ova se reakcija također koristi u dva smjera.

1) Za otkrivanje protutijela u krvnom serumu bolesnika koristi se dijagnostika eritrocita, u kojoj se antigen adsorbira na površini eritrocita tretiranih taninom. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RPHA.

Ispitivani serum razrijedi se u jažicama plastičnih pločica i doda eritrocitni dijagnostikum. Uz pozitivnu reakciju pojavljuje se tanki film duž zidova rupe u obliku "čipkastog kišobrana", s negativnom reakcijom pojavljuje se gusti sediment crvenih krvnih stanica u obliku "gumbića".

2) Za otkrivanje toksina i bakterijskih antigena u ispitivanom materijalu koristi se eritrocitna dijagnostika antitijela, dobivena adsorpcijom antitijela na eritrocite. U odnosu na ovu reakciju češće se koristi termin RNGA. Na primjer, uz pomoć dijagnostike protutijela detektira se antigen bacila kuge, egzotoksin difterije i egzotoksin botulina.

Coombsov test (aptiglobulinski test)

Reakcija se koristi za otkrivanje nepotpunih antitijela, na primjer, antitijela na Rh faktor. Ispitni serum dodaje se Rh + eritrocitima, u kojima se pretpostavlja prisutnost nepotpunih antitijela na Rh faktor. Vezana za crvena krvna zrnca, nepotpuna antitijela ne uzrokuju aglutinaciju, jer imaju samo jedno aktivno središte. Zatim se dodaje antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humane globuline. U kombinaciji s nepotpunim protutijelima, antiglobulinski serum uzrokuje aglutinaciju crvenih krvnih stanica.

Reakcija taloženja

Bit reakcije je sedimentacija (taloženje) antigena pod utjecajem specifičnih protutijela. Za postizanje vidljive reakcije neophodna je prisutnost elektrolita. Antigen u reakciji taloženja su molekularno dispergirane tvari.

Prstenasta reakcija taloženja smješteni u uske taložne cijevi. Imuni serum se ulije u epruvetu, na koju se pažljivo naslaže ispitni materijal. Ako se u njemu nalazi antigen, na granici dviju tekućina stvara se neproziran prsten taloga.

Reakcija se koristi u sudskoj medicini za određivanje vrste proteina u mrljama krvi, sjemenu itd.; za određivanje antigena u dijagnostici antraksa (Ascolijeva reakcija), meningitisa i drugih infekcija; u sanitarnim i higijenskim studijama - za utvrđivanje krivotvorenja prehrambenih proizvoda. Imunoprecipitirajući serumi dobivaju se imunizacijom životinja s odgovarajućim antigenom. Na primjer, serum za precipitaciju ljudskih proteina dobiva se imunizacijom zeca ljudskim proteinima. Titar taloženog seruma je najveće razrjeđenje antigena s kojim reagira. Serum se obično koristi nerazrijeđen ili u razrjeđenju 1:5.

Reakcija taloženja agar gela provodi se pomoću nekoliko metoda. To su reakcija dvostruke imunodifuzije, reakcija radijalne imunodifuzije i reakcija imunoelektroforeze.

Reakcija dvostruke imunodifuzije(prema Ouchterlonyju). Otopljeni agar gel se ulije u Petrijevu zdjelicu i nakon stvrdnjavanja u njoj se izrežu jažice. Antigen se stavlja u neke jažice, a imuni serumi u druge, koji difundiraju u agar i stvaraju talog u obliku bijelih pruga na mjestu susreta.

Reakcija radijalne imunodifuzije(prema Manciniju). Imunološki serum dodaje se otopljenom agar gelu i ulijeva u šalicu. Nakon stvrdnjavanja agara izrezuju se jažice i u njih se stavljaju antigeni koji difundirajući u agar formiraju prstenaste precipitacijske zone oko jažica. Što je veća koncentracija antigena, to je veći promjer prstena. Reakcija se koristi, na primjer, za određivanje imunoglobulina različitih klasa u krvi. Kao antigeni u ovoj reakciji djeluju imunoglobulini klasa IgG, IgM, IgA, a antitijela protiv njih sadržana su u specifičnim monoreceptorskim serumima.

Imunoelektroforeza. Elektroforeza proteinskih antigena provodi se u agar gelu. Taloženi serum se uvodi u žlijeb, koji ide paralelno sa smjerom kretanja proteina. Antigeni i antitijela difundiraju u agar i tamo gdje se susreću formiraju se precipitacijske linije.

Imunološke reakcije lize

Antigen (eritrociti ili bakterije) u kombinaciji sa specifičnim protutijelima stvara imunološki kompleks na koji se veže komplement (C1), a komplement se aktivira klasičnim putem. Aktivirani komplement razlaže crvene krvne stanice (hemoliza) ili bakterije (bakterioliza). Reakcija bakteriolize koristi se za identifikaciju Vibrio cholerae.

Reakcija hemolize. Antigen u reakciji su eritrociti, antitijela (hemolizini) sadržani su u hemolitičkom serumu. Hemolizini se vežu za crvena krvna zrnca i aktivira se komplement koji lizira crvene krvne stanice. Mutna suspenzija crvenih krvnih stanica pretvara se u prozirnu svijetlo crvenu tekućinu - "lakiranu krv". Budući da se reakcija hemolize javlja samo u prisutnosti komplementa, ona se koristi kao indikator za dokazivanje komplementa.

Lokalna reakcija hemolize u gelu(Erne reakcija) - varijanta reakcije hemolize. Služi za određivanje broja stanica koje stvaraju antitijela (AFC) u slezeni i limfnim čvorovima.

Otopljeni agar gel se miješa sa suspenzijom stanica slezene i crvenih krvnih stanica, a nakon što se agar skrutne dodaje se komplement. Oko svake stanice koja proizvodi hemolizin formira se zona hemolize. Broj stanica koje proizvode hemolizin određen je brojem takvih zona.

Koristi crvene krvne stanice ili neutralne sintetičke materijale (na primjer čestice lateksa), na čijoj se površini apsorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni. Crvene krvne stanice senzibilizirane antigenima nazivaju se antigenski dijagnostikum eritrocita i koriste se za otkrivanje i titraciju protutijela. Eritrociti senzibilizirani antitijelima. nazivaju se imunoglobulinski eritrocitni dijagnostikumi i koriste se za dokazivanje antigena.

Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera i dr.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpelji). prenosivi encefalitis, krimska hemoragijska groznica itd.), kao i za određivanje određenih hormona, za prepoznavanje preosjetljivosti bolesnika na lijekove i hormone, kao što su penicilin i inzulin.

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Test pasivne hemaglutinacije je osjetljiva metoda serološke dijagnostike i koristi se kako za ranu tako i za retrospektivnu dijagnostiku, kao i za određivanje imunološkog stanja cijepljenih osoba. U bolesnika s tularemijom protutijela se obično otkrivaju na kraju 1. ili 2. tjedna bolesti; nakon 1-1,5 mjeseci titri RPHA dosežu maksimalne razine (1: 100 000-1: 20 000, rjeđe više), nakon čega se smanjenje na razinu 1:100-1:200 pohranjuju se dulje vrijeme.

U cijepljenih ljudi, antitijela se također konstantno otkrivaju, ali u nižim titrima, ne prelazeći 1: 2000-1: 5000 1-1,5 mjeseci nakon cijepljenja, i ostaju nekoliko godina na niskoj razini od 1: 20-1: 80.

Antigen za postavljanje RPHA je eritrocitni dijagnostikum tularemije (antigen). Lijek su formalizirane crvene krvne stanice ovaca, senzibilizirane antigenom tularemije, dostupne u tekućem i suhom obliku. Tekući pripravak - 10% suspenzija crvenih krvnih stanica u otopini formaldehida koncentracije 10%. Suhi liofilizirani pripravak je vakuumski osušena 10% suspenzija crvenih krvnih stanica bez konzervansa. Prije upotrebe razrjeđuje se prema uputama na etiketi. Za postavljanje reakcije u polistirenskim pločama oba lijeka koriste se u koncentraciji od 2,5%, a kod postavljanja reakcije u mikrovolumenima - u koncentraciji od 0,5%.

Tehnika postavljanja RPGA. Ispitivani serumi se razrjeđuju fiziološkom otopinom 1:5 (1:10) i zagrijavaju na 56 stupnjeva C 30 minuta. Nakon toga, radi uklanjanja heterogenih protutijela na ovčje eritrocite, serumi se tretiraju s 50% suspenzijom formaliniziranih ovčjih eritrocita. Da biste to učinili, dodajte crvene krvne stanice brzinom od 2 kapi (0,05 ml) na 1 ml seruma i temeljito promiješajte mućkajući. Serum se ostavi dok se eritrociti potpuno ne slegnu ili se centrifugira nakon sat vremena na sobnoj temperaturi, nakon čega je spreman za pretragu.

Tekućina za razrjeđivanje se izlije u volumenu od 0,5 ml u niz jažica na polistirenskoj ploči. Tijekom preliminarnog proučavanja seruma, preporučljivo je testirati ih postavljanjem reakcije u kratkom nizu ploče (6 jažica). Ako se protutijela otkriju u kratkoj seriji, serumi se ponovno testiraju u dugoj seriji razrjeđenja (12 jažica). Nakon prolijevanja tekućine za razrjeđivanje, dodajte 0,5 ml ispitnog seruma u razrjeđenju 1:5 u prvu jažicu svakog reda (kratku ili dugu). Zatim se isti volumeni seruma titriraju dvostrukim razrjeđenjima. Tako se dobivaju razrjeđenja seruma u kratkoj seriji od 1:10 do 1:320, a u dugoj seriji od 1:10 do 1:20480. Nakon titracije seruma, u svaku jažicu se doda jedna kap (0,05 ml) radne 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita. Sadržaj pločica se temeljito protrese dok se ne dobije homogena suspenzija. Ploče se ostave na sobnoj temperaturi na nepomičnoj površini stola. Preliminarno snimanje reakcije provodi se nakon 2-3 sata, konačno određivanje titra vrši se nakon potpune sedimentacije crvenih krvnih stanica u jažicama. Za reakciju su predviđene sljedeće kontrole: 1) ispitni serum razrijeđen u omjeru 1:10 u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocita; 2) tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibiliziranih eritrocita; 3) tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita. Sve kontrole trebale bi dati jasno negativnu reakciju.

Računovodstvo i procjena RPGA. Reakcija se procjenjuje prema sljedećoj shemi:

1) oštro pozitivna reakcija (++++) - crvene krvne stanice padaju na dno rupe u ravnomjernom sloju u obliku "kišobrana", koji često ima nazubljeno topljenje rubova;

2) pozitivna reakcija (+++) - crvene krvne stanice prekrivaju najmanje 2/3 dna jažice;

3) slabo pozitivna reakcija (++) - aglutinat je malen i nalazi se u samom središtu jažice;

4) upitna reakcija (+) - oko sedimenta eritrocita u samom središtu jažice nalaze se pojedinačna zrnca aglutinata;

5) negativno (-) - na dnu rupice, crvene krvne stanice se smjeste u obliku "gumbića" ili malog prstena s glatkim, oštro definiranim rubovima.

Titar seruma se uzima u obzir na temelju zadnjeg razrjeđenja seruma koje je dalo vrlo jasnu reakciju (barem tri plusa). Dijagnostičkim titrom smatra se razrjeđenje od 1:100 ili više, ali kao i kod RA potrebno je pratiti njegov porast.

RPHA za tularemiju je prilično specifičan i otkriva neke križne reakcije samo sa serumima bruceloze. Diferencijalna dijagnoza je moguća prema visini titra u RPGA, koji su značajno viši kod homolognog antigena.

Tehnika postavljanja RPHA u mikrovolumenima. RPGA se može izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitratora tipa Takachi (ili mikropločica s okruglim dnom s mikropipetama), koji omogućuje titraciju materijala u volumenima od 25 μl i 50 μl. Reakcijska tehnika i redoslijed svih operacija isti su kao kod proučavanja u polistirenskim pločama. Treba, međutim, imati na umu da je osjetljivost mikrometode obično za jedno razrjeđenje (tj. 2 puta) niža od osjetljivosti makrometode.

Za postavljanje reakcije u mikrotitratoru, tekućina za razrjeđivanje u volumenu od 50 μl doda se u svaku jažicu pomoću pipete s kapaljkom. Zatim se pomoću titratora s glavom od 50 μl prikuplja ispitni serum uranjanjem glave u njega. Provjerite je li tekućina ispunila glavu titratora. Titrator sa serumom se prenese u prvu jažicu i, držeći ga u okomitom položaju, napravi nekoliko rotacijskih pokreta u oba smjera. Zatim se titrator prenese u sljedeću jažicu i manipulacija se ponovi. Titracija se može provoditi istovremeno u nekoliko redova. Nakon titriranja cijelog niza, titrator se ispere destiliranom vodom (izmjena 2 obroka) rotirajućim pokretima, voda se skine s glave vatom i spali na plamenu plamenika.

Nakon titracije, dodajte 25 μl tekućine za dijagnostiku eritrocita u jažice. Koncentracija dijagnostikuma za RPHA u mikrovolumenima treba biti 0,5% (tj. 2,5% suspenzija crvenih krvnih stanica dodatno se razrijedi 5 puta). Nakon dodavanja crvenih krvnih stanica, pločice treba lagano protresti dok se ne dobije homogena suspenzija. Rezultati se mogu snimiti unutar 1-1,5 sati, što je značajna prednost RPGA u mikrotitru. Osim toga, ova tehnika zahtijeva male količine svih reakcijskih sastojaka i ispitnih seruma.

Reakcija se uzima u obzir prema sljedećoj shemi:

1) "+" - potpuna hemaglutinacija, u kojoj crvene krvne stanice padaju na dno jažice u ravnomjernom sloju u obliku "kišobrana", zauzimajući najmanje 2/3 dna;

2) "+-" - djelomična hemaglutinacija, u kojoj crvene krvne stanice padaju na dno u obliku labavog prstena male veličine;

3) "-" - odsutnost hemaglutinacije, kada crvene krvne stanice padaju na dno u obliku malog gumba ili prstena s glatkim rubom.

Specifičnost pozitivnog rezultata dobivenog u RPHA može se ispitati pomoću trokomponentne reakcije - reakcije inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA).

Tehnika postavljanja RTPGA. Ova se reakcija koristi za potvrdu specifičnosti pozitivnog RPGA rezultata kada postoji sumnja ili je od posebnog epidemiološkog interesa. Mehanizam reakcije je specifična inhibicija hemaglutinacije kada se ispitivanom serumu doda suspenzija ubijenih bakterija tularemije. U reakciji međusobno djeluju tri komponente: testni serum, specifični antigen tularemije i antigenski eritrocitni dijagnostikum RTPHA se obično postavlja u niz od 7-8 jažica. Preporučljivo je instalirati ponovljeni RPGA paralelno s RTPGA. U dva reda jažica ulije se 0,25 ml tekućine za razrjeđivanje, zatim se u prve jažice oba reda doda ispitivani serum u volumenu od 0,25 ml i provede titracija.Dobiju se dva identična reda razrjeđenja seruma. U sve jažice drugog reda dodajte 0,25 ml tekućine za razrjeđivanje, au jažice prvog reda 0,25 ml suspenzije bakterije tularemije. Koristi se Tularemia diagnosticum (sadrži 25 milijardi bakterija tularemije u 1 ml), prethodno razrijeđen 50 puta. Ova suspenzija sadrži 500 milijuna bakterija u 1 ml ili 125 milijuna u volumenu od 0,25 ml. Nakon dodavanja antigena, ploča se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po jedna kap (0,05 ml) eritrocitnog dijagnostikuma, protrese se i ostavi na ravnoj površini stola. Računovodstvo se provodi nakon 2-3 sata.

Računovodstvo i procjena RTPGA. Ako ispitivani serum sadrži specifična protutijela protiv tularemije, ona se neutraliziraju dodanim antigenom i neće doći do hemaglutinacije u prvom redu jažica ili će se, uz visok titar seruma, hemaglutinacija uočiti u manjem (2-4) broju jažica. bušotina nego u redu s RPHA. U ovom slučaju potvrđena je specifičnost rezultata. Ako se uoči hemaglutinacija u oba reda, tj. Ako se rezultati RTPGA i RPGA podudaraju, to ukazuje na odsutnost protutijela protiv tularemije u ispitivanom serumu. U ovom slučaju, primarni rezultat RPGA smatra se nespecifičnim.

Tehnika inscenacije RTHG u mikrovolumenima. RTPGA, kao i RPGA, može se izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitra Takachi tipa. Da biste to učinili, dodajte 0,25 μl tekućine za razrjeđivanje u jažice mikropločica u dva reda od po 7-8 jažica. Zatim se pomoću titratora doda 0,25 μl ispitivanog seruma i titrira u oba reda. Nakon toga se u svaku jažicu u prvom redu doda 25 μl antigena tularemije (čija je koncentracija 500 milijuna bakterija tularemije u 1 ml), au drugi red 25 μl tekućine za razrjeđivanje. Ploče se ostave 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda 25 μl antigenskog zritrocitnog dijagnostikuma (0,5% koncentracija). Računovodstvo i procjena rezultata provode se slično reakcijama u makrovolumenima.

Reakcija aglutinacije – RA(od lat. aglutinacija- adhezija) je jednostavna reakcija u kojoj protutijela vežu korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge stanice, netopljive čestice na kojima su adsorbirani antigeni, kao i makromolekularne nakupine). Javlja se u prisutnosti elektrolita, na primjer, kada se doda izotonična otopina natrijeva klorida.

Koriste se različite mogućnosti reakcije aglutinacije: ekstenzivna, indikativna, neizravna itd. Reakcija aglutinacije očituje se stvaranjem pahuljica ili sedimenta.

RA se koristi za:

određivanje protutijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, s brucelozom (Wrightova, Heddelsonova reakcija), trbušnog tifusa i paratifusne groznice (Vidalova reakcija) i drugih zaraznih bolesti;

određivanje uzročnika izoliranog od pacijenta;

određivanje krvnih grupa monoklonskim antitijelima protiv aloantigena eritrocita.

Odrediti antitijela kod bolesnika stavitidetaljna reakcija aglutinacije: dodati u razrjeđenja krvnog seruma bolesnika dijagnostikum(suspenzija ubijenih mikroba) i nakon nekoliko sati inkubacije na 37 °C bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma) pri kojem dolazi do aglutinacije, odnosno do stvaranja taloga.

Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i protutijela. Primjer su osobitosti interakcije dijagnostikuma (O- i R-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije sa O-dijagnostikum(bakterije ubijaju toplinom, zadržavaju toplinsku stabilnost O-antigen) javlja se u obliku sitnozrnaste aglutinacije. Reakcija aglutinacije s H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i odvija se brže.

Ako je potrebno odrediti uzročnika izoliranog od pacijenta, staviti indikativna reakcija aglutinacije, pomoću dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), tj. provodi se serotipizacija uzročnika. Indikativna reakcija provodi se na predmetnom staklu. Čista kultura uzročnika izolirana od bolesnika dodaje se kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20. U blizini se nalazi kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijevog klorida. Kada se u kapi koja sadrži serum i mikrobe pojavi flokulentni sediment, a opsežna reakcija aglutinacije u epruvetama s rastućim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma u koji se dodaju 2-3 kapi suspenzije uzročnika. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stupnjem bistrine tekućine. Reakcija se smatra pozitivnom ako se uoči aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Istodobno se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnom otopinom natrijevog klorida treba biti proziran, suspenzija mikroba u istoj otopini treba biti jednoliko mutna, bez sedimenta.

Različite srodne bakterije mogu se aglutinirati istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, što otežava njihovu identifikaciju. Stoga koriste adsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su protutijela koja unakrsno reagiraju uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela koja su specifična samo za određenu bakteriju. Proizvodnju posebnih monoreceptorskih dijagnostičkih aglutinirajućih seruma predložio je A. Castellani (1902.).

Neizravna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA, RPGA) temelji se na korištenju eritrocita s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma uzrokuje sljepljivanje eritrocita i ispadanje na dno testa. cijev ili ćelija V u obliku nazubljenog sedimenta (sl. 13.2). U slučaju negativne reakcije, crvena krvna zrnca se talože ■ u obliku „gumbića“. Tipično, protutijela se otkrivaju u RNGA pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji se sastoji od eritrocita s adsorbiranim na ih s antigenima. Ponekad se koristi dijagnostika anti-A eritrocita, na koje se adsorbiraju antitijela. Na primjer, botulinum toksin se može detektirati dodavanjem eritrocitnog protutijela na botulinum toksin (ova reakcija se zove reverzna reakcija neizravne hemaglutinacije- RONG). RNGA se koristi za dijagnosticiranje zaraznih bolesti i određivanje gonadotropnog hormona V urin prilikom utvrđivanja trudnoće, za prepoznavanje preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.

COMBES REAKCIJA

(Coombsov test) - metoda za određivanje Rh antitijela na površini crvenih krvnih stanica, koja uzrokuju taloženje globulina u krvnom serumu. Ovaj se test koristi za dijagnosticiranje hemolitičke anemije u dojenčadi s Rh inkompatibilnošću koja imaju razaranje crvenih krvnih stanica.

Reakcija koaglutinacije. Stanice patogena određuju se pomoću stafilokoka prethodno tretiranih imunodijagnostičkim serumom. Stafilokok koji sadrži protein A, koji imaju afinitet prema Fc fragmentu imunoglobulina, nespecifično adsorbiraju antimikrobna protutijela, koja zatim stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranima od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju pahuljice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih antitijela u serumu i otkrivenog mikroba.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije(RTGA) temelji se na blokadi, supresiji virusnih antigena imunološkim serumskim antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica (slika 13.3). RTGA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, čiji uzročnici (virusi gripe, ospica, rubeola, krpeljni encefalitis itd.) mogu aglutinirati crvena krvna zrnca raznih životinja.

1. Skupina liječnika iz Svjetske zdravstvene organizacije stigla je u Indiju kako bi identificirala oboljele od dječje paralize i pomogla u provođenju univerzalnog cijepljenja protiv dječje paralize. U jednom od ispitanih sela liječnicima je doveden šestogodišnji dječak iz velike obitelji koji se razbolio prije 5 dana. Temperatura je naglo porasla, javila se jaka glavobolja, opetovano povraćanje, bolovi u rukama i nogama. Na pregledu: visoka temperatura, jaka slabost, meningealni simptomi, smanjen tonus mišića na desnoj nozi, oštro oslabljeni refleksi tetiva, stopalo spušteno. Pri punkciji spinalnog kanala likvor je istjecao pod povišenim tlakom, povećan je broj limfocita, a bakterije nisu izolirane. Postavljena je preliminarna dijagnoza "paralitički oblik poliomijelitisa". Kako se dječak mogao zaraziti? Kako se provodi specifična aktivna prevencija dječje paralize? Postoji li opasnost od zaraze druge djece u ovoj obitelji, što učiniti?

Odgovor: Dječak se mogao zaraziti fekalno-oralnim putem hranom, vodom, ali i kapljičnim putem. Glavna mjera prevencije dječje paralize je imunizacija živom kulturom cjepiva od 3 serotipa sojeva Sabin.U Rusiji se koristi cijepljenje protiv dječje paralize za oralnu primjenu proizveden od strane Instituta za poliomijelitis i virusni encefalitis nazvan. M.P. Čumakova. Cjepivo je trovalentni pripravak atenuiranih Sabinovih sojeva polio virusa tipa 1, 2, 3, dobivenih iz primarne kulture stanica bubrega afričkog zelenog majmuna. . Djeca u dobi od 3 mjeseca do 6 godina podliježu rutinskom cijepljenju protiv dječje paralize. Cijepljenja oralnim cjepivom protiv dječje paralize provode se s 2 ili 4 kapi cjepiva oralno tri puta u 3, 4, 5 i 6 mjeseci s tri revakcinacije u 18, 20 mjeseci i 14 godina. Oboljeli dječak mora biti hospitaliziran, a sva ostala djeca ove obitelji moraju biti cijepljena živim cjepivom protiv dječje paralize.

1. Sastav i uporaba trovalentnog polimer-podjedinice tekućeg cjepiva protiv gripe (influenca)

Ovo je molekularno cjepivo. Sastav: površinski Ag virusa influence tri podtipa (A/H1N1, A/H3N2, B). Primjena: za prevenciju gripe

Ispitna karta br.23

Reakcija se provodi za otkrivanje antigena patogena u ispitivanom materijalu dodavanjem imunološkog seruma. U prisutnosti homolognog antigena, antitijela se vežu, stoga nakon dodavanja eritrocita senzibiliziranih antigenom ne dolazi do njihove aglutinacije, što se ocjenjuje kao pozitivan rezultat. Da bi reakcija bila osjetljivija, specifični imunološki serum se dodaje ispitivanom materijalu u minimalnoj količini (2 hemaglutinacijske jedinice). Prvo se odredi titar imunološkog seruma pomoću RNGA. Jedna hemaglutinirajuća jedinica je maksimalno razrjeđenje seruma koje uzrokuje lijepljenje crvenih krvnih stanica.

Metodologija. Dodajte 0,025 ml 1% otopine normalnog seruma kunića u jažice polistirenskih ploča ili aglutinacijskih epruveta i napravite serijska 2-struka razrjeđenja ispitivanog materijala. Zatim se u sve jažice doda 0,025 ml imunološkog seruma, ploča se protrese i ostavi 30 minuta na temperaturi od 37ºC ili 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim se u sve jažice doda 0,025 ml antigenskog dijagnostikuma, promućka i ostavi 2 sata, nakon čega se rezultati uzimaju u obzir.

Pri provođenju ove reakcije kontroli za RNHA dodaje se kontrola specifičnosti imunološkog seruma koja se sastoji od specifičnog antigena, imunološkog seruma (2, 1, 0,5 hemaglutinirajućih jedinica) i suspenzije senzibiliziranih eritrocita.

RTNGA se također koristi za otkrivanje specifičnih protutijela (potpunih i blokirajućih), za što se u ispitivani serum dodaje dozirana količina antigena. Ako sadrži antitijela, onda su ona vezana antigenom, dakle, nakon dodavanja eritrocita senzibiliziranih antitijelima (2. stadij RTNGA), eritrociti se ne lijepe.

Zahvaljujući upotrebi minimalne količine antigena (2 neutralizirajuće doze), reakcija je vrlo osjetljiva. Broj neutralizirajućih doza u pripravku antigena određuje se pomoću RNGA, pri čemu se rade serijska 2-struka razrjeđenja antigena u 1% otopini normalnog seruma kunića i u jažice se dodaje eritrocitni dijagnostikum protutijela. Neutralizirajuća doza antigena smatra se njegovim maksimalnim razrjeđenjem, koje daje potpunu adheziju senzibiliziranih eritrocita.

Prije reakcije ispitni se serumi razrijede u omjeru 1:5-1:10 i inaktiviraju na temperaturi od 56°C 30 minuta. Za adsorpciju hemaglutinina u serum se dodaje 50% suspenzija formaliziranih ili svježe opranih ovčjih eritrocita u omjeru 0,1 ml suspenzije na 1 ml razrijeđenog seruma. Smjesa se protrese i inkubira 30 minuta na 37ºC ili 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se crvene krvne stanice talože centrifugiranjem. Serum možete ostaviti u hladnjaku do sljedećeg dana da se crvena krvna zrnca talože.

Prilikom provođenja pokusa ispitivani materijal se razrijedi u 1% otopini normalnog zečjeg seruma u volumenu od 0,025 ml u jažicama mikrotitarske ploče. Zatim se u svaku jažicu dodaju 2 neutralizirajuće doze antigena u volumenu od 0,025 ml. Ploče se protresu i ostave 30 minuta na 37 °C ili 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim se u sve jažice doda 0,025 ml antitijela eritrocitnog dijagnostikuma. Ploče se protresu i inkubiraju 1,5-2 sata na sobnoj temperaturi, nakon čega se uzimaju u obzir rezultati reakcije. Računovodstvo se može obaviti i sljedeći dan. Titrom ispitivanog seruma smatra se njegovo maksimalno razrjeđenje pri kojem se crvena krvna zrnca ne lijepe.

Eksperiment prate sljedeće vrste kontrole:

1) stabilnost senzibiliziranih eritrocita (eritrociti + 1% otopina normalnog seruma kunića);

2) potpunost smanjenja hemaglutinina u svakom ispitivanom serumu (testni serum u najnižem razrjeđenju + formalizirani eritrociti);

3) ispravnost određivanja minimalne neutralizirajuće doze antigena (2, 1 i 0,5 neutralizirajuće doze antigena + antitijelo eritrocitni dijagnostikum).

Reakcija reverzne neizravne hemaglutinacije (ronga) koristi se za indikaciju bakterijskih i virusnih antigena u ispitivanim materijalima, kao i za brzu dijagnozu niza infekcija.

Za razliku od RNGA, u ovoj reakciji crvene krvne stanice nisu senzibilizirane antigenom, već antitijelima, čija se aglutinacija događa kada se doda antigen.

Crvena krvna zrnca su prethodno fiksirana s formaldehidom ili glutaraldehidom, a zatim su vezana za gama globulin, koji je izoliran iz imunoloških seruma i pročišćen iz drugih serumskih proteina. Vezanje gama globulina na površinu crvenih krvnih stanica događa se uz pomoć kromovog klorida. Da biste to učinili, dodajte 1 volumen imunoglobulina izoliranih iz imunološkog seruma, 1 volumen 50% suspenzije formaliniziranih eritrocita i 1 volumen 0,1-0,2% otopine krom klorida u 8 volumena destilirane vode. Smjesa se ostavi 10-15 minuta na sobnoj temperaturi, zatim se tretiraju crvene krvne stanice kao u reakciji pasivne hemaglutinacije.

Specifičnost dijagnostikuma protutijela provjerava se u reakciji inhibicije pasivne hemaglutinacije homolognim antigenom. Reakcija mora biti inhibirana homolognim antigenom najmanje 16 puta, a ne inhibirana heterolognim. Koristi se kontrola kako bi se osiguralo odsustvo spontane hemaglutinacije.

Pomoću ove reakcije, patogeni se indiciraju u materijalu uzetom iz organa mrtvih ljudi i životinja, na primjer, iz mozga, slezene i jetre pluća. Pripremite 10% suspenziju ovih organa u izotoničnoj otopini natrijeva klorida, centrifugirajte ih 30-60 minuta na 10 000 okretaja u minuti i upotrijebite supernatant kao antigen.

Metodologija. Pripremite dvostruka razrjeđenja ispitivanog materijala (antigena) u stabilizirajućoj otopini. Dodajte 1 kap svakog razrjeđenja antigena u 3 susjedne jažice mikroploče (reakcija zauzima 3 paralelna reda jažica). Dodajte 1 kap stabilizirajuće otopine u svaku jažicu prvog reda, 1 kap homolognog imunološkog seruma razrijeđenog 1:10 u jažice drugog reda, 1 kap heterolognog imunološkog seruma u treći red. Drugi i treći red služe kao kontrole za specifičnost reakcije. Smjesa se ostavi 20 minuta na sobnoj temperaturi.

Dodajte 1 kap 1% suspenzije senzibiliziranih eritrocita (dijagnostikum eritrocitnih antitijela) u sve jažice i dobro protresite ploče. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir nakon 30-40 minuta. U prisustvu specifičnog antigena, hemaglutinacija se opaža u prvom i trećem redu (s heterolognim serumom), a nema je u drugom redu, gdje je antigen prethodno neutraliziran homolognim serumom.

Reakcija je popraćena kontrolama senzibiliziranih eritrocita za spontanu aglutinaciju.

Reverzna reakcija inhibicije neizravne hemaglutinacije (RTONGA) omogućuje određivanje prisutnosti protutijela u serumima ljudi i životinja.

Metodologija. Serumi se razrijede 10 puta s izotoničnom otopinom natrijevog klorida, zagrijavaju 20 minuta na temperaturi od 65 °C kako bi se uništili nespecifični inhibitori, a zatim se pripreme dvostruka razrjeđenja seruma u stabilizirajućoj otopini i radnoj dozi antigen koji sadrži 4 aglutinacijske jedinice. Dodajte 1 kap svakog razrjeđenja seruma u jažice mikropanela i u njih dodajte 1 kap antigena čije razrjeđenje odgovara radnoj dozi. Nakon 20 minuta kontakta komponenti smjese na sobnoj temperaturi, dodajte 1 kap dijagnostikuma eritrocitnih antitijela u sve jažice i dobro protresite. Nakon 1,5-2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, rezultati reakcije uzimaju se u obzir za hemaglutinaciju. Titar seruma je njegovo najveće razrjeđenje, koje potpuno inhibira reakciju hemaglutinacije s četiri jedinice aglutinirajućeg antigena.

Reakcija je popraćena kontrolama senzibiliziranih eritrocita za spontanu aglutinaciju u prisutnosti: a) stabilizirajuće otopine; b) normalni antigen (iz materijala koji ne sadrži virus); c) ispitni serum. Prednost reakcije je njezina svestranost i mogućnost korištenja za otkrivanje različitih antigena.

Procjena rezultata hemaglutinacije. Rezultati RNGA, RONGA i RTONGA uzimaju se u obzir prema stupnju aglutinacije eritrocita: (++++) – potpuna aglutinacija; (+++) – manje potpuna aglutinacija; (++) – djelomična aglutinacija; (+) – tragovi aglutinacije; (–) – odsustvo aglutinacije.

Reakcija se smatra pozitivnom ako je aglutinacija potpuna (++++) ili gotovo potpuna (+++), dijagnostikum ne daje spontanu aglutinaciju u prisutnosti svake komponente reakcije, a kontrola specifičnosti antigen ili antitijelo je pozitivno.