Mentalna retardacija s krhkom prognozom kromosoma x. Fragile X sindrom: uzroci, dijagnoza, liječenje

Q99.2 Lomljivi X kromosom

Epidemiologija

Martin-Bellov sindrom prilično je česta bolest: na 1000 muškaraca ima 0,3-1,0 ljudi koji pate od ove bolesti, a na 1000 žena - 0,2-0,6. Štoviše, djeca s Martin-Bellovim sindromom rađaju se na svim kontinentima jednakom učestalošću. Očito, nacionalnost, boja kože, oblik očiju, životni uvjeti i dobrobit ljudi ne utječu na pojavu bolesti. Učestalost njegove pojave usporediva je samo s učestalošću Downovog sindroma (1 bolest na 600-800 novorođenčadi). Petina muškaraca nositelja promijenjenog gena je zdrava, nema kliničkih ili genetskih abnormalnosti, ostali imaju znakove mentalne retardacije od blažih do težih oblika. Među nositeljima je nešto više od trećine oboljelih.

Fragilni X sindrom pogađa otprilike 1 od 2500-4000 muškaraca i 1 od 7000-8000 žena. Procjenjuje se da prevalencija nositelja bolesti među ženama doseže 1 na 130-250 osoba; Prevalencija kliconoša među muškarcima procjenjuje se na 1 u 250-800.

Uzroci Martin-Bellovog sindroma

Martin-Bellov sindrom se razvija zbog potpunog ili djelomičnog prestanka proizvodnje određenog proteina u tijelu. To se događa zbog nedostatka odgovora gena tipa FMR1, lokaliziranog na X kromosomu. Mutacija nastaje kao rezultat preuređivanja strukture gena iz nestabilnih strukturnih varijanti stanja gena (alela), a ne od samog početka. Bolest se prenosi samo muškom linijom, a muškarac ne mora nužno biti bolestan. Muški nositelji prenose gen svojim kćerima nepromijenjen, tako da mentalna retardacija kod njih nije očita. Daljnjim prijenosom gena s majke na djecu dolazi do mutacije gena i pojave se svi znakovi karakteristični za ovu bolest.

Faktori rizika

Patogeneza

Patogeneza Martin-Bell sindroma temelji se na mutacijama u genskom aparatu, koje dovode do blokiranja proizvodnje proteina FMR, proteina vitalnog za tijelo, posebno u neuronima, a prisutan je u različitim tkivima. Istraživanja pokazuju da su FMR proteini izravno uključeni u procese regulacije translacije koji se odvijaju u moždanom tkivu. Nedostatak ovog proteina ili njegova ograničena proizvodnja u tijelu dovodi do mentalne retardacije.

U patogenezi bolesti hipermetilacija gena smatra se ključnim poremećajem, ali još uvijek nije moguće definitivno identificirati mehanizam razvoja ovog poremećaja.

Istodobno je otkrivena i lokusna heterogenost patologije koja je povezana s polialelizmom, kao i polilokus. Utvrđena je prisutnost alelnih varijanti u razvoju bolesti, koje su uzrokovane postojanjem točkastih mutacija, kao i destrukcijom gena tipa FMRL.

Također, kod bolesnika se otkrivaju 2 fragilna tripleta osjetljiva na folnu kiselinu smještena u 300 kb, kao i 1,5-2 milijuna bp. iz krhkog tripleta koji sadrži gen FMR1. Mehanizam mutacija koje se javljaju u genima FRAXE, kao i FRAXF (oni su identificirani u gore navedenim krhkim trojkama), korelira s mehanizmom poremećaja u sindromu Martina Bella. Ovaj mehanizam određen je širenjem GCC i također CGG ponavljanja, u kojima dolazi do metilacije takozvanih CpG otoka. Osim klasičnog oblika patologije, postoje i 2 rijetke vrste koje se razlikuju zbog ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (u muškoj i ženskoj mejozi).

Otkriveno je da u klasičnom obliku sindroma pacijentu nedostaje poseban nukleocitoplazmatski protein tipa FMR1, koji obavlja funkciju vezanja različitih mRNA. Osim toga, ovaj protein potiče stvaranje kompleksa koji pomaže u provođenju translacijskih procesa unutar ribosoma.

Simptomi Martin-Bellovog sindroma

Kako prepoznati bolest kod djece? Koji su prvi znakovi? U prvim mjesecima djetetova života simptom Martin-Bell se ne može prepoznati, osim što se ponekad opaža smanjenje mišićnog tonusa. Nakon godinu dana klinička slika bolesti je očitija: dijete počinje kasno hodati i govoriti, ponekad je govor potpuno odsutan. Hiperaktivan je, nasumično maše rukama, boji se gužve i buke, tvrdoglav je, ima nagle ispade bijesa, emocionalnu nestabilnost, epileptične napadaje, ne uspostavlja kontakt očima. Kod bolesnika s Martin-Bellovim sindromom bolest se otkriva i po izgledu: stršeće i velike uši, teško čelo, izduženo lice, izbočena brada, škiljavost, široke ruke i stopala. Također ih karakteriziraju endokrini poremećaji: često visoka težina, pretilost, kod muškaraca veliki testisi, rani pubertet.

Među pacijentima s Martin-Bellovim sindromom razina inteligencije uvelike varira: od blage mentalne retardacije do teških slučajeva. Ako normalna osoba ima prosječni kvocijent inteligencije (IQ) 100, a genij 130, onda je za osobe podložne bolesti on 35-70.

Svi klinički simptomi patologije mogu se karakterizirati trijadom glavnih manifestacija:

• mentalna retardacija (IQ je 35-50);
• dismorfofobija (primjećuju se stršeće uši, kao i prognatizam);
• makroorhidizam, koji se manifestira nakon puberteta.

U otprilike 80% bolesnika također se otkrije prolaps bikuspidalnog zaliska.

Ali u isto vrijeme, puni oblik sindroma manifestira se u samo 60% svih pacijenata. Kod 10% se otkrije samo mentalna retardacija, dok se kod ostalih bolest razvija s različitom kombinacijom simptoma.

Među prvim znakovima bolesti, koji se pojavljuju u ranoj dobi:

• bolesno dijete ima značajnu mentalnu retardaciju u usporedbi s razvojem drugih vršnjaka;
• poremećaji pažnje i koncentracije;
• jaka tvrdoglavost;
• djeca počinju hodati i govoriti prilično kasno;
• uočava se hiperaktivnost i poremećaji u razvoju govora;
• vrlo jaki i nekontrolirani napadi ljutnje;
• može se razviti mutizam - ovo je potpuni nedostatak govora kod djeteta;
• beba osjeća socijalnu anksioznost i sposobna je paničariti zbog glasne buke ili bilo kojeg drugog jakog zvuka;
• dijete nekontrolirano i kaotično maše rukama;
• uočava se plašljivost, dijete se boji biti na prepunim mjestima;
• pojava raznih opsesija, nestabilno emocionalno stanje;
• Beba možda nerado uspostavlja kontakt očima s ljudima.

U odraslih se opažaju sljedeći simptomi patologije:

• specifičan izgled: izduženo lice s teškim čelom, velikim stršećim ušima, jako stršećom bradom;
• ravna stopala, otitis media i strabizam;
• pubertet se javlja prilično rano;
• može se razviti pretilost;
• Često se kod sindroma Martina Bella uočavaju nedostaci u razvoju srca;
• kod muškaraca postoji povećanje testisa;
• zglobovi postaju vrlo mobilni;
• težina i visina naglo se povećavaju.

Dijagnoza Martin-Bellovog sindroma

Da biste dijagnosticirali sindrom Martina Bella, morate kontaktirati kvalificiranog genetičara. Dijagnoza se postavlja nakon što se provedu specifični genetski testovi koji identificiraju defektni kromosom.

Analize

U ranom stadiju razvoja bolesti koristi se citogenetička metoda u kojoj se od bolesnika uzima fragment staničnog materijala kojemu se zatim dodaje folna kiselina kako bi se izazvale promjene na kromosomima. Nakon određenog vremena identificira se područje kromosoma gdje se opaža vidljivo stanjivanje - to je znak prisutnosti fragilnog X sindroma.

Ali ova analiza nije prikladna za dijagnozu u kasnijim stadijima bolesti, jer je njezina točnost smanjena zbog raširene uporabe multivitamina koji sadrže folnu kiselinu.

Integrirana dijagnoza Martin-Bellovog sindroma je molekularno-genetski pregled, koji se sastoji od određivanja broja tzv. trinukleotidnih ponavljanja u genu.

Instrumentalna dijagnostika

Vrlo specifična instrumentalna dijagnostička metoda je PCR (lančana reakcija polimeraze), koja omogućuje proučavanje strukture aminokiselinskih ostataka sadržanih u X kromosomu i time utvrđivanje prisutnosti Martin Bellovog sindroma.

Postoji i zasebna, još specifičnija metoda za dijagnosticiranje patologije - kombinacija PCR-a i detekcije pomoću kapilarne elektroforeze. Ova metoda je vrlo precizna i otkriva kromosomsku patologiju kod pacijentica s primarnim oblikom zatajenja jajnika, kao i ataksični sindrom.

Prisutnost defekta može se utvrditi nakon dijagnostike pomoću EEG-a. Bolesnici s ovom bolešću pokazuju sličnu bioelektričnu moždanu aktivnost.

Diferencijalna dijagnoza

Diferencirane metode koje pomažu u sumnji na sindrom uključuju:

• klinički - 97,5% bolesnika ima očite znakove mentalne retardacije (umjerene ili teške); 62% ima stršeće velike uši; 68,4% ima veliku izbočenu bradu i čelo; 68,4% dječaka ima povećane testise, 41,4% ima govorne karakteristike (ritam govora je neujednačen, glasnoća nekontrolirana i sl.);
• citogeni - krv se ispituje za kulturu limfocita, broj stanica s krhkim X kromosomom određuje se na 100 proučavanih stanica;
• elektroencefalografija - bilježe se promjene u električnim impulsima mozga specifične za Martin-Bellov sindrom.

Liječenje Martin-Bellovog sindroma

U liječenju odraslih bolesnika koriste se antidepresivi s psihostimulansima. Proces medikamentozne terapije je pod stalnim nadzorom psihologa i psihijatra. Osim toga, privatne klinike provode postupke mikroinjektiranja lijekova kao što su Cerebrolysin (ili njegovi derivati), kao i citomedini (kao što su Solcoseryl ili Lidaza).

S razvojem ataksičnog sindroma koriste se lijekovi koji razrjeđuju krv, kao i nootropici. Osim toga, propisane su mješavine aminokiselina i angioprotektori. Ženama s primarnim zatajenjem jajnika propisano je korektivno liječenje biljnim lijekovima i estrogenima.

U liječenju se također koriste antagonisti glutaminskih receptora.

Tradicionalno liječenje Martin-Bellovog sindroma je korištenje lijekova koji utječu na simptome bolesti, ali ne i na njezin uzrok. Ova terapija sastoji se od propisivanja antidepresiva, antipsihotika i psihostimulansa. Nisu svi lijekovi indicirani za uporabu u djece, tako da je popis lijekova prilično ograničen. Antipsihotici koji se mogu koristiti nakon 3 godine (najranija dob za njihovo propisivanje) su haloperidol u kapima i tabletama, klorpromazin u otopini, periciazin u kapima. Dakle, doza haloperidola za djecu izračunava se ovisno o tjelesnoj težini. Za odrasle se doza propisuje pojedinačno. Uzima se oralno, počinje s 0,5-5 mg 2-3 puta dnevno, zatim se doza postupno povećava na 10-15 mg. Kada dođe do poboljšanja, prijeći na nižu dozu kako bi se održalo postignuto stanje. Za psihomotornu agitaciju propisuje se 5-10 mg intramuskularno ili intravenozno, moguće je nekoliko ponavljanja nakon 30-40 minuta. Dnevna doza ne smije biti veća od 100 mg. Moguće su nuspojave u vidu mučnine, povraćanja, grčenja mišića, povišenog krvnog tlaka, aritmije itd. Starije osobe trebaju poduzeti posebne mjere opreza jer... Zabilježeni su slučajevi iznenadnog srčanog zastoja, a moguća je i tardivna diskinezija (pojava nevoljnih pokreta).

Antidepresivi pojačavaju aktivnost moždanih struktura, ublažavaju depresivno raspoloženje, napetost i podižu raspoloženje. Ovi lijekovi, koji se preporučuju za upotrebu od 5-8 godina s Martin-Bellovim sindromom, uključuju klomipromin, sertralin, fluoksegin, fluvoksamin. Dakle, fluoksetin se uzima oralno 1-2 puta tijekom obroka (po mogućnosti u prvoj polovici dana), počevši od 20 mg dnevno, povećavajući do 80 mg ako je potrebno. Starijim osobama se ne preporučuje uzimanje doze veće od 60 mg. Tijek liječenja određuje liječnik, ali ne više od 5 tjedana.

Moguće nuspojave: vrtoglavica, tjeskoba, tinitus, smanjen apetit, tahikardija, edem itd. Potreban je oprez pri propisivanju starijim osobama, s kardiovaskularnim bolestima i šećernom bolešću.

Psihostimulansi su psihotropni lijekovi koji se koriste za poboljšanje percepcije vanjskih podražaja: izoštravaju sluh, reakcije i vid.

Diazepam se propisuje kao sedativ za neuroze, anksioznost, epileptičke napadaje i konvulzije. Uzima se oralno, intravenski, intramuskularno, rektalno (u rektum). Propisuje se pojedinačno, ovisno o težini bolesti, s najmanjim dozama od 5-10 mg, dnevno - 5-20 mg. Trajanje liječenja je 2-3 mjeseca. Za djecu se doza izračunava uzimajući u obzir tjelesnu težinu i individualne karakteristike. Nuspojave uključuju letargiju, apatiju, pospanost, mučninu, zatvor. Opasno je kombinirati s alkoholom, moguća je ovisnost o drogi.

U liječenju Martin-Bellovog sindroma zabilježeni su slučajevi poboljšanja primjenom lijekova napravljenih na bazi materijala životinjskog podrijetla (mozga): Cerebrolysate, Cerebrolysin, Cerebrolysate-M. Glavne komponente ovih lijekova su peptidi koji potiču proizvodnju proteina u neuronima, čime se nadoknađuje protein koji nedostaje. Cerebrolysin se primjenjuje u struji od 5-10 ml, tijek liječenja sastoji se od 20-30 injekcija. Za djecu, lijek se propisuje od dobi od godinu dana, primjenjuje se intramuskularno svaki dan, 1-2 ml tijekom mjesec dana. Mogući su ponovljeni termini. Nuspojave u obliku groznice, kontraindicirane u trudnica.

Bilo je pokušaja da se bolest liječi folnom kiselinom, ali se poboljšao samo bihevioralni aspekt (smanjila se razina agresije i hiperaktivnosti, poboljšao se govor), a na intelektualnoj razini ništa se nije promijenilo. Za poboljšanje stanja bolesti propisane su folna kiselina i fizioterapijske metode, indicirana je logopedska, pedagoška i socijalna korekcija.

Pripravci litija također se smatraju učinkovitima jer pomažu poboljšati pacijentovu prilagodbu u društvenom okruženju, kao i kognitivnu aktivnost. Osim toga, reguliraju i njegovo ponašanje u društvu.

Korištenje biljaka za Martin-Bellov sindrom moguće je kao antidepresiv. Biljke koje pomažu ublažiti stres, tjeskobu i poboljšati san uključuju valerijanu, paprenu metvicu, majčinu dušicu, gospinu travu i kamilicu. Infuzije se pripremaju na sljedeći način: za 1 čajnu žličicu suhih biljaka trebat će vam čaša kipuće vode, infuzije se infundiraju najmanje 20 minuta, uzimaju se uglavnom navečer prije spavanja ili popodne. Dobar dodatak njima bila bi žlica meda.

Fizioterapeutski tretman

Kako bi se uklonile neurološke manifestacije, provode se posebni fizioterapeutski postupci, kao što su vježbe u bazenu, opuštanje mišića i akupunktura.

Kirurško liječenje

Metode plastične kirurgije također se smatraju važnom fazom liječenja - operacije koje pomažu poboljšati izgled pacijenta. Izvodi se plastična kirurgija udova i ušiju, te genitalija. Provodi se i korekcija ginekomastije s epispadijom, a ujedno i drugih nedostataka u izgledu.

Prevencija

Jedini način prevencije bolesti je prenatalni probir trudnica. Postoje posebni pregledi koji omogućuju određivanje prisutnosti patologije u ranoj fazi, nakon čega se preporučuje prekid trudnoće. Kao alternativa koristi se IVF, koji može pomoći osigurati da dijete može naslijediti zdrav X kromosom.

Javlja se kod 1 od otprilike 4000 muškaraca (dječaka) i 1 od 6000 do 8000 djevojčica, bez obzira na rasno ili etničko podrijetlo. Iz generacije u generaciju gomilaju se genetske mutacije i to, očito, postaje problem za čovječanstvo.

Znakovi i simptomi fragilnog X sindroma.

Djeca i odrasli s fragilnim X sindromom imaju niz mentalnih i fizičkih znakova i simptoma koji se kreću od blagih do teških. Kod muškaraca su promjene izraženije. Uobičajeni psihijatrijski simptomi uključuju:

Neki stupanj intelektualnog oštećenja ili problemi u obrazovnom učenju (škola), osobito s matematikom; poremećaj pažnje; kašnjenje govora; anksioznost, depresija, sramežljivost; ograničene socijalne vještine. Problemi u ponašanju kao što su poteškoće s koncentracijom i česti napadi bijesa; Autistično ponašanje, kao što su ponavljajući pokreti, radnje ili riječi; Kašnjenja u učenju ponašanja – potrebno je mnogo vremena da se nauči sjediti, hodati i govoriti; Problemi s govorom; Anksioznost i nestabilnost raspoloženja; Osjetljivost na svjetlost, zvuk, dodir i okolinu; U teškim slučajevima, klinika shizofrenije.

Bolesnici s krhkim X mogu imati fizičke znakove razvojnog poremećaja koji postaju očitiji s godinama: velika glava; Dugo, usko lice; Velike uši; Konveksno čelo i brada; Pretjerano fleksibilni zglobovi (osobito prstiju); Dječaci imaju povećane testise koji nakon puberteta postaju još veći. Kod djevojčica su fizički znakovi sindroma fragilnog X manje izraženi. Njihove intelektualne sposobnosti pate u 1/3-1/2 slučajeva ove patologije.

Drugi zdravstveni problemi uzrokovani Martin-Bellovim sindromom.

Većina djece s fragilnim X sindromom nema ozbiljnih zdravstvenih problema i obično žive normalan životni vijek. Oko 15 posto dječaka i oko 5 posto djevojčica s fragilnim X sindromom ima napadaje, koji se lako kontroliraju lijekovima protiv napadaja. Djeca sa sindromom fragilnog X često imaju kronične infekcije unutarnjeg uha. Također je moguće otkriti šumove na srcu, koji su često uzrokovani prolapsom mitralnog zaliska. Ova srčana mana nije opasna po život i u većini slučajeva ne zahtijeva liječenje.

Uzroci genetske patologije - fragilni X sindrom.

Fragilni X sindrom povezan je s abnormalnošću jednog gena - mjesto Xq27.3. Godine 1991. otkriveno je da se gen nazvan FMR-1 nalazi na X kromosomu. Svaka osoba ima 23 para kromosoma, odnosno 46 pojedinačnih kromosoma. Par spolnih kromosoma (X i Y) određuje spol osobe, žene imaju dva X kromosoma, a muškarci jedan X kromosom i jedan Y kromosom. Upravo zbog toga što žene imaju 2 slična kromosoma, težina bolesti je manja, nedostajuću funkciju jednog nadomješta drugi. Iznimka može biti mogućnost postojanja 2 neispravna X kromosoma, ali ta vjerojatnost teži nuli. Kod muškaraca, jedan kromosom X s mutiranim genom uzrokuje sindrom krhkog X. Takve se mutacije nazivaju genetskim "mucanjem". To znači da se mali dio genetskog materijala (naime sekvenca od 3 nukleinske kiseline CHG) ponavlja previše puta. U zdravih osoba ova dionica se ponavlja od 5 do 40 puta, u bolesnika s Martin-Bellovim sindromom do 200 ili više ponavljanja. Više od 200 ponavljanja naziva se punom mutacijom. Potpune mutacije potpuno onesposobljavaju gen i prestaje se sintetizirati protein za čiju je sintezu odgovoran ovaj lokus. Protein kojim upravlja ovaj gen nalazi se u mnogim vrstama stanica, ali uglavnom u živčanim stanicama. Znanstvenici vjeruju da protein pomaže razvoju mozga i odgovoran je za međusobno povezivanje živčanih stanica. Sindrom je dobio ime po izgledu kromosoma. Mjesto koje sadrži mutirani gen izgleda istanjeno, a krajnji fragment kao da visi o koncu.

Dijagnoza sindroma fragmentiranog X kromosoma i vjerojatnost nasljeđivanja.

Fragilni X sindrom dijagnosticira se vađenjem krvi za testiranje. Uzorak krvi šalje se u genetski laboratorij, a test je prilično dostupan. Analiza se može obaviti odmah nakon rođenja djeteta. Najčešće, u prisutnosti odgovarajuće klinike, genetska potvrda dijagnoze opaža se kod dječaka do 3 godine, a kod djevojčica do 4-5 godina. Djetetu treba postaviti dijagnozu ako ima mentalnu retardaciju, zaostajanje u razvoju ili autizam, fizičke ili bihevioralne znakove i simptome sindroma fragilnog X, obiteljsku povijest sindroma fragilnog X ili druge intelektualne teškoće nepoznatog uzroka. Žene koje planiraju trudnoću trebale bi se podvrgnuti testu na nositeljstvo ako imaju sljedeće faktore: obiteljska povijest sindroma fragilnog X ili poremećaja povezanih s sindromom fragilnog X; obiteljska povijest intelektualnog invaliditeta nepoznatog uzroka; osobna ili obiteljska povijest kašnjenja u razvoju ili autizma; osobna povijest reproduktivnih poremećaja i rane menopauze. Identificirane genetske poremećaje treba raspraviti s genetičarom.

Dijagnoza genetskih poremećaja kod djeteta moguća je tijekom trudnoće, prije rođenja. Prenatalni (amnionski i ljudski korionski) genetski testovi pomoći će odrediti vjerojatnost nasljeđivanja mutacije ili premutacije.

Nasljeđe je složeno; dolazi do nakupljanja broja ponavljanja mutiranog gena. S normalnim brojem ponavljanja lokusa kod roditelja (5-40), broj ponavljanja u djeteta se ne mijenja i vjerojatnost pojave patologije u novorođenčeta praktički je odsutna. Međubrojem ponavljanja (41-58) roditelji prenose sličan ili malo veći broj na svoju djecu, vjerojatnost da se bolest pojavi kod djeteta također nije velika, ali nakupljanje može napredovati iz generacije u generaciju (Shermanov paradoks ), broj ponavljanja može doseći 4000.

Premutacijom se smatra broj ponavljanja gena od 59 do 200; otprilike 1 od 250 žena i 1 od 800 muškaraca ima premutaciju u svom genomu. Od njih samo žene mogu roditi dijete s fragilnim X sindromom. Vjerojatnost prijenosa abnormalnog gena na dijete tijekom svake trudnoće je 50%. U neke djece koja su naslijedila abnormalni gen, ako se broj ponavljanja ne poveća iznad 200, tada se simptomi fragilnog X sindroma ne pojavljuju. Ako se broj ponavljanja povećava i premutacija prelazi u punu mutaciju (više od 200 ponavljanja), tada djeca pate od sindroma fragmentiranog X kromosoma. Otac s premutacijom prenosi je samo na sve svoje kćeri. Dječaci od oca dobivaju Y. Kćeri takvih očeva obično nemaju simptome sindroma fragilnog X, ali su nositeljice premutacije.

Potpuna mutacija: žena s potpunom mutacijom ima približno 50 posto šanse prenijeti je na svoje dijete u svakoj trudnoći. Muškarci s potpunom mutacijom obično su neplodni.

Rizici i zdravstveni problemi kod osoba s premutacijom

U takve djece obično se ne uočavaju jasne manifestacije fragilnog X sindroma, ali su određeni problemi ipak prisutni.

Obrazovni problemi i problemi u ponašanju: inteligencija je normalna, ali postoje blagi poremećaji u ponašanju i odgoju;

Neurološki poremećaji: drhtanje ruku i ataksija (nekoordinacija pokreta) javljaju se u otprilike 30% muškaraca starijih od 50 godina. U žena su poremećaji također mogući u 4-8%, ali u starijoj dobi i manje izraženi;

Oštećena plodnost - postupno opadanje funkcije jajnika i, kao posljedica toga, smanjenje sposobnosti zatrudnjenja uočeno je u 20% žena s premutacijom. One doživljavaju ranu menopauzu do 40. godine.

Liječenje sindroma fragilnog (fragmentiranog, lomljivog) X kromosoma

Nema specifičnog liječenja. Liječenje se provodi prema individualnom planu, počevši od predškolske dobi. Liječenje provode zdravstveni djelatnici i učitelji. Dosljedna i pravovremena korekcija smetnji i poticanje zaostalih funkcija omogućuje djeci da ostvare svoje potencijale. Težište treba biti na razvoju govora, socijalnoj prilagodbi i profesionalnom usmjeravanju te razvoju tjelesnog zdravlja. Lijekovi se koriste simptomatski i poboljšavaju prognozu. Propisuju se antidepresivi, antikonvulzivi, stimulansi i antipsihotici. Istraživači razvijaju lijekove koji nadomještaju proteine ​​koji nedostaju i lijekove koji poboljšavaju međustanične veze.

Ovo je jedan od najčešćih oblika mentalne retardacije nakon Downovog sindroma. Populaciona učestalost 1:2000 - 1:2500 novorođenčadi. Dječaka je 2-3 puta više oboljelih nego djevojčica i oni teže obolijevaju.

Izgled bolesnika nije uvijek specifičan. Karakterizira ga izduženo lice, visoko izbočeno čelo, makro- i dolihocefalija te hipoplazija srednjeg dijela lica. Usne su debele, donja usna je često okrenuta. Karakteriziraju ga makrootija, velike šake i stopala. Tipičan simptom, makroorhizam, javlja se kod adolescenata. Testisi su povećani zbog razvoja vezivnog tkiva. Seksualna aktivnost je minimalna. Primjećuju se simptomi kongenitalne displazije vezivnog tkiva - slabost zglobnih ligamenata, ravna stopala, ponekad deformacija kralježnice itd.

Mentalna retardacija je često umjerena, rijetko teška (10-15%). Većina pacijenata je socijalno prilagođena i može obavljati jednostavan fizički rad. Nositeljice imaju smanjen IQ.

Bolest je uzrokovana mutacijom gena FMR-1 (fragile mental retardation) koji je lokaliziran na dugom kraku kromosoma X (Xq). Patološki gen ima veliki broj trinukleotidnih ponavljanja (TNR) u 5 1 - neprevedenoj regiji ovog gena. Normalan broj ponavljanja je od 6 do 42. Kromosom s 50-200 ponavljanja smatra se premutacijom. U sljedećoj generaciji broj ponavljanja se može povećati do 1000, što dovodi do izražene kliničke slike. Klinička slika ovisi o broju ponavljanja.

Ako je žena naslijedila veliki broj ponavljanja, onda će i ona oboljeti. Ali ovo je rijetkost.

Glavna dijagnostička metoda je kariotipizacija. Limfociti bolesnika uzgajaju se u mediju bez folne kiseline. “Fragile” (“fragile region”) nalazi se u dugom kraku X kromosoma. Izvana nalikuje sekundarnom suženju i satelitu. Kromosom je oštećen u području velikog broja trinukleotidnih ponavljanja.

Molekularno genetička dijagnostika je moguća, a razvijene su i metode prenatalne dijagnostike.

Fosfatni dijabetes (hipofosfatemija)

Tip nasljeđivanja je X-vezano dominantan. Gen je lokaliziran Xp 22.2 - p 22.I.

Hipofosfatemija se može otkriti odmah nakon rođenja, a znakovi rahitisa javljaju se krajem prve - početkom druge godine života, kada djeca prohodaju. Promjene na donjim ekstremitetima su jače izražene: varusna zakrivljenost dugih cjevastih kostiju. Karakterizira ga nizak rast, ograničena pokretljivost velikih zglobova (kuk, koljeno, lakat), dolihocefalija i displazija noktiju. Hod je nesiguran, u teškim slučajevima bolesnici uopće ne mogu hodati. Za razliku od rahitisa uzrokovanog nedostatkom vitamina D, opće stanje nije poremećeno. U žena su skeletne abnormalnosti manje izražene. Rendgenskim snimkama otkrivaju se promjene tipične za rahitis – gruba fibrozna struktura spužvastih kostiju. Razina alkalne fosfataze u krvi je povišena, razina kalcija je normalna. Bolest je uzrokovana smanjenjem reapsorpcije fosfata u bubrežnim tubulima.

Nasljedne bolesti vezane uz X kromosom.

Javlja se kod 1 od otprilike 4000 muškaraca (dječaka) i 1 od 6000 do 8000 djevojčica, bez obzira na rasno ili etničko podrijetlo. Iz generacije u generaciju gomilaju se genetske mutacije i to, očito, postaje problem za čovječanstvo.

Znakovi i simptomi fragilnog X sindroma.

Djeca i odrasli s fragilnim X sindromom imaju niz mentalnih i fizičkih znakova i simptoma koji se kreću od blagih do teških. Kod muškaraca su promjene izraženije. Uobičajeni psihijatrijski simptomi uključuju:

Neki stupanj intelektualnog oštećenja ili problemi u obrazovnom učenju (škola), osobito s matematikom; poremećaj pažnje; kašnjenje govora; anksioznost, depresija, sramežljivost; ograničene socijalne vještine. Problemi u ponašanju kao što su poteškoće s koncentracijom i česti napadi bijesa; Autistično ponašanje, kao što su ponavljajući pokreti, radnje ili riječi; Kašnjenja u učenju ponašanja – potrebno je mnogo vremena da se nauči sjediti, hodati i govoriti; Problemi s govorom; Anksioznost i nestabilnost raspoloženja; Osjetljivost na svjetlost, zvuk, dodir i okolinu; U teškim slučajevima, klinika shizofrenije.

Bolesnici s krhkim X mogu imati fizičke znakove razvojnog poremećaja koji postaju očitiji s godinama: velika glava; Dugo, usko lice; Velike uši; Konveksno čelo i brada; Pretjerano fleksibilni zglobovi (osobito prstiju); Dječaci imaju povećane testise koji nakon puberteta postaju još veći. Kod djevojčica su fizički znakovi sindroma fragilnog X manje izraženi. Njihove intelektualne sposobnosti pate u 1/3-1/2 slučajeva ove patologije.

Drugi zdravstveni problemi uzrokovani Martin-Bellovim sindromom.

Većina djece s fragilnim X sindromom nema ozbiljnih zdravstvenih problema i obično žive normalan životni vijek. Oko 15 posto dječaka i oko 5 posto djevojčica s fragilnim X sindromom ima napadaje, koji se lako kontroliraju lijekovima protiv napadaja. Djeca sa sindromom fragilnog X često imaju kronične infekcije unutarnjeg uha. Također je moguće otkriti šumove na srcu, koji su često uzrokovani prolapsom mitralnog zaliska. Ova srčana mana nije opasna po život i u većini slučajeva ne zahtijeva liječenje.

Uzroci genetske patologije - fragilni X sindrom.

Fragilni X sindrom povezan je s abnormalnošću jednog gena - mjesto Xq27.3. Godine 1991. otkriveno je da se gen nazvan FMR-1 nalazi na X kromosomu. Svaka osoba ima 23 para kromosoma, odnosno 46 pojedinačnih kromosoma. Par spolnih kromosoma (X i Y) određuje spol osobe, žene imaju dva X kromosoma, a muškarci jedan X kromosom i jedan Y kromosom. Upravo zbog toga što žene imaju 2 slična kromosoma, težina bolesti je manja, nedostajuću funkciju jednog nadomješta drugi. Iznimka može biti mogućnost postojanja 2 neispravna X kromosoma, ali ta vjerojatnost teži nuli. Kod muškaraca, jedan kromosom X s mutiranim genom uzrokuje sindrom krhkog X. Takve se mutacije nazivaju genetskim "mucanjem". To znači da se mali dio genetskog materijala (naime sekvenca od 3 nukleinske kiseline CHG) ponavlja previše puta. U zdravih osoba ova dionica se ponavlja od 5 do 40 puta, u bolesnika s Martin-Bellovim sindromom do 200 ili više ponavljanja. Više od 200 ponavljanja naziva se punom mutacijom. Potpune mutacije potpuno onesposobljavaju gen i prestaje se sintetizirati protein za čiju je sintezu odgovoran ovaj lokus. Protein kojim upravlja ovaj gen nalazi se u mnogim vrstama stanica, ali uglavnom u živčanim stanicama. Znanstvenici vjeruju da protein pomaže razvoju mozga i odgovoran je za međusobno povezivanje živčanih stanica. Sindrom je dobio ime po izgledu kromosoma. Mjesto koje sadrži mutirani gen izgleda istanjeno, a krajnji fragment kao da visi o koncu.

Dijagnoza sindroma fragmentiranog X kromosoma i vjerojatnost nasljeđivanja.

Fragilni X sindrom dijagnosticira se vađenjem krvi za testiranje. Uzorak krvi šalje se u genetski laboratorij, a test je prilično dostupan. Analiza se može obaviti odmah nakon rođenja djeteta. Najčešće, u prisutnosti odgovarajuće klinike, genetska potvrda dijagnoze opaža se kod dječaka do 3 godine, a kod djevojčica do 4-5 godina. Djetetu treba postaviti dijagnozu ako ima mentalnu retardaciju, zaostajanje u razvoju ili autizam, fizičke ili bihevioralne znakove i simptome sindroma fragilnog X, obiteljsku povijest sindroma fragilnog X ili druge intelektualne teškoće nepoznatog uzroka. Žene koje planiraju trudnoću trebale bi se podvrgnuti testu na nositeljstvo ako imaju sljedeće faktore: obiteljska povijest sindroma fragilnog X ili poremećaja povezanih s sindromom fragilnog X; obiteljska povijest intelektualnog invaliditeta nepoznatog uzroka; osobna ili obiteljska povijest kašnjenja u razvoju ili autizma; osobna povijest reproduktivnih poremećaja i rane menopauze. Identificirane genetske poremećaje treba raspraviti s genetičarom.

Dijagnoza genetskih poremećaja kod djeteta moguća je tijekom trudnoće, prije rođenja. Prenatalni (amnionski i ljudski korionski) genetski testovi pomoći će odrediti vjerojatnost nasljeđivanja mutacije ili premutacije.

Nasljeđe je složeno; dolazi do nakupljanja broja ponavljanja mutiranog gena. S normalnim brojem ponavljanja lokusa kod roditelja (5-40), broj ponavljanja u djeteta se ne mijenja i vjerojatnost pojave patologije u novorođenčeta praktički je odsutna. Međubrojem ponavljanja (41-58) roditelji prenose sličan ili malo veći broj na svoju djecu, vjerojatnost da se bolest pojavi kod djeteta također nije velika, ali nakupljanje može napredovati iz generacije u generaciju (Shermanov paradoks ), broj ponavljanja može doseći 4000.

Premutacijom se smatra broj ponavljanja gena od 59 do 200; otprilike 1 od 250 žena i 1 od 800 muškaraca ima premutaciju u svom genomu. Od njih samo žene mogu roditi dijete s fragilnim X sindromom. Vjerojatnost prijenosa abnormalnog gena na dijete tijekom svake trudnoće je 50%. U neke djece koja su naslijedila abnormalni gen, ako se broj ponavljanja ne poveća iznad 200, tada se simptomi fragilnog X sindroma ne pojavljuju. Ako se broj ponavljanja povećava i premutacija prelazi u punu mutaciju (više od 200 ponavljanja), tada djeca pate od sindroma fragmentiranog X kromosoma. Otac s premutacijom prenosi je samo na sve svoje kćeri. Dječaci od oca dobivaju Y. Kćeri takvih očeva obično nemaju simptome sindroma fragilnog X, ali su nositeljice premutacije.

Potpuna mutacija: žena s potpunom mutacijom ima približno 50 posto šanse prenijeti je na svoje dijete u svakoj trudnoći. Muškarci s potpunom mutacijom obično su neplodni.

Rizici i zdravstveni problemi kod osoba s premutacijom

U takve djece obično se ne uočavaju jasne manifestacije fragilnog X sindroma, ali su određeni problemi ipak prisutni.

Obrazovni problemi i problemi u ponašanju: inteligencija je normalna, ali postoje blagi poremećaji u ponašanju i odgoju;

Neurološki poremećaji: drhtanje ruku i ataksija (nekoordinacija pokreta) javljaju se u otprilike 30% muškaraca starijih od 50 godina. U žena su poremećaji također mogući u 4-8%, ali u starijoj dobi i manje izraženi;

Oštećena plodnost - postupno opadanje funkcije jajnika i, kao posljedica toga, smanjenje sposobnosti zatrudnjenja uočeno je u 20% žena s premutacijom. One doživljavaju ranu menopauzu do 40. godine.

Liječenje sindroma fragilnog (fragmentiranog, lomljivog) X kromosoma

Nema specifičnog liječenja. Liječenje se provodi prema individualnom planu, počevši od predškolske dobi. Liječenje provode zdravstveni djelatnici i učitelji. Dosljedna i pravovremena korekcija smetnji i poticanje zaostalih funkcija omogućuje djeci da ostvare svoje potencijale. Težište treba biti na razvoju govora, socijalnoj prilagodbi i profesionalnom usmjeravanju te razvoju tjelesnog zdravlja. Lijekovi se koriste simptomatski i poboljšavaju prognozu. Propisuju se antidepresivi, antikonvulzivi, stimulansi i antipsihotici. Istraživači razvijaju lijekove koji nadomještaju proteine ​​koji nedostaju i lijekove koji poboljšavaju međustanične veze.

Molekularna biologija u medicini: znanost daje šansu

Prije pola stoljeća nastala je i počela se ubrzano razvijati molekularna biologija. Biolozi i fizičari (zajednica uobičajena sredinom dvadesetog stoljeća) otkrili su najvažnije stanične procese i osmislili osnovne metode bez kojih je danas nezamisliv rad bilo kojeg biološkog laboratorija. Sada imamo ogroman potencijal za rješavanje svih vrsta problema: razjašnjavanje aspekata podrijetla života, proučavanje međudjelovanja komponenti u živoj stanici i složenih biokemijskih kaskada. Znamo i možemo stvari koje su se prije samo 60 godina činile fantastičnima. A jedan od zadataka koji znanstvenici već mogu pokušati riješiti je borba protiv nasljednih ljudskih bolesti. Neki od njih, kao što je fenilketonurija, uspješno se korigiraju; pristupi liječenju mnogih drugih još nisu pronađeni. Ovaj članak će govoriti o jednoj od tih bolesti - fragilnom X sindromu - i poteškoćama u njegovom proučavanju.

Početkom 20. stoljeća znanstvenici su uočili da mentalna retardacija češće pogađa muškarce. Godine 1934. irski liječnik James Martin i engleska genetičarka Julia Bell prvi su opisali obitelj u kojoj se mentalna retardacija nasljeđivala na spolno povezan način. U ovoj obitelji bilo je 11 muškaraca oligofrena i dvije žene s blagom mentalnom retardacijom. Otkriveni obiteljski oblik bolesti nazvan je Martin-Bellov sindrom. 35 godina kasnije, Herbert Labs, provodeći citogenetsku studiju, identificirao je u kariotipu četiri slaboumna muškarca i tri normalne žene (iz tri generacije jedne obitelji) čudan kromosom X, koji je nazvao kromosom marker: bliže kraju dugog kraka, imao je sekundarno suženje. Laboratoriji su predložili praćenje kromosoma markera u muškim embrijima u obiteljima nepovoljnim za Martin-Bellov sindrom, budući da može signalizirati visok rizik od rođenja kao oligofren (slika 1). Tako su liječnici dobili prvi prenatalni marker sindroma, a njihove pacijentice dobile priliku donijeti informiranu odluku o nastavku trudnoće. Konstrikcija markera lokalizirana je na mjestu Xq27.3.

Slika 1. Herbert Labs razgovara s kolegama o suženju na X kromosomu u Martin-Bell sindromu. Ovdje i ispod su crteži autora članka.

Kasnije su mnogi istraživači promatrali pod mikroskopom X kromosome ne samo sa suženjem, već kao da su slomljeni - s "otkinutim" vrhovima dugih krakova. Mjesto suženja/loma počelo se nazivati ​​lomljivo mjesto (fragile site). Stoga je bolest dobila drugo ime - fragilni X sindrom.

Još jedna zanimljiva značajka ove bolesti je pogoršanje bolesti u svakoj sljedećoj generaciji (genetska anticipacija). Ovaj je fenomen objašnjen tek u zadnjem desetljeću 20. stoljeća, nakon otkrića posebne vrste mutacije - ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja.

Klasificiramo li bolesti prema patogenetskim mehanizmima, tada će prilično veliku skupinu činiti bolesti uzrokovane ponovljenom ekspanzijom. Bit mutacije je sljedeća: u ljudskom genomu postoje kratki dijelovi (na primjer, tripleti nukleotida), koji se obično ponavljaju nekoliko puta, ali iz nekog razloga njihov broj počinje naglo rasti - desetke i stotine puta - i ukupna duljina fragmenta "mucanja" (koji sadrži ponavljanja) može narasti do nekoliko tisuća parova baza (slika 2).

Slika 2. Zamislimo da je naš genom vrlo dugačak tekst, a ekspanzija koja je u tijeku pretvara ga u potpunu besmislicu.

Kasnije se pokazalo da je ekspanzija u osnovi patogeneze ne samo fragilnog X sindroma, već i miotonične distrofije tipa I i II, kao i niza ljudskih neurodegenerativnih bolesti - na primjer, amiotrofične lateralne skleroze i Huntingtonove bolesti. Ukupno je poznato oko 30 bolesti koje karakterizira takva mutacija. Mnoge od ovih patologija povezane su s povećanjem broja ponavljanja (CHG)n, (CAG)n, (GAA)n i drugih.

Uzroci i patogeneza fragilnog X sindroma

Fragile X sindrom je možda najčešći uzrok nasljedne mentalne retardacije nakon Downovog sindroma. Postoji dosta kliničkih manifestacija sindroma i ne promatraju se sve i ne uvijek, ali one glavne - niska razina inteligencije i emocionalnog razvoja, zajedno s nizom fizičkih abnormalnosti - najčešće su prisutne. Ove karakteristike su uočljive već u ranom djetinjstvu.

Uzrok bolesti leži u povećanju broja ponavljanja tripleta CGG u promotorskoj regiji (početnoj točki za početak sinteze mRNA) gena FMR1 (slika 3). Produkt ovog gena je protein FMRP (fragile X mental retardation protein), koji u interakciji s RNA usmjerava složene molekularne kaskade neophodne za normalno formiranje neurona i njihovu sinaptičku plastičnost. Kod zdrave osobe broj ponavljanja varira od 5 do 54. Kada se broj ponavljanja poveća na 55-200, pojavljuje se alel koji se naziva premutant. U populaciji se javlja prilično često: kod jedne od 200–250 osoba. Iako je razina mRNA gena viša od normalne, sadržaj FMRP-a ostaje nepromijenjen ili se čak blago smanjuje. Zašto se to događa još uvijek nije poznato. Može se pretpostaviti da je u to uključena RNA interferencija - proces suzbijanja ekspresije gena (neka faza puta od sekvence nukleotida do konačnog produkta, u ovom slučaju FMRP) pomoću malih RNA.

Slika 3. Struktura gena FMR1 i obrazac njegove ekspresije. 5'-UTR i 3'-UTR su 5' i 3' neprevedene regije gena.

S nešto izraženijom ekspanzijom CGG ponavljanja u bolesnika mogu se otkriti posebne intracelularne inkluzije koje se sastoje od FMR1 mRNA i proteina koji vežu RNA. To je dokaz da mRNA postaje toksična za stanicu. Zanimljivo je da "normalna" mRNA nema toksični učinak čak ni pri vrlo visokim koncentracijama. Većina žena koje su nositelji premutacije, za razliku od muškaraca, nemaju vanjske manifestacije patologije. To je zbog drugog kromosoma X koji u većem ili manjem omjeru stanica kompenzira kvar. Štoviše, postoje dokazi o preferencijalnoj inaktivaciji ("isključivanju") defektnog kromosoma. Ali često takve žene karakteriziraju emocionalni problemi, depresija i fobije.

Inaktivacija jednog od X kromosoma vitalni je proces kompenzacije doze gena koji sprječava udvostručenje ekspresije svih gena X kromosoma kod žena u usporedbi s muškarcima. To jest, u svakoj stanici jedinke bilo kojeg spola, unatoč diploidnom skupu kromosoma, aktivan je samo jedan X kromosom - naslijeđen ili od oca ili od majke. Članci “Tajanstveno putovanje nekodirajuće RNK Xist duž kromosoma X” i “Priče iz života kromosoma X hermafroditnog valjkastog crva” govore o fascinantnim detaljima “gašenja” spolnih kromosoma kod ljudi i crva. . – Ed

I, naravno, čak iu nedostatku vanjskih znakova bolesti, premutant alel se prenosi na potomstvo. U ovom slučaju dolazi do "pojačavanja" ponavljanja - sa svakom oogenezom sve više i više, do nekoliko tisuća "kopija". A to dovodi do činjenice da se premutantni alel pretvara u najmutantniji alel. U ovom slučaju već govorimo o fragilnom X sindromu. Njegova učestalost u populaciji je oko 1:3600–6000. To je jako puno! S tako značajnim povećanjem broja CHG ponavljanja dolazi do epigenetskih promjena: adicija metilnih skupina na citozin CHG tripleta u FMR1 promotorskoj regiji i modifikacije proteina povezanih s DNA-histona. Sve to dovodi do lokalne promjene u gustoći pakiranja DNA – stvaranja kondenziranog, neaktivnog kromatina, nazvanog heterokromatin. Ekspresija gena smještenih u takvoj zoni je potisnuta. Stoga je u slučaju Martin-Bellovog sindroma proizvodnja FMRP proteina oštro smanjena. Štoviše, modifikacije kromatina uzrokuju vizualnu "krhkost" kromosoma u regiji Xq27 - istu onu koju su znanstvenici uočili još sredinom 20. stoljeća. Istina, pošteno treba napomenuti da kod nekoliko posto pacijenata sindrom nije uzrokovan ekspanzijom CGG ponavljanja, već drugim mutacijama gena FMR1.

Dakle, očito, patogenetski mehanizmi fragilnog X sindroma i drugih "ekspanzivnih" bolesti su zajednički: sve ih karakterizira određeni kritični broj trojki, pri kojima gen još uvijek normalno funkcionira. Razlozi samog proširenja nisu sasvim jasni. Do danas su predložene mnoge hipoteze i modeli koji to pokušavaju objasniti, na primjer, poremećajima tijekom replikacije, problemima sa sustavima popravka itd. Međutim, do sada nitko od njih nije našao eksperimentalnu potvrdu.

Zašto je teško dijagnosticirati proširenje i kako se taj problem rješava?

Kao što je već spomenuto, fragilni X sindrom daleko je od jedine bolesti koja se manifestira kao mentalna retardacija. Ali prikupljeno znanje pomoglo je da se razvije prilično detaljna metoda za dijagnosticiranje ovog posebnog sindroma. Moguće je otkriti čak i premutaciju kod ljudi s normalnim fenotipom (s normalnom razinom IQ-a i bez razvojnih anomalija). Ovo je vrlo važno, budući da žene nositeljice imaju visok rizik od rađanja djece s teškim sindromom. Istina, ova tehnika nije bez nedostataka i, nažalost, nema široku primjenu, pa se razvoju molekularnih dijagnostičkih metoda još uvijek pridaje posebno mjesto.

U početku je provedena studija kromosomskog seta pacijenta - kariotipizacija - i kada je otkriveno oštećenje u regiji Xq27.3, postavljena je dijagnoza. To je i danas prva stvar koju genetičari rade, barem u Rusiji. Problem s kariotipizacijom je taj što ova metoda nije dovoljno osjetljiva, a samim time ni vrlo pouzdana. Stoga se sve više koriste suvremene metode za postavljanje dijagnoze. Postoje testni sustavi za DNA dijagnostiku koji se temelje na ključnim metodama molekularne biologije: PCR (slika 4), Southern blot, imunoprecipitacija itd. Omogućuju vam procjenu količine FMRP proteina i njegove mRNA, određivanje broja CGG ponavljanja i razina metilacije citozina u promotoru gena FMR1. To pak pomaže boljem razumijevanju patofiziologije sindroma, jer se rezultati analize mogu korelirati s fenotipom bolesnika i nositelja premutacije.

Slika 4. PCR - lančana reakcija polimerazom, jedna od standardnih metoda molekularne biologije koja se koristi u dijagnostici. Prikazane su glavne komponente bez kojih se reakcija neće odvijati. Predložak DNA je molekula DNA, čiji dio treba višestruko umnožiti (amplificirati). Primeri su oligonukleotidi komplementarni krajevima (na različitim nitima) interesnog područja predloška DNK, kao da ga ograničavaju, i djeluju kao početnica za enzim koji kopira DNK (DNK polimeraza). dNTP - deoksiribonukleozid trifosfati - građevinski materijal za novu molekulu DNA. Pufer – otopina soli koja osigurava potrebne uvjete (pH, ionska jakost); nužno sadrži magnezijevu sol, jer samo u prisutnosti iona Mg2 + Djeluje DNA polimeraza. Ako se sve komponente pomiješaju, stave u uređaj koji se naziva pojačivač (cikler) i pokrene željeni program cikličkog povećanja i snižavanja temperature, tisuće kopija interesnog područja sintetiziraju se na matrici originalnih pojedinačnih molekula DNA. , što će na kraju biti lako proučavati. Ako se zbog nekih mutacija sekvencije koje su inače komplementarne početnicama promijene ili se udaljenost između njih radikalno poveća, PCR produkta jednostavno neće biti.

PCR je glavna dijagnostička metoda. Omogućuje vam da razvijete područje koje sadrži (CHG)n. Provođenjem takve analize moguće je odrediti točnu veličinu ove regije, a time i broj ponavljanja, te na taj način detektirati premutantne ili mutantne alele kod bolesnika. Ali mora se reći da to nije lako postići. Istraživači se suočavaju s brojnim izazovima pri pojačavanju ovih fragmenata. DNK, koja će djelovati kao matrica za sintezu novih molekula, ima karakteristiku koja se zove GC sastav, koja odražava koliko je matrica bogata gvanin-citozin parovima (bogata matrica sadrži približno 60% GC parova). Ako je postotak GC parova visok, tada će molekula biti refraktorna, au nekim fazama PCR-a bit će potrebno provesti dužu denaturaciju. (CHG)n regija sastoji se 100% od GC parova i jasno je da je to vrlo teška matrica.

Sve je dodatno komplicirano činjenicom da takav niz bez napora formira razne sekundarne strukture koje su vrlo termodinamički stabilne: sve vrste ukosnica, G-kvadrupleksa (četiri lanca povezana gvaninima i poduprta jednovalentnim kationom, na primjer K+), i- motivi (strukture koje se sastoje od četiri niti DNA, bogate citozinom, postojane u kiseloj sredini). Proučavanje takvih struktura vrlo je lijep i intrigantan zadatak za biokemičare i biofizičare, ali utvrđivanje veličine (CHG)n-regija ozbiljna je prepreka. Pa, i povrh svega, početnice (oligonukleotidne početnice za DNA polimerazu) mogu takvim sekvencama stvarati dimere, a smjesa molekula pretvara se u jedno termostabilno klupko koje se odmotava! Jasno je da ne možete samo raditi s takvom matricom. Ali! Znanstvenici već nekoliko godina aktivno smišljaju sve više i više modifikacija konvencionalne PCR, koje značajno poboljšavaju rezultat.

Budući da matrica bogata GC-om zahtijeva dužu denaturaciju na višoj temperaturi, ranije se pokušavalo dodatno zagrijati matricu prije PCR-a. Međutim, kao što možete pretpostaviti, to nije riješilo problem. Još u kasnim 90-ima otkrili su da se sinteza DNK prekida u proširenim dijelovima CGG ponavljanja u prisustvu K+, a nešto kasnije su shvatili da su za to krivi ti isti kvadrupleksi. Budući da najčešći PCR pufer sadrži KCl, najočitije rješenje bilo je isključiti ga iz pufera; dalo je neke rezultate, ali ja sam htjela više. Stoga su počeli aktivno smišljati alternativne odbojnike.

PCR se danas često izvodi uz dodatak čistog Tris-HCl kao pufera. Tris je standardna komponenta za pripremu otopina nukleinskih kiselina: jeftin je i njegova svojstva puferiranja su visoka pri pH 7-9, vrijednostima fiziološkim za žive organizme. Magnezijev klorid mora se dodati Trisu u koncentracijama koje ne inhibiraju DNA polimerazu i stoga ne smanjuju prinos određenog proizvoda. Vrlo često se smjesa “poboljšava” raznim tvarima koje mijenjaju svojstva cjelokupnog složenog PCR sustava: DMSO, betain, formamid - oni stabiliziraju denaturiranu DNA i pomažu u snižavanju tališta. Neki koriste modificirane dNTP, osobito 7-deaza-dGTP, i izvještavaju o njegovoj učinkovitosti (Slika 5); ovaj modificirani nukleotid sprječava stvaranje složenih dupleksa.

Slika 5. Poboljšana PCR smjesa prva je stvar potrebna za umnožavanje (CHG)n regije. Crtež autora članka.

Osim komponenti smjese, postoje zanimljive varijacije u temperaturnim ciklusima. Najjednostavnija opcija, koja se često koristi za umnožavanje sekvenci koje nije najteže proći, je PCR s vrućim startom. Razlika između ove modifikacije i standardne PCR je korištenje posebnih antitijela koja sprječavaju aktivaciju polimeraze do postizanja željene temperature, čime se izbjegava nespecifična sinteza. Za rad s izuzetno GC-bogatim matricama (>83%), predložena je PCR varijanta nazvana Slowdown (Touchdown modifikacija): spore stope zagrijavanja i hlađenja, postupno smanjenje temperature žarenja nakon određenog broja ciklusa, dodavanje 7-deaza-dGTP - sve to dovodi do povećanja prinosa ciljnog PCR produkta.

Međutim, ne može se reći da je problem dobivanja količina GC-bogatih fragmenata (kao što je FMR1 promotorska regija) potrebnih za daljnju analizu u potpunosti riješen: članci o ovoj temi pojavljuju se često, ali objavljeni rezultati proturječe jedni drugima; komercijalne tvrtke natječu se u razvoju "čarobnih" kompleta, ali oni mogu biti toliko skupi da ih čak ni uspješni strani laboratoriji ne mogu priuštiti.

Određivanje veličine (CHG)n regije prvi je i vrlo važan korak u proučavanju fragilnog X sindroma, koji, međutim, još uvijek treba optimizirati. Ako naučimo brzo i učinkovito brojati ponavljanja, tada će dijagnostika postati jednostavna i relativno jeftina. Bit će ga moguće provoditi u velikom opsegu, što znači razlikovanje fragilnog X sindroma od mnogih drugih bolesti praćenih mentalnom retardacijom, što je iznimno važno za odabir terapijskih pristupa.

Književnost

1. Lubs H.A. (1969). Marker X kromosoma. Am. J.Hum. Genet. 21(3), 231–244;
2. Budworth H. i McMurrey C.T. (2013). Kratka povijest trostrukih ponavljajućih bolesti. Metode Mol. Biol. 1010, 3–17;
3. Mirkin S.M. (2007). Proširiva DNK ponavljanja i ljudska bolest. Priroda. 447, 932–940;
4. Verkerk A.J., Pieretti M., Sutcliffe J.S., Fu Y.H., Kuhl D.P., Pizzuti A. et al. (1991). Identifikacija gena (FMR1) koji sadrži ponavljanje CGG koje se poklapa s regijom klastera prijelomne točke koja pokazuje varijaciju duljine u fragilnom X sindromu. Ćelija. 65, 905–914;
5. Lin S.L. (2015). mikroRNA i fragilni X sindrom. Adv. Exp. Med. Biol. 888, 107–121;
6. Hoem G., Raske C.R., Garcia-Arocena D., Tassone F., Sanchez E., Ludwig A.L. et al. (2011). Prag duljine ponavljanja CGG-a za patogenezu FMR1 RNA u staničnom modelu za FXTAS. Pjevušiti. Mol. Genet. 20, 2161–2170;
7. Zhao X. i Usdin K. (2015). Bolesti ponovljene ekspanzije: tamna strana popravka DNK. Popravak DNA (Amst.). 32, 96–105.
8. biomolekula: “Tajanstveno putovanje nekodirajuće RNA Xist duž X kromosoma”;
9. biomolekula: “Priče iz života X kromosoma hermafroditnog valjkastog crva”;
10. Saldarriaga W., Tassone F., González-Teshima L.Y., Forero-Forero J.V., Ayala-Zapata S., Hagerman R. (2014.). Fragilni X sindrom. Colomb. Med. (Cali.). 45, 190–198;
11. biomolekula: “Stvarnosti DNK su “anomalije””;
12. Usdin K. i Woodford K. (1995). CGG ponavljanja povezana s nestabilnošću DNA i krhkošću kromosoma stvaraju strukture koje blokiraju sintezu DNA in vitro. Nucleic Acids Res. 23, 4202–4209.