Hlavné ciele molekulárnej štruktúry pod vplyvom. Molekulárne ciele

Článok poskytuje základnú predstavu o tom, ako sa vyrábajú lieky v modernom svete. Zohľadňuje sa história dizajnu brzdy, základné pojmy, pojmy a technológie používané v tejto oblasti. Osobitná pozornosť sa venuje úlohe výpočtovej techniky v tomto znalostne náročnom procese. Opísané sú metódy na vyhľadávanie a overovanie biologických cieľov liečiv, vysokovýkonný skríning, klinické a predklinické procesy testovania liečiv a použitie počítačových algoritmov.

Drag dizajn: história

Priemysel cieleného dizajnu nových liekov, alebo, ako sa tento proces nazýva, sledovanie z angličtiny pre nedostatok rovnako krátkeho a pohodlného ruského termínu, drag design ( liek- liek, dizajn- dizajn, konštrukcia) je relatívne mladá disciplína, no stále nie taká mladá, ako sa bežne verí.

Obrázok 1. Paul Ehrlich, ktorý ako prvý vyslovil hypotézu o existencii chemoreceptorov a ich možnom využití v medicíne.

Americká národná lekárska knižnica

Koncom devätnásteho storočia dosiahla chémia významný stupeň zrelosti. Bola objavená periodická tabuľka, vyvinutá teória chemickej valencie, teória kyselín a zásad a teória aromatických zlúčenín. Tento nepochybný pokrok dal impulz medicíne. Na diferenciálne farbenie biologických tkanív sa v medicíne začali používať nové chemické produkty - syntetické farby, deriváty živíc. V rokoch 1872–1874 v Štrasburgu v laboratóriu slávneho anatóma Wilhelma Waldeera študent medicíny Paul Ehrlich (obr. 1), ktorý študoval selektívne farbenie tkanív, prvýkrát vyslovil hypotézu o existencii chemoreceptorov – špeciálnych tkanivových štruktúr, ktoré špecificky interagujú s chemikáliami, a predpokladali možnosť využitia tohto fenoménu pri liečbe rôznych chorôb. Neskôr, v roku 1905, túto koncepciu rozšíril J. Langley, ktorý navrhol model receptora ako generátora intracelulárnych biologických impulzov, ktorý je aktivovaný agonistami a inaktivovaný antagonistami.

Tento moment možno považovať za zrod chemoterapie a novú revolúciu vo farmakológii a v 20. storočí viedol k nevídaným úspechom v klinickej medicíne. Jeden z najznámejších výdobytkov farmaceutického priemyslu 20. storočia možno právom nazvať penicilínom, antibiotikom, ktoré v roku 1929 objavil Alexander Fleming a následne ho študovali Cheyne a Florey. Penicilín, ktorý pôsobí antibakteriálne, poslúžil ľudstvu počas druhej svetovej vojny nenahraditeľnou službou, keď zachránil životy miliónov ranených.

Mnoho farmaceutických spoločností, ohromených úspechom penicilínu, otvorilo svoje vlastné mikrobiologické divízie a vložilo do nich nádej, že objavia nové antibiotiká a iné lieky. Následné pokroky v biochémii viedli k tomu, že bolo možné teoreticky predpovedať úspešné ciele pre terapeutickú intervenciu, ako aj modifikácie chemických štruktúr liečiv, čím sa získali nové zlúčeniny s novými vlastnosťami. Antibiotikum sulfanilamid teda v dôsledku množstva štúdií dalo vzniknúť celým rodinám hypoglykemických, diuretických a antihypertenzívnych liekov. Dizajn ťahadiel sa dostal na kvalitatívne novú úroveň, keď sa vývoj nových liečivých zlúčenín stal nielen výplodom fantázie chemikov, ale aj výsledkom vedeckého dialógu medzi biológmi a chemikmi.

Nový prelom bol spojený s rozvojom molekulárnej biológie, ktorá umožnila zapojiť do vývoja informácie o genóme, klonovať gény kódujúce terapeuticky dôležité biologické ciele a exprimovať ich proteínové produkty.

Dokončenie projektu „ľudského genómu“, ktorý znamenal začiatok nového tisícročia, v dôsledku ktorého boli prečítané kompletné informácie obsiahnuté v ľudskej DNA, bolo skutočným triumfom odvetvia biologickej vedy nazývanej „genomika“. Genomika poskytuje úplne nový prístup k hľadaniu nových terapeuticky dôležitých cieľov, čo umožňuje ich vyhľadávanie priamo v nukleotidovom texte genómu.

Ľudský genóm obsahuje 12 000 – 14 000 génov kódujúcich vylučované proteíny. V súčasnosti sa vo farmaceutickom priemysle nepoužíva viac ako 500 terčov. Existujú štúdie, ktoré hovoria, že mnohé choroby sú „multifaktoriálne“, to znamená, že sú spôsobené dysfunkciou nie jedného proteínu alebo génu, ale 5–10 vzájomne prepojených proteínov a génov, ktoré ich kódujú. Na základe týchto úvah môžeme konštatovať, že počet sledovaných cieľov by sa mal zvýšiť aspoň 5-krát.

Biochemická klasifikácia v súčasnosti študovaných biologických cieľov a ich číselný pomer sú uvedené na obrázku 2. Je potrebné poznamenať, že najväčší (>60 %) podiel receptorov tvoria membránové receptory spojené s G-proteínom ( GPCR, Receptory spojené s G-proteínom) a celkový predaj liekov zameraných na interakciu s nimi je 65 miliárd dolárov ročne a naďalej rastie.

Základné pojmy

Obrázok 3. Tri typy vplyvu ligandu na bunkovú odpoveď: zvýšenie odozvy ( pozitívny agonista), stálosť odozvy, ale súťaž o väzbu s inými ligandami ( neutrálny agonista) a zníženie odozvy ( antagonista).

Základné pojmy používané pri navrhovaní ťahadiel sú cieľ A liek. Cieľ je makromolekulárna biologická štruktúra, pravdepodobne spojená so špecifickou funkciou, ktorej porušenie vedie k ochoreniu a na ktorú je potrebné urobiť určitý vplyv. Najčastejším cieľom sú receptory a enzýmy. Liečivo je chemická zlúčenina (zvyčajne s nízkou molekulovou hmotnosťou), ktorá špecificky interaguje s cieľom a tak či onak modifikuje bunkovú odpoveď vytvorenú cieľom.

Ak je cieľom receptor, potom liekom bude s najväčšou pravdepodobnosťou jeho ligand, teda zlúčenina, ktorá špecificky interaguje s aktívnym miestom receptora. V neprítomnosti ligandu je receptor charakterizovaný vlastnou úrovňou bunkovej odpovede - takzvanou bazálnou aktivitou.

Na základe typu modifikácie bunkovej odpovede sa ligandy delia do troch skupín (obr. 3):

1. Agonisty zvyšujú bunkovú odozvu.
2. Neutrálne agonisty sa viažu na receptor, ale nemenia bunkovú odpoveď v porovnaní s bazálnymi hladinami.
3. Inverzné agonisty alebo antagonisty znižujú bunkovú odpoveď.

Stupeň interakcie ligandu s cieľom sa meria pomocou afinity alebo afinity. Afinita sa rovná koncentrácii ligandu, pri ktorej je polovica cieľov naviazaná na ligand. Biologickou charakteristikou ligandu je jeho aktivita, to znamená koncentrácia ligandu, pri ktorej sa bunková odpoveď rovná polovici maxima.

Definícia a overenie cieľa

Jednou z najskorších a najdôležitejších fáz návrhu brzdy je výber správneho cieľa, pôsobením na ktorý je možné špecificky regulovať niektoré biochemické procesy, pričom možno neovplyvňuje iné. Ako však už bolo spomenuté, nie je to vždy možné: nie všetky choroby sú výsledkom dysfunkcie iba jedného proteínu alebo génu.

S príchodom postgenomickej éry sa ciele identifikujú pomocou komparatívnych a funkčných genomických metód. Na základe fylogenetickej analýzy sú v ľudskom genóme identifikované gény súvisiace s génmi, ktorých funkcie proteínových produktov sú už známe, a tieto gény možno klonovať na ďalšie štúdium.

Ciele, ktorých funkcie sú len hypoteticky určené, však nemôžu slúžiť ako východisko pre ďalší výskum. Vyžaduje sa viacstupňová experimentálna validácia, v dôsledku ktorej možno špecifickú biologickú funkciu cieľa pochopiť vo vzťahu k fenotypovým prejavom skúmaného ochorenia.

Existuje niekoľko metód na overenie experimentálneho cieľa:

• genómové metódy zahŕňajú potlačenie syntézy cieľa v testovacom systéme získaním génových knockout mutantov (v ktorých cieľový gén jednoducho chýba) alebo použitím RNA antisense sekvencií, ktoré „vypnú“ konkrétny gén;
• ciele môžu byť inaktivované použitím monoklonálnych protilátok alebo ožiarením chromoforom modifikovaného cieľa laserovým žiarením;
• ciele môžu byť inaktivované použitím inhibítorov ligandov s malou molekulou;
• Je tiež možné priamo overiť cieľ stanovením jeho interakcie s konkrétnou zlúčeninou pomocou metódy plazmónovej rezonancie.

Úroveň cieľovej validácie sa zvyšuje s počtom modelových zvierat (špeciálne genetické línie laboratórnych zvierat), u ktorých modifikácia cieľa vedie k požadovanej fenotypovej expresii. Najvyšším stupňom overenia je, samozrejme, preukázanie, že modifikácia cieľa (napr. blokovanie alebo vyradenie receptora alebo inhibícia enzýmu) má za následok klinicky identifikovateľné a reprodukovateľné symptómy u ľudí, ale je to pochopiteľne zriedkavé.

Okrem toho pri výbere cieľa netreba zabúdať na fenomén polymorfizmu – teda na skutočnosť, že gén môže existovať v rôznych izoformách v rôznych populáciách alebo rasách ľudí, čo povedie k rôznym účinkom lieku na rôzne pacientov.

Keď už bol cieľ nájdený a testovaný na platnosť, začína sa priamy výskum, ktorého výsledkom sú početné štruktúry chemických zlúčenín, z ktorých len niektoré sú predurčené stať sa liekmi.

Štúdium všetkých možných ligandov z chemického hľadiska („chemický priestor“) je nemožné: jednoduchý odhad ukazuje, že je možných najmenej 10 40 rôznych ligandov, pričom od vzniku vesmíru uplynulo iba ~ 10 17 sekúnd. Na možnú štruktúru ligandov je preto kladených množstvo obmedzení, čo výrazne zužuje chemický priestor (ponecháva ho však úplne rozsiahly). Najmä na zúženie chemického priestoru sa ukladajú podmienky podobnosti s drogou ( drogovej podobnosti), čo možno v jednoduchom prípade vyjadriť Lipinského pravidlom piatich, podľa ktorého zlúčenina, aby „bola ako“ droga, musí:

• majú menej ako päť donorových atómov vodíkovej väzby;
• majú molekulovú hmotnosť menšiu ako 500;
• majú lipofilitu (log P - distribučný koeficient látky na rozhraní voda-oktanol) menšiu ako 5;
• majú celkovo nie viac ako 10 atómov dusíka a kyslíka (hrubý odhad počtu akceptorov vodíkových väzieb).

Ako východisková sada ligandov testovaných na ich schopnosť viazať sa na cieľ sa zvyčajne používajú takzvané knižnice zlúčenín, buď komerčne dodávané spoločnosťami, ktoré sa na to špecializujú, alebo sú obsiahnuté v arzenáli farmaceutickej spoločnosti, ktorá vyvíja nový liek resp. si ho objednala od tretej strany. Takéto knižnice obsahujú tisíce a milióny zlúčenín. To je, samozrejme, úplne nedostatočné na testovanie všetkých možných možností, ale spravidla sa to nevyžaduje. Cieľom v tejto fáze výskumu je identifikovať zlúčeniny, ktoré po ďalšej úprave, optimalizácii a testovaní môžu poskytnúť „kandidátsku“ zlúčeninu určenú na testovanie na zvieratách (predklinické štúdie) a na ľuďoch (klinické štúdie).

Tento krok sa vykonáva pomocou vysokovýkonného skríningu ( in vitro) alebo jeho počítač ( in silico) analýza - vysokovýkonné dokovanie.

Kombinatorická chémia a vysokovýkonný skríning

Skríning je optimalizovaný postup, pri ktorom sa testuje veľký počet chemických zlúčenín (>10 000) na afinitu alebo aktivitu vo vzťahu k špeciálnemu testovaciemu (napodobňujúcemu biologický) systém. Na základe výkonu existujú rôzne typy skríningu:

• nízka priepustnosť (10 000–50 000 vzoriek);
• stredná produktivita (50 000–100 000 vzoriek);
• vysoká priepustnosť (100 000–5 000 000+ vzoriek).

Pre skríning ako „priemyselný“ postup sú veľmi dôležité efektívnosť, náklady a čas strávený na operácii. Spravidla sa skríning vykonáva na robotických zariadeniach, ktoré môžu fungovať nepretržite a celoročne (obr. 4).

Obrázok 4. Zariadenie používané na vysokovýkonný skríning. A - Robotická pipeta, ktorá automaticky ukladá vzorky testovaných zlúčenín na platňu so skríningovým systémom v automatickom vysokovýkonnom režime. Typický počet vrúbkov na matrici je v tisícoch. Objem systému v jednej jamke je mikrolitrov. Objem zavedenej vzorky je nanolitre. B - Inštalácia pre vysokovýkonný skríning a čítanie fluorescenčného signálu Mark II Scarina. Pracuje s matricami obsahujúcimi 2048 vybraní (NanoCarrier). Plne automatické (funguje 24 hodín denne). Produktivita - viac ako 100 000 vrtov (vzoriek) za deň.

Princíp skríningu je celkom jednoduchý: robot podľa daného programu pipetuje testované látky (alebo zmes látok) do platní obsahujúcich testovací systém (napríklad imobilizovaný terč alebo špeciálne upravené celé bunky). Navyše na jednej platni môžu byť tisíce „jamiek“ s testovacím systémom a objem takejto jamky môže byť veľmi malý, rovnako ako objem zavedenej vzorky (mikro- alebo dokonca nanolitre).

Potom sa odčítajú údaje z platne, ktoré indikujú, v ktorej jamke bola detegovaná biologická aktivita a v ktorej nie. V závislosti od použitej technológie dokáže detektor čítať rádioaktívny signál, fluorescenciu (ak je systém zostavený s použitím fluorescenčných proteínov), bioluminiscenciu (ak je použitý luciferín-luciferázový systém alebo jeho analógy), polarizáciu žiarenia a mnoho ďalších parametrov.

Skríning zvyčajne znižuje počet testovaných zlúčenín o 3 až 4 rády. Zlúčeniny, u ktorých skríningový proces odhalil aktivitu nad danú hodnotu, sa nazývajú prototypy. Malo by sa však chápať, že takýto „úspech“ je stále veľmi, veľmi ďaleko od konečného vyliečenia. Len tie, ktoré si zachovávajú svoju aktivitu v modelových systémoch a spĺňajú množstvo kritérií, poskytujú prekurzory drog, ktoré sa používajú na ďalší výskum.

Ako už bolo spomenuté, ani knižnice obsahujúce viac ako milión zlúčenín nie sú schopné reprezentovať celý možný chemický priestor ligandov. Preto pri vykonávaní skríningu možno zvoliť dve rôzne stratégie: diverzifikovaný skríning a cielený skríning. Rozdiel medzi nimi spočíva v zložení použitých knižníc zlúčenín: v diverzifikačnej verzii sa používajú čo možno najnepodobnejšie ligandy, aby pokryli čo najväčšiu oblasť chemického priestoru vo fokusovanej verzii; naopak, využívajú knižnice príbuzných zlúčenín získané metódami kombinatorickej chémie, čo umožňuje pri znalosti približnej štruktúry ligandu zvoliť jeho optimálnejší variant. Zdravý rozum diktuje, že vo veľkom projekte na vytvorenie nového lieku by sa mali oba tieto prístupy použiť postupne – najprv diverzifikácia, aby sa identifikovali najrozmanitejšie triedy úspešných zlúčenín, a potom zameraná s cieľom optimalizovať štruktúru týchto zlúčenín a získanie funkčných prototypov.

Ak je pre cieľ známy takzvaný biologický priestor, to znamená akékoľvek charakteristiky ligandov (veľkosť, hydrofóbnosť atď.), ktoré sa naň môžu viazať, potom pri zostavovaní knižnice testovaných zlúčenín sa ligandy, ktoré spadajú do „ priesečník“ biologického a chemického sú vybrané priestory, pretože to zjavne zvyšuje efektivitu postupu.

Prototypové štruktúry získané zo skríningu sú ďalej podrobené rôznym optimalizáciám vykonávaným v modernom výskume, zvyčajne v úzkej spolupráci medzi rôznymi skupinami výskumníkov: molekulárnymi biológmi, farmakológmi, modelármi a medicínskymi chemikmi (obr. 5).

Obrázok 5. Farmakologický cyklus. Skupina molekulárnej biológie je zodpovedná za získavanie mutantných cieľov, farmakologická skupina je zodpovedná za meranie údajov o aktivite a afinite syntetizovaných ligandov na divokých a mutantných cieľoch, modelovacia skupina za vytváranie modelov cieľov, predpovedanie ich mutácií a predpovedanie ligandové štruktúry, skupina medicínskej chémie je určená na syntézu ligandov.

S každým otočením tohto „farmakologického cyklu“ sa prototyp približuje k svojmu predchodcovi a následne ku kandidátovi, ktorý je už testovaný priamo na zvieratách (predklinické testy) a na ľuďoch počas klinických testov.

Úlohou skríningu je teda výrazne znížiť (o niekoľko rádov) vzorku prototypov (obr. 6).

Obrázok 6. Úloha vysokovýkonného skríningu pri vývoji nových liekov. Skríning, či už je laboratórny ( in vitro) alebo počítač ( in silico) je hlavný a na zdroje najnáročnejší postup na výber východiskových štruktúr liečiv (prototypov) z knižníc dostupných zlúčenín. Výstup zo skríningu je často východiskovým bodom pre ďalší proces vývoja lieku.

Klinické výskumy

Medicína je oblasť, v ktorej by ste sa nikdy nemali ponáhľať. Najmä pokiaľ ide o vývoj nových liekov. Stačí pripomenúť príbeh lieku Thalidamid, ktorý bol vyvinutý koncom 50. rokov v Nemecku a ktorého užívanie tehotnými ženami viedlo k narodeniu detí s vrodenými chybami končatín, dokonca k ich úplnej absencii. Tento vedľajší účinok nebol zistený včas počas klinických štúdií z dôvodu nedostatočného testovania.

Preto je v súčasnosti postup testovania liekov pomerne zložitý, drahý a vyžaduje značný čas (2-7 rokov testovania na klinike a od 100 miliónov dolárov na kandidátsku zlúčeninu, cm. ryža. 7).

Obrázok 7. Proces vývoja nového lieku trvá od 5 do 16 rokov. Náklady na klinické testovanie jednej kandidátskej zlúčeniny sú viac ako 100 miliónov USD. Celkové náklady na vývoj, vrátane liekov, ktoré sa nedostanú na trh, často presahujú 1 miliardu dolárov.

Po prvé, ešte pred vstupom na kliniku sa lieky testujú na toxicitu a karcinogenitu a okrem systémov by sa mali vykonať štúdie in vitro aspoň na dvoch druhoch laboratórnych zvierat. Toxické lieky, samozrejme, nevstupujú na kliniku, s výnimkou prípadov, keď sú určené na liečbu obzvlášť závažných ochorení a ešte nemajú menej toxické analógy.

Okrem toho sa lieky podrobujú farmakokinetickým štúdiám, to znamená, že sa testujú na také fyziologické a biochemické vlastnosti, ako je absorpcia, distribúcia, metabolizmus a vylučovanie (v angličtine označené skratkou ADME - Absorpcia, distribúcia, metabolizmus a extrakcia). Biologická dostupnosť je napríklad subcharakteristikou zavedenia liečiva do tela, charakterizujúca stupeň, v akom stráca biologické vlastnosti po zavedení do tela. Inzulín užívaný perorálne (ústami) má teda nízku biologickú dostupnosť, keďže ide o bielkovinu a rozkladá sa žalúdočnými enzýmami. Preto sa inzulín podáva buď subkutánne alebo intramuskulárne. Z rovnakého dôvodu sa často vyvíjajú lieky, ktoré pôsobia podobne ako ich prirodzené prototypy, ale sú nebielkovinovej povahy.

Z právneho hľadiska má proces klinických skúšok nových liekov veľa odtieňov, pretože si vyžadujú obrovské množstvo sprievodnej dokumentácie (celkovo niekoľko tisíc strán), povolení, certifikácií atď. Okrem toho sa mnohé formálne postupy v jednotlivých krajinách značne líšia v dôsledku rozdielnej legislatívy. Preto na vyriešenie týchto početných problémov existujú špeciálne spoločnosti, ktoré prijímajú objednávky od veľkých farmaceutických spoločností na vykonávanie klinických skúšok a ich presmerovanie na konkrétne kliniky, pričom celý proces sprevádzajú kompletnou dokumentáciou a zabezpečujú, aby neboli porušené žiadne formality.

Úloha výpočtovej techniky v dizajne ťahov

V súčasnosti v dizajne ťahačov, ako aj vo väčšine iných oblastí náročných na vedu, úloha výpočtovej techniky stále narastá. Hneď je potrebné poznamenať, že súčasná úroveň vývoja počítačových techník neumožňuje vývoj nového lieku iba pomocou počítačov. Hlavnými výhodami, ktoré v tomto prípade poskytujú výpočtové metódy, je skrátenie času potrebného na uvedenie nového lieku na trh a zníženie nákladov na vývoj.

Hlavné počítačové metódy používané pri návrhu ťahania sú:

• molekulárne modelovanie (MM);
• virtuálne premietanie;
• dizajn nových liekov de novo;
• hodnotenie vlastností „podobných drogám“;
• modelovanie väzby ligand-cieľ.

Metódy MM založené na štruktúre ligandov

Ak nie je nič známe o trojrozmernej štruktúre cieľa (čo sa stáva pomerne často), uchýlia sa k metódam vytvárania nových zlúčenín založených na informáciách o štruktúre už známych ligandov a údajoch o ich aktivite.

Tento prístup je založený na všeobecne akceptovanej paradigme v chémii a biológii, že štruktúra určuje vlastnosti. Na základe analýzy korelácií medzi štruktúrou známych zlúčenín a ich vlastnosťami je možné predpovedať štruktúru novej zlúčeniny, ktorá má požadované vlastnosti (alebo naopak predpovedať vlastnosti pre známu štruktúru). Okrem toho sa tento prístup používa tak pri modifikácii známych štruktúr, aby sa zlepšili ich vlastnosti, ako aj pri hľadaní nových zlúčenín pomocou skríningových knižníc zlúčenín.

Metódy na určenie podobnosti molekúl (alebo metódy odtlačkov prstov) pozostávajú z diskrétneho zohľadnenia určitých vlastností molekuly, nazývaných deskriptory (napríklad počet donorov vodíkových väzieb, počet benzénových kruhov, prítomnosť určitého substituenta v určitá poloha a pod.) a porovnanie výsledného „odtlačku prsta“ s odtlačkom molekuly so známymi vlastnosťami (použitý ako vzorka). Mieru podobnosti vyjadruje Tanimotov koeficient, ktorý sa pohybuje v rozmedzí 0–1. Vysoká podobnosť znamená podobné vlastnosti porovnávaných molekúl a naopak.

Metódy založené na známych súradniciach atómov ligandu sa nazývajú metódy kvantitatívneho vzťahu medzi štruktúrou a aktivitou ( QSAR, Kvantitatívny vzťah medzi štruktúrou a aktivitou). Jednou z najpoužívanejších metód tejto skupiny je metóda porovnávacej analýzy molekulárnych polí ( CoMFA, Porovnávacia analýza molekulárneho poľa). Táto metóda pozostáva z aproximácie trojrozmernej štruktúry ligandu pomocou súboru molekulárnych polí, ktoré samostatne charakterizujú jeho stérické, elektrostatické, donor-akceptorové a iné vlastnosti. Model CoMFA je vytvorený na základe viacnásobnej regresnej analýzy ligandov so známou aktivitou a opisuje ligand, ktorý by sa mal dobre viazať na požadovaný cieľ z hľadiska molekulárnych polí. Výsledný súbor polí hovorí, v ktorom mieste by mal mať ligand objemný substituent a v ktorom by mal mať malý, v ktorom by mal byť polárny a v ktorom by nemal byť, v ktorom by mal byť donorom vodíkovej väzby a v ktorom má byť akceptorom atď.

Model možno použiť v úlohách virtuálneho skríningu knižníc zlúčenín, ktoré v tomto prípade fungujú ako analógy farmakofóru. Hlavnou nevýhodou tejto metódy je, že má vysokú predikčnú schopnosť len pre blízke triedy zlúčenín; pri pokuse predpovedať aktivitu zlúčeniny chemickej povahy inej ako sú ligandy použité na zostavenie modelu, výsledok nemusí byť dostatočne spoľahlivý.

Schéma možného procesu na vytvorenie nového lieku na základe štruktúry ligandu je znázornená na obrázku 8.

Obrázok 8. Príklad molekulárneho modelovania založeného na štruktúre ligandu. Pre cyklický peptid urotenzín II ( dole vľavo) trojrozmerná štruktúra bola stanovená NMR spektroskopiou vodného roztoku ( hore v ľavo). Priestorové usporiadanie aminokyselinových zvyškov motívu TRP-LYS-TYR, ktorý je dôležitý pre biologickú funkciu, sa použilo na konštrukciu farmakofórového modelu ( hore vpravo). V dôsledku virtuálneho skríningu sa našla nová zlúčenina, ktorá vykazuje biologickú aktivitu ( vpravo dole).

Je zrejmé, že spoľahlivosť simulácie, ako aj efektívnosť celého procesu navrhovania nového lieku možno výrazne zvýšiť, ak vezmeme do úvahy údaje nielen o štruktúre ligandov, ale aj o štruktúre cieľový proteín. Metódy, ktoré berú do úvahy tieto údaje, sa súhrnne nazývajú „návrh ťahania založený na štrukturálnych informáciách“ ( SBDD, Dizajn liekov založený na štruktúre).

Metódy MM založené na štruktúre proteínov

Vzhľadom na rastúci potenciál štrukturálnej biológie je čoraz viac možné určiť experimentálnu trojrozmernú štruktúru cieľa, alebo skonštruovať jeho molekulárny model na základe homológie s proteínom, ktorého trojrozmerná štruktúra už bola stanovená.

Najčastejšie používané metódy na určenie trojrozmernej štruktúry biomakromolekúl s vysokým rozlíšením (Často, keď experimentálna štruktúra cieľa stále nie je k dispozícii, sa uchýli k modelovaniu založenému na homológii - metóde, pre ktorú bol model, ktorý vytvára, ukázalo sa, že má dostatočne vysokú kvalitu, ak homológia medzi štruktúrnym templátom a modelovaným proteínom nie je nižšia ako 40 %.

Homologické modelovanie sa obzvlášť často používa pri vývoji liekov zameraných na receptory spojené s G-proteínom, pretože tieto membránové proteíny sa veľmi ťažko kryštalizujú a takéto veľké proteíny ešte nie sú dostupné pre NMR metódu. Pre túto rodinu receptorov je známa štruktúra len jedného proteínu – bovinného rodopsínu, získaného v roku 2000 v Stanforde, ktorý sa používa ako štruktúrny templát vo veľkej väčšine štúdií.

Typicky štúdie založené na štrukturálnych údajoch berú do úvahy aj údaje o mutagenéze na cieli, aby sa určilo, ktoré aminokyselinové zvyšky sú najdôležitejšie pre funkciu proteínu a väzbu ligandu. Táto informácia je obzvlášť cenná pri optimalizácii konštruovaného modelu, ktorý, keďže je len derivátom štruktúry templátového proteínu, nemôže brať do úvahy všetky biologické špecifiká modelovaného objektu.

Trojrozmerná štruktúra terča sa okrem toho, že dokáže vysvetliť molekulárny mechanizmus interakcie ligandu s proteínom, využíva pri úlohách molekulárneho dokovania alebo počítačového modelovania interakcie ligandu s proteínom. Docking využíva ako východiskovú informáciu trojrozmernú štruktúru proteínu (v tomto štádiu vývoja technológie spravidla konformačne nepohyblivý) a štruktúru ligandu, ktorého konformačná pohyblivosť a vzťah s receptorom sa modelujú počas proces dokovania. Výsledkom dokovania je konformácia ligandu, ktorá najlepšie interaguje s väzbovým miestom proteínu, pokiaľ ide o funkciu bodovania dokovania, ktorá aproximuje voľnú energiu väzby ligandu. V skutočnosti v dôsledku mnohých aproximácií hodnotiaca funkcia nie vždy koreluje so zodpovedajúcou experimentálnou väzbovou energiou.

Dokovanie vám umožňuje znížiť náklady a čas vykonaním postupu podobného vysokovýkonnému skríningu na počítačových systémoch. Tento postup sa nazýva virtuálny skríning a jeho hlavnou výhodou je, že pre skutočné farmakologické testy nie je potrebné získať celú knižnicu pozostávajúcu z milióna zlúčenín, ale iba „virtuálne prototypy“. Zvyčajne, aby sa predišlo chybám, skríning a dokovanie sa používajú súčasne, pričom sa navzájom dopĺňajú (obr. 9).

Obrázok 9. Dve možnosti kombinácie vysokovýkonného skríningu a molekulárneho modelovania. Vyššie: sekvenčný iteračný skríning. Každý krok postupu používa relatívne malý súbor ligandov; Na základe výsledkov skríningu je zostavený model, ktorý vysvetľuje vzťah medzi štruktúrou a aktivitou. Model sa používa na výber ďalšej sady ligandov na testovanie. Spodná časť:„jednorazové“ premietanie. V každom kroku sa model zostaví pomocou trénovacej množiny a použije sa na predpovede na testovacej množine.

S nárastom výkonu počítača a nástupom správnejších a fyzikálnejších algoritmov dokovanie lepšie odhadne väzbovú energiu proteínu s ligandom a začne brať do úvahy pohyblivosť proteínových reťazcov a vplyv rozpúšťadla. Nie je však známe, či sa to niekedy podarí virtuálnym premietaním plne nahradiť skutočný biochemický experiment; ak áno, potom to samozrejme vyžaduje kvalitatívne novú úroveň algoritmov, ktoré v súčasnosti nie sú schopné absolútne správne opísať interakciu ligandu s proteínom.

Jedným z javov, ktorý ilustruje nedokonalosť dokovacích algoritmov, je paradox podobnosti. Tento paradox spočíva v tom, že zlúčeniny, ktoré sú štrukturálne veľmi mierne odlišné, môžu mať dramaticky odlišné aktivity a zároveň z hľadiska dokovacích algoritmov byť prakticky nerozoznateľné.

Prototypy liekov je možné získať nielen výberom z už pripravenej databázy zlúčenín. Ak existuje štruktúra cieľa (alebo aspoň trojrozmerný model farmakofóru), je možné skonštruovať ligandy de novo pomocou všeobecných princípov intermolekulárnej interakcie. V tomto prístupe je jeden alebo viac základných molekulárnych fragmentov umiestnených na väzbovom mieste ligandu a ligand sa postupne „zvyšuje“ vo väzbovom mieste, pričom v každom kroku algoritmu prechádza optimalizáciou. Výsledné štruktúry, rovnako ako pri dokovaní, sa hodnotia pomocou empirických skórovacích funkcií.

Obmedzenia používania počítačových metód

Napriek všetkému prísľubu majú počítačové metódy množstvo obmedzení, ktoré treba brať do úvahy, aby sme si správne predstavili možnosti týchto metód.

V prvom rade, hoci ideológia in silico zahŕňa vykonávanie plnohodnotných počítačových experimentov, to znamená experimentov, ktorých výsledky sú hodnotné a spoľahlivé samy o sebe, je nevyhnutné povinné experimentálne overenie získaných výsledkov; Znamená to úzku spoluprácu vedeckých skupín vykonávajúcich počítačový experiment s inými experimentálnymi skupinami (obr. 5).

Navyše, počítačové metódy ešte nie sú schopné zohľadniť celú rôznorodosť účinku lieku na ľudský organizmus, takže tieto metódy nedokážu eliminovať alebo dokonca výrazne obmedziť klinické testovanie, ktoré zaberá väčšinu času pri vývoji nového lieku.

Preto dnes úloha počítačových metód pri navrhovaní brzdy spočíva v urýchlení a znižovaní nákladov na výskum pred klinickými skúškami.

Pohľad na dizajn ťahania

Obrázok 1. Typy molekulárnych cieľov pre pôsobenie liečiva.

Molekulárny cieľ je molekula alebo molekulová zostava, ktorá má špecifické väzbové miesto pre biologicky aktívnu zlúčeninu. Molekulárny cieľ môžu predstavovať membránové proteíny, ktoré rozpoznávajú hormóny alebo neurotransmitery (receptory), ako aj iónové kanály, nukleové kyseliny, molekuly nosiča alebo enzýmy. Ako je možné vidieť na obrázku 2, nie všetky liečivé zlúčeniny pôsobia na receptory. Väčšina liekov sa musí naviazať na molekulárny cieľ, aby vyvolala účinok, existujú však výnimky. Už v prvých štúdiách účinkov liečiv na tkanivá zvierat koncom 19. stor. Ukázalo sa, že väčšina PAS má špecifický účinok v určitých tkanivách, t.j. zlúčenina, ktorá má účinok na jeden typ tkaniva, nemusí mať účinok na iný; rovnaká látka môže mať úplne odlišné účinky na rôzne tkanivá. Napríklad alkaloid pilokarpín, podobne ako neurotransmiter acetylcholín, spôsobuje kontrakciu hladkého svalstva čreva a inhibuje srdcovú frekvenciu. Vzhľadom na tieto javy Samuel Langley (1852-1925) v roku 1878 na základe štúdií účinkov alkaloidov pilokarpín a atropín na slinenie navrhol, že „existujú určité receptorové látky... s ktorými môžu obidve vytvárať zlúčeniny“. Neskôr, v roku 1905, keď študoval účinky nikotínu a kurare na kostrové svaly, zistil, že nikotín spôsobuje kontrakcie pri aplikácii na určité malé oblasti svalov. Langley dospel k záveru, že „receptorová látka“ pre nikotín sa nachádza v týchto miestach a že kurare účinkuje tak, že blokuje interakciu nikotínu s receptorom.

Obrázok 2. Účinnosť v porovnaní s endogénnym agonistom.

Je teda zrejmé, že účinok niektorých zlúčenín nemusí byť spôsobený ani tak vývojom biologickej odpovede na väzbu na molekulárny cieľ, ale skôr prekážkou väzby endogénneho ligandu. Ak vezmeme do úvahy interakciu ligandu a receptora, je možné poznamenať, že v súčasnosti existujúce liečivé zlúčeniny môžu hrať úlohu agonistu aj antagonistu. Na obrázku 3 môžete vidieť podrobnejšiu klasifikáciu ligandov vo vzťahu k účinkom, ktoré spôsobujú. Agonisti sa líšia v sile a smere fyziologickej reakcie, ktorú produkujú. Táto klasifikácia nesúvisí s afinitou ligandov a je založená iba na veľkosti odpovede receptora. Možno teda rozlíšiť nasledujúce triedy agonistov:

o Superagonista – zlúčenina schopná vyvolať silnejšiu fyziologickú odpoveď ako endogénny agonista.

o Úplný agonista – zlúčenina, ktorá vyvoláva rovnakú odozvu ako endogénny agonista (napr. izoprenalín, β-adrenergný agonista).

o Ak je odpoveď nižšia, zlúčenina sa nazýva čiastočný agonista (napríklad aripiprazol je čiastočný agonista dopamínových a serotonínových receptorov).

o Ak má receptor bazálnu (konštitučnú) aktivitu, niektoré látky – inverzné agonisty – ju môžu znižovať. Inverzné agonisty receptora GABAA majú najmä anxiogénne alebo spazmogénne účinky, ale môžu zvyšovať kognitívne schopnosti.

Ak vezmeme do úvahy mechanizmus väzby medzi ligandom a molekulou receptora, je možné vidieť, že špecifickosť a sila väzby je určená štrukturálnymi znakmi oboch zložiek. Dôležitú úlohu zohráva najmä aktívne centrum proteínov - určitá oblasť molekuly proteínu, ktorá sa zvyčajne nachádza v jej vybraní („vrecku“), tvorená radikálmi aminokyselín, ktoré sa zhromažďujú v určitej priestorovej oblasti počas tvorby proteínu. terciárnej štruktúry a sú schopné komplementárne sa viazať na ligand. V lineárnej sekvencii polypeptidového reťazca môžu byť radikály, ktoré tvoria aktívne centrum, umiestnené v značnej vzdialenosti od seba.

Vysoká špecificita väzby proteínu na ligand je zabezpečená komplementaritou štruktúry aktívneho centra proteínu so štruktúrou ligandu. Komplementarita sa týka priestorovej a chemickej zhody interagujúcich molekúl. Ligand musí mať schopnosť vstúpiť a priestorovo sa zhodovať s konformáciou aktívneho miesta. Táto zhoda nemusí byť úplná, ale vďaka konformačnej labilite proteínu je aktívne centrum schopné malých zmien a je „prispôsobené“ ligandu. Okrem toho medzi funkčnými skupinami ligandu a aminokyselinovými radikálmi tvoriacimi aktívne centrum musia vzniknúť väzby, ktoré držia ligand v aktívnom centre. Väzby medzi ligandom a aktívnym centrom proteínu môžu byť buď nekovalentné (iónové, vodíkové, hydrofóbne) alebo kovalentné. Aktívne centrum proteínu je oblasť relatívne izolovaná od prostredia obklopujúceho proteín, tvorená aminokyselinovými zvyškami. V tejto oblasti tvorí každý zvyšok vďaka svojej individuálnej veľkosti a funkčným skupinám „reliéf“ aktívneho centra.

Spojenie takýchto aminokyselín do jedného funkčného komplexu mení reaktivitu ich radikálov, rovnako ako sa mení zvuk hudobného nástroja v súbore. Preto sa aminokyselinové zvyšky, ktoré tvoria aktívne centrum, často nazývajú „súbor“ aminokyselín.

Jedinečné vlastnosti aktívneho centra závisia nielen od chemických vlastností aminokyselín, ktoré ho tvoria, ale aj od ich presnej relatívnej orientácie v priestore. Preto aj menšie poruchy v celkovej konformácii proteínu v dôsledku bodových zmien v jeho primárnej štruktúre alebo podmienkach prostredia môžu viesť k zmenám v chemických a funkčných vlastnostiach radikálov, ktoré tvoria aktívne centrum, narušiť väzbu proteínu. na ligand a jeho funkciu. Pri denaturácii dochádza k deštrukcii aktívneho centra bielkovín a strate ich biologickej aktivity.

Často sa aktívne centrum vytvára tak, že prístup vody k funkčným skupinám jeho radikálov je obmedzený, t.j. sú vytvorené podmienky pre väzbu ligandu na aminokyselinové radikály.

V niektorých prípadoch sa ligand viaže iba na jeden z atómov, ktorý má určitú reaktivitu, napríklad pridanie O2 k železu myoglobínu alebo hemoglobínu. Avšak vlastnosti daného atómu selektívne interagovať s O2 sú určené vlastnosťami radikálov obklopujúcich atóm železa v kompozícii. Hém sa nachádza aj v iných proteínoch, ako sú cytochrómy. Funkcia atómu železa v cytochrómoch je však iná, slúži ako sprostredkovateľ prenosu elektrónov z jednej látky na druhú, pričom železo sa stáva buď dvoj- alebo trojmocným.

Väzbové miesto proteín-ligand sa často nachádza medzi doménami. Napríklad proteolytický enzým trypsín, ktorý sa podieľa na hydrolýze peptidových väzieb potravinových proteínov v čreve, má 2 domény oddelené drážkou. Vnútorný povrch drážky je tvorený aminokyselinovými radikálmi týchto domén, umiestnenými ďaleko od seba v polypeptidovom reťazci (Ser 177, His 40, Asp 85).

Rôzne domény v proteíne sa môžu navzájom pohybovať pri interakcii s ligandom, čo uľahčuje ďalšie fungovanie proteínu. Ako príklad môžeme uvažovať prácu hexokinázy, enzýmu, ktorý katalyzuje prenos fosforového zvyšku z ATP na molekulu glukózy (počas jej fosforylácie). Aktívne miesto hexokinázy sa nachádza v štrbine medzi týmito dvoma doménami. Keď sa hexokináza naviaže na glukózu, domény, ktoré ju obklopujú, sa priblížia k sebe a substrát sa „zachytí“, čo uľahčuje jeho ďalšiu fosforyláciu.

Hlavnou vlastnosťou proteínov, ktorá je základom ich funkcií, je selektivita pripojenia špecifických ligandov na určité časti molekuly proteínu.

Klasifikácia ligandov

· Ligandy môžu byť anorganické (často ióny kovov) a organické látky, nízkomolekulárne a vysokomolekulárne látky;

· existujú ligandy, ktoré po naviazaní na aktívne centrum proteínu menia svoju chemickú štruktúru (zmeny substrátu v aktívnom centre enzýmu);

· existujú ligandy, ktoré sa viažu na proteín iba v čase fungovania (napríklad O 2 transportovaný hemoglobínom), a ligandy, ktoré sú neustále spojené s proteínom a zohrávajú pomocnú úlohu pri fungovaní proteínov (napríklad železo ktorý je súčasťou hemoglobínu).

V prípadoch, keď aminokyselinové zvyšky, ktoré tvoria aktívne centrum, nedokážu zabezpečiť fungovanie daného proteínu, sa na určité oblasti aktívneho centra môžu pripojiť neproteínové molekuly. Aktívne centrum mnohých enzýmov teda obsahuje kovový ión (kofaktor) alebo organickú neproteínovú molekulu (koenzým). Neproteínová časť, pevne spojená s aktívnym centrom proteínu a nevyhnutná pre jeho fungovanie, sa nazýva „prostatická skupina“. Myoglobín, hemoglobín a cytochrómy majú v aktívnom centre protetickú skupinu – hem, obsahujúcu železo.

Spojenie protomérov v oligomérnom proteíne je príkladom interakcie vysokomolekulárnych ligandov. Každý protomér, spojený s inými protomérmi, im slúži ako ligand, rovnako ako oni pre neho.

Niekedy pripojenie ligandu zmení konformáciu proteínu, čo vedie k vytvoreniu väzbového miesta s inými ligandami. Napríklad kalmodulínový proteín po naviazaní na štyri Ca 2+ ióny v špecifických oblastiach získava schopnosť interakcie s určitými enzýmami, čím sa mení ich aktivita.

Dôležitým konceptom v teórii interakcie medzi ligandom a aktívnym miestom biologického cieľa je „komplementarita“. Aktívne miesto enzýmu musí určitým spôsobom zodpovedať ligandu, čo sa odráža v určitých požiadavkách na substrát.

Obrázok 3. Schéma interakcie medzi ligandom a molekulárnym cieľom.

Napríklad sa očakáva, že pre úspešnú interakciu sa veľkosť aktívneho centra a ligandu musí zhodovať (pozri pozíciu 2 na obrázku 3), čo umožňuje zvýšiť špecifickosť interakcie a chrániť aktívne centrum pred zjavne nevhodnými substrátmi. . Súčasne, keď sa objaví komplex „aktívne centrum-ligand“, sú možné nasledujúce typy interakcií:

· van der Waalsove väzby (pozícia 1, obrázok 3), spôsobené fluktuáciami elektrónových oblakov okolo opačne polarizovaných susedných atómov;

· elektrostatické interakcie (pozícia 3, obrázok 3) vznikajúce medzi opačne nabitými skupinami;

· hydrofóbne interakcie (pozícia 4, obrázok 3), spôsobené vzájomnou príťažlivosťou nepolárnych povrchov;

· vodíkové väzby (pozícia 5, obrázok 3) vznikajúce medzi pohyblivým atómom vodíka a elektronegatívnymi atómami fluóru, dusíka alebo kyslíka.

Napriek relatívne nízkej sile opísaných interakcií (v porovnaní s kovalentnými väzbami) netreba podceňovať ich význam, prejavujúci sa zvýšením väzbovej afinity.

Zhrnutím vyššie uvedeného možno poznamenať, že proces väzby ligandu a molekulárneho cieľa je vysoko špecifický proces riadený veľkosťou ligandu aj jeho štruktúrou, čo umožňuje selektivitu interakcie. Je však možná interakcia medzi proteínom a substrátom, ktorá mu nie je vlastná (takzvaná kompetitívna inhibícia), ktorá sa prejavuje väzbou z aktívneho miesta na podobný, ale nie cieľový ligand. Za zmienku stojí, že kompetitívna inhibícia je možná v prirodzených podmienkach (inhibícia enzýmu sukcinátdehydrogenázy malonátom, inhibícia fumaráthydratázy kyselinou pyromellitovou), ako aj umelo pri užívaní liekov (inhibícia monoaminooxidázy iproniazidom, nialamidom, inhibícia dihydropteroátu syntetáza sulfónamidmi - štruktúrne analógy kyseliny para-aminobenzoovej, inhibícia enzýmu konvertujúceho angiotenzín kaptoprilom, enalaprilom).

Je tak možné cielene meniť aktivitu mnohých molekulárnych systémov pomocou syntetických zlúčenín so štruktúrou podobnou prírodným substrátom.

Avšak povrchné pochopenie mechanizmov interakcie medzi ligandmi a molekulárnymi cieľmi môže byť mimoriadne nebezpečné a často vedie k tragickým následkom. Za najznámejší prípad možno považovať tzv. „Tragédia talidomidu“, ktorá mala za následok narodenie tisícok detí s vrodenými deformáciami v dôsledku užívania nedostatočne preštudovanej liečivej zlúčeniny talidomidu tehotnými ženami.

Úvod

Farmakologická aktivita je úplne určená štruktúrou liečivej látky. Z chemickej štruktúry zároveň vyplýva nielen známa sekvencia atómov v molekule, ale aj ich špecifické priestorové usporiadanie. Vývoj farmakologického účinku je často spôsobený konformačnými zmenami spôsobenými vplyvom molekuly liečiva na molekulárny cieľ. Aktivácia alebo inhibícia funkcií receptorov, transmembránových kanálov a enzýmov je riadená ligandami - špecifickými zlúčeninami, ktoré majú určitú afinitu k zodpovedajúcim biologickým štruktúram. Je zrejmé, že intenzita farmakologického účinku je spôsobená komplementaritou interakcie, z ktorej úplnosti vyplýva nielen požadované usporiadanie radikálov, ale aj tvar molekuly, čo sa vysvetľuje potrebou preniknúť do aktívnej látky. stred molekulárneho cieľa.

Tvar molekuly, umiestnenie nabitých a nepolárnych radikálov určuje prienik cez bunkové membrány, BBB a GMB, silu a trvanie účinku, ako aj rýchlosť eliminácie zo systémového krvného obehu.

Vzhľadom na dôležitosť priestorovej štruktúry pre farmaceutickú chémiu je možné poznamenať, že správne zacielenie štruktúry liečivej zlúčeniny môže zlepšiť jej terapeutický profil predĺžením trvania účinku alebo neutralizáciou vedľajších účinkov. Zavedenie hydrofóbnych fragmentov do molekuly, napríklad lineárnych alkylových „kotv“, môže zvýšiť afinitu zlúčeniny k membránam a schopnosť zlúčeniny preniknúť do bunky, čo bolo demonštrované na príklade tzv. "Sukačevove ióny".

Zavedenie „kotvy“ môže tiež pomôcť predĺžiť pôsobenie liečivej zlúčeniny, čo je zabezpečené zvýšeným ukladaním v tukovom tkanive a zníženým metabolizmom v pečeni a obličkách. Azatioprín je proliečivo pre 6-merkaptopurín, nešpecifické cytostatikum. V tele sa azatioprín pomaly metabolizuje na 6-merkaptopurín, čo v konečnom dôsledku vedie k predĺženému účinku.

Modifikácia molekuly sa môže použiť aj na úpravu organoleptických vlastností, napríklad chloramfenikolstearát, ktorý sa v tráviacom trakte hydrolyzuje na chloramfenikol, nemá horkastú chuť, čo umožňuje zachovať pôvodnú farmakologickú aktivitu a zároveň zlepšiť chuťové vlastnosti.

Mnohé lieky používané v súčasnosti na trhu prešli od prvotného konceptu až po konečnú realizáciu dlhú cestu, počas ktorej bolo cieľom zvýšiť cieľovú aktivitu a znížiť frekvenciu a závažnosť nežiaducich účinkov, zvýšiť stabilitu a trvanie účinku. Priestorová štruktúra úplne určuje osud lieku v tele - možnosť jeho väzby na molekulárne ciele, schopnosť „vyhnúť sa“ nežiaducim biotransformáciám a naopak podieľať sa na potrebných transformáciách.

1. Molekulárne ciele biologicky aktívnych látok v tele

Obrázok 1. Typy molekulárnych cieľov pre pôsobenie liečiva.

Molekulárny cieľ je molekula alebo molekulová zostava, ktorá má špecifické väzbové miesto pre biologicky aktívnu zlúčeninu. Molekulárny cieľ môžu predstavovať membránové proteíny, ktoré rozpoznávajú hormóny alebo neurotransmitery (receptory), ako aj iónové kanály, nukleové kyseliny, molekuly nosiča alebo enzýmy. Ako je možné vidieť na obrázku 2, nie všetky liečivé zlúčeniny pôsobia na receptory. Väčšina liekov sa musí naviazať na molekulárny cieľ, aby vyvolala účinok, existujú však výnimky. Už v prvých štúdiách účinkov liečiv na tkanivá zvierat koncom 19. stor. Ukázalo sa, že väčšina PAS má špecifický účinok v určitých tkanivách, t.j. zlúčenina, ktorá má účinok na jeden typ tkaniva, nemusí mať účinok na iný; rovnaká látka môže mať úplne odlišné účinky na rôzne tkanivá. Napríklad alkaloid pilokarpín, podobne ako neurotransmiter acetylcholín, spôsobuje kontrakciu hladkého svalstva čreva a inhibuje srdcovú frekvenciu. Vzhľadom na tieto javy Samuel Langley (1852-1925) v roku 1878 na základe štúdií účinkov alkaloidov pilokarpín a atropín na slinenie navrhol, že „existujú určité receptorové látky... s ktorými môžu obidve vytvárať zlúčeniny“. Neskôr, v roku 1905, keď študoval účinky nikotínu a kurare na kostrové svaly, zistil, že nikotín spôsobuje kontrakcie pri aplikácii na určité malé oblasti svalov. Langley dospel k záveru, že „receptorová látka“ pre nikotín sa nachádza v týchto miestach a že kurare účinkuje tak, že blokuje interakciu nikotínu s receptorom.

Obrázok 2. Účinnosť v porovnaní s endogénnym agonistom.

Je teda zrejmé, že účinok niektorých zlúčenín nemusí byť spôsobený ani tak vývojom biologickej odpovede na väzbu na molekulárny cieľ, ale skôr prekážkou väzby endogénneho ligandu. Ak vezmeme do úvahy interakciu ligandu a receptora, je možné poznamenať, že v súčasnosti existujúce liečivé zlúčeniny môžu hrať úlohu agonistu aj antagonistu. Na obrázku 3 môžete vidieť podrobnejšiu klasifikáciu ligandov vo vzťahu k účinkom, ktoré spôsobujú. Agonisti sa líšia v sile a smere fyziologickej reakcie, ktorú produkujú. Táto klasifikácia nesúvisí s afinitou ligandov a je založená iba na veľkosti odpovede receptora. Možno teda rozlíšiť nasledujúce triedy agonistov:

o Superagonista – zlúčenina schopná vyvolať silnejšiu fyziologickú odpoveď ako endogénny agonista.

o Úplný agonista – zlúčenina, ktorá vyvoláva rovnakú odozvu ako endogénny agonista (napr. izoprenalín, β-adrenergný agonista).

o Ak je odpoveď nižšia, zlúčenina sa nazýva čiastočný agonista (napríklad aripiprazol je čiastočný agonista dopamínových a serotonínových receptorov).

o Ak má receptor bazálnu (konštitučnú) aktivitu, niektoré látky – inverzné agonisty – ju môžu znižovať. Inverzné agonisty receptora GABAA majú najmä anxiogénne alebo spazmogénne účinky, ale môžu zvyšovať kognitívne schopnosti.

Ak vezmeme do úvahy mechanizmus väzby medzi ligandom a molekulou receptora, je možné vidieť, že špecifickosť a sila väzby je určená štrukturálnymi znakmi oboch zložiek. Dôležitú úlohu zohráva najmä aktívne centrum proteínov - určitá oblasť molekuly proteínu, ktorá sa zvyčajne nachádza v jej vybraní („vrecku“), tvorená radikálmi aminokyselín, ktoré sa zhromažďujú v určitej priestorovej oblasti počas tvorby proteínu. terciárnej štruktúry a sú schopné komplementárne sa viazať na ligand. V lineárnej sekvencii polypeptidového reťazca môžu byť radikály, ktoré tvoria aktívne centrum, umiestnené v značnej vzdialenosti od seba.

Vysoká špecificita väzby proteínu na ligand je zabezpečená komplementaritou štruktúry aktívneho centra proteínu so štruktúrou ligandu. Komplementarita sa týka priestorovej a chemickej zhody interagujúcich molekúl. Ligand musí mať schopnosť vstúpiť a priestorovo sa zhodovať s konformáciou aktívneho miesta. Táto zhoda nemusí byť úplná, ale vďaka konformačnej labilite proteínu je aktívne centrum schopné malých zmien a je „prispôsobené“ ligandu. Okrem toho medzi funkčnými skupinami ligandu a aminokyselinovými radikálmi tvoriacimi aktívne centrum musia vzniknúť väzby, ktoré držia ligand v aktívnom centre. Väzby medzi ligandom a aktívnym centrom proteínu môžu byť buď nekovalentné (iónové, vodíkové, hydrofóbne) alebo kovalentné. Aktívne centrum proteínu je oblasť relatívne izolovaná od prostredia obklopujúceho proteín, tvorená aminokyselinovými zvyškami. V tejto oblasti tvorí každý zvyšok vďaka svojej individuálnej veľkosti a funkčným skupinám „reliéf“ aktívneho centra.

Spojenie takýchto aminokyselín do jedného funkčného komplexu mení reaktivitu ich radikálov, rovnako ako sa mení zvuk hudobného nástroja v súbore. Preto sa aminokyselinové zvyšky, ktoré tvoria aktívne centrum, často nazývajú „súbor“ aminokyselín.

Jedinečné vlastnosti aktívneho centra závisia nielen od chemických vlastností aminokyselín, ktoré ho tvoria, ale aj od ich presnej relatívnej orientácie v priestore. Preto aj menšie poruchy v celkovej konformácii proteínu v dôsledku bodových zmien v jeho primárnej štruktúre alebo podmienkach prostredia môžu viesť k zmenám v chemických a funkčných vlastnostiach radikálov, ktoré tvoria aktívne centrum, narušiť väzbu proteínu. na ligand a jeho funkciu. Pri denaturácii dochádza k deštrukcii aktívneho centra bielkovín a strate ich biologickej aktivity.

Často sa aktívne centrum vytvára tak, že prístup vody k funkčným skupinám jeho radikálov je obmedzený, t.j. sú vytvorené podmienky pre väzbu ligandu na aminokyselinové radikály.

V niektorých prípadoch sa ligand viaže iba na jeden z atómov, ktorý má určitú reaktivitu, napríklad pridanie O2 k železu myoglobínu alebo hemoglobínu. Avšak vlastnosti daného atómu selektívne interagovať s O2 sú určené vlastnosťami radikálov obklopujúcich atóm železa v kompozícii. Hém sa nachádza aj v iných proteínoch, ako sú cytochrómy. Funkcia atómu železa v cytochrómoch je však iná, slúži ako sprostredkovateľ prenosu elektrónov z jednej látky na druhú, pričom železo sa stáva buď dvoj- alebo trojmocným.

Väzbové miesto proteín-ligand sa často nachádza medzi doménami. Napríklad proteolytický enzým trypsín, ktorý sa podieľa na hydrolýze peptidových väzieb potravinových proteínov v čreve, má 2 domény oddelené drážkou. Vnútorný povrch drážky je tvorený aminokyselinovými radikálmi týchto domén, umiestnenými ďaleko od seba v polypeptidovom reťazci (Ser 177, His 40, Asp 85).

Rôzne domény v proteíne sa môžu navzájom pohybovať pri interakcii s ligandom, čo uľahčuje ďalšie fungovanie proteínu. Ako príklad môžeme uvažovať prácu hexokinázy, enzýmu, ktorý katalyzuje prenos fosforového zvyšku z ATP na molekulu glukózy (počas jej fosforylácie). Aktívne miesto hexokinázy sa nachádza v štrbine medzi týmito dvoma doménami. Keď sa hexokináza naviaže na glukózu, domény, ktoré ju obklopujú, sa priblížia k sebe a substrát sa „zachytí“, čo uľahčuje jeho ďalšiu fosforyláciu.

Hlavnou vlastnosťou proteínov, ktorá je základom ich funkcií, je selektivita pripojenia špecifických ligandov na určité časti molekuly proteínu.

Klasifikácia ligandov

· Ligandy môžu byť anorganické (často ióny kovov) a organické látky, nízkomolekulárne a vysokomolekulárne látky;

· existujú ligandy, ktoré po naviazaní na aktívne centrum proteínu menia svoju chemickú štruktúru (zmeny substrátu v aktívnom centre enzýmu);

· existujú ligandy, ktoré sa viažu na proteín iba v čase fungovania (napríklad O 2 transportovaný hemoglobínom), a ligandy, ktoré sú neustále spojené s proteínom a zohrávajú pomocnú úlohu pri fungovaní proteínov (napríklad železo ktorý je súčasťou hemoglobínu).

V prípadoch, keď aminokyselinové zvyšky, ktoré tvoria aktívne centrum, nedokážu zabezpečiť fungovanie daného proteínu, sa na určité oblasti aktívneho centra môžu pripojiť neproteínové molekuly. Aktívne centrum mnohých enzýmov teda obsahuje kovový ión (kofaktor) alebo organickú neproteínovú molekulu (koenzým). Neproteínová časť, pevne spojená s aktívnym centrom proteínu a nevyhnutná pre jeho fungovanie, sa nazýva „prostatická skupina“. Myoglobín, hemoglobín a cytochrómy majú v aktívnom centre protetickú skupinu – hem, obsahujúcu železo.

Spojenie protomérov v oligomérnom proteíne je príkladom interakcie vysokomolekulárnych ligandov. Každý protomér, spojený s inými protomérmi, im slúži ako ligand, rovnako ako oni pre neho.

Niekedy pripojenie ligandu zmení konformáciu proteínu, čo vedie k vytvoreniu väzbového miesta s inými ligandami. Napríklad kalmodulínový proteín po naviazaní na štyri Ca 2+ ióny v špecifických oblastiach získava schopnosť interakcie s určitými enzýmami, čím sa mení ich aktivita.

Dôležitým konceptom v teórii interakcie medzi ligandom a aktívnym miestom biologického cieľa je „komplementarita“. Aktívne miesto enzýmu musí určitým spôsobom zodpovedať ligandu, čo sa odráža v určitých požiadavkách na substrát.

Obrázok 3. Schéma interakcie medzi ligandom a molekulárnym cieľom.

Napríklad sa očakáva, že pre úspešnú interakciu sa veľkosť aktívneho centra a ligandu musí zhodovať (pozri pozíciu 2 na obrázku 3), čo umožňuje zvýšiť špecifickosť interakcie a chrániť aktívne centrum pred zjavne nevhodnými substrátmi. . Súčasne, keď sa objaví komplex „aktívne centrum-ligand“, sú možné nasledujúce typy interakcií:

· van der Waalsove väzby (pozícia 1, obrázok 3), spôsobené fluktuáciami elektrónových oblakov okolo opačne polarizovaných susedných atómov;

· elektrostatické interakcie (pozícia 3, obrázok 3) vznikajúce medzi opačne nabitými skupinami;

· hydrofóbne interakcie (pozícia 4, obrázok 3), spôsobené vzájomnou príťažlivosťou nepolárnych povrchov;

· vodíkové väzby (pozícia 5, obrázok 3) vznikajúce medzi pohyblivým atómom vodíka a elektronegatívnymi atómami fluóru, dusíka alebo kyslíka.

Napriek relatívne nízkej sile opísaných interakcií (v porovnaní s kovalentnými väzbami) netreba podceňovať ich význam, prejavujúci sa zvýšením väzbovej afinity.

Zhrnutím vyššie uvedeného možno poznamenať, že proces väzby ligandu a molekulárneho cieľa je vysoko špecifický proces riadený veľkosťou ligandu aj jeho štruktúrou, čo umožňuje selektivitu interakcie. Je však možná interakcia medzi proteínom a substrátom, ktorá mu nie je vlastná (takzvaná kompetitívna inhibícia), ktorá sa prejavuje väzbou z aktívneho miesta na podobný, ale nie cieľový ligand. Za zmienku stojí, že kompetitívna inhibícia je možná v prirodzených podmienkach (inhibícia enzýmu sukcinátdehydrogenázy malonátom, inhibícia fumaráthydratázy kyselinou pyromellitovou), ako aj umelo pri užívaní liekov (inhibícia monoaminooxidázy iproniazidom, nialamidom, inhibícia dihydropteroátu syntetáza sulfónamidmi - štruktúrne analógy kyseliny para-aminobenzoovej, inhibícia enzýmu konvertujúceho angiotenzín kaptoprilom, enalaprilom).

Je tak možné cielene meniť aktivitu mnohých molekulárnych systémov pomocou syntetických zlúčenín so štruktúrou podobnou prírodným substrátom.

Avšak povrchné pochopenie mechanizmov interakcie medzi ligandmi a molekulárnymi cieľmi môže byť mimoriadne nebezpečné a často vedie k tragickým následkom. Za najznámejší prípad možno považovať tzv. „Tragédia talidomidu“, ktorá mala za následok narodenie tisícok detí s vrodenými deformáciami v dôsledku užívania nedostatočne preštudovanej liečivej zlúčeniny talidomidu tehotnými ženami.

2. Optická izoméria

2.1 Všeobecné charakteristiky

Optická izoméria sa pozoruje u látok, ktoré vykazujú optickú aktivitu, to znamená, že sú schopné otáčať rovinne polarizovaný svetelný lúč. Látky, ktoré vychyľujú rovinu polarizácie lúča doprava, sa nazývajú pravotočivé a doľava - ľavotočivé. Aby bola látka opticky aktívna, jedinou podmienkou je, že molekula nesmie mať stred ani rovinu symetrie. V najjednoduchšom prípade je to určené prítomnosťou takzvaného asymetrického (chirálneho) atómu v molekule. Existujú opticky aktívne molekuly bez asymetrického atómu uhlíka, ale nebudeme ich brať do úvahy. Pojem „chirality“ pochádza z anglického slova „chirality“ (z gréckeho ceir – ruka), ktoré navrhol Kelvin na konci 19. storočia.

Obrázok 4. Enantioméry talidomidu.

Talidomid (obrázok 4) je notoricky známy liek proti nespavosti používaný v Európe na sedáciu tehotných žien v rokoch 1956 až 1962, výsledkom čoho je 8 000 až 12 000 000 tisíc detí narodených s deformáciami. Napriek tomu, že mechanizmus účinku R-izoméru zodpovedného za hypnotický účinok nie je známy, dôvod teratogenity S-izoméru je do istej miery jasný - vloženie molekuly S-talidomidu medzi G-C väzby DNA vedie k narušeniu procesu replikácie a následnému abnormálnemu vývoju plodu. Na prvý pohľad nemusí byť dostatočne zrejmé, prečo molekuly s rovnakým atómovým usporiadaním vo svojom zložení majú rôzne biologické účinky, preto si ukážeme nasledujúcu úvahu.

Obrázok 5. Enantioméria ako zrkadlová symetria

Napriek tomu, že molekuly aminokyselín znázornené na obrázku 5 majú identickú sekvenciu atómov, predsa len ide o odlišné látky, čo sa odráža v nemožnosti porovnať ich priestorové modely, čo je spôsobené prítomnosťou štvorstenného centra asymetrie - atóm uhlíka, ktorý má štyri rôzne substituenty.

Je zrejmé, že v tomto prípade môže byť len jedna z molekúl enantioméru ligandom pre aktívne centrum molekulárneho cieľa (obrázok 6), pretože druhá molekula enantioméru nebude interagovať so zodpovedajúcimi väzbovými miestami.

Obrázok 6. Projekcia enantiomérov na rovinu.

Obrovské množstvo molekulárnych štruktúr v ľudskom tele má skutočne afinitu k molekulám s určitou chiralitou. V prírode teda prevládajú aminokyseliny a sacharidy len jednej konfigurácie a tvorba ich antipódov je potlačená. L-aminokyseliny sa prirodzene vyskytujú v ľudskom tele, zatiaľ čo D-aminokyseliny sú rýchlo metabolizované D-oxidázami.

V niektorých prípadoch sa dajú rozlíšiť rôzne enantioméry bez akéhokoľvek vybavenia – keď inak interagujú s asymetrickými receptormi v našom tele.

Pozoruhodným príkladom je aminokyselina leucín: jej pravotočivý izomér je sladký a jej ľavotočivý izomér je horký. Ak sa trochu vzdialime od témy práce v kurze, môžeme tiež dodať, že (+)-enantiomér nootkatónu má 2200-krát intenzívnejšiu horkú grapefruitovú chuť a charakteristickú vôňu ako (-)-enantiomér a prírodný (3S , 3aS, 7aR) izomér vínneho laktónu má o 25 000 000 intenzívnejšiu sladkú vôňu s kokosovým odtieňom ako zodpovedajúci (3R, 3aR, 7aS) izomér.

3.1 Vplyv optickej izomérie na biologickú aktivitu

Fenomén chirality (stereoizoméria) je v biológii taký bežný, že viac ako polovica všetkých liečivých zlúčenín sú chirálne molekuly, to znamená, že majú páry enantiomérov.

Často je jeden z enantiomérov (eutomér) výrazne aktívnejší ako iný, ktorý je slabší alebo nie je vôbec aktívny (distomér). Pomer aktivity eutoméru k aktivite distoméru sa nazýva eudyzmický a je mierou stereoselektivity danej zlúčeniny. Čím vyšší je tento pomer, tým silnejšia je biologická aktivita iba jedného optického izoméru. Toto je obzvlášť dobre viditeľné, keď sa stred optickej asymetrie nachádza v mieste molekuly, ktorá je zodpovedná za jej interakciu s receptorom (tzv. Pfeifferovo pravidlo).

Štúdium aktivity stereoizomérov na izolovaných tkanivách eliminuje vplyv penetrácie a distribúcie a umožňuje vyhodnotiť účinnosť stereoizomérnych látok v ich reakcii s receptorom. Interakcia asymetrickej, pomerne zložitej molekuly liečiva s ešte zložitejšou štruktúrou aktívneho centra receptora, uskutočnená ako kľúčový zámok, je nepochybne určená ich kontaktom v niekoľkých bodoch. V tomto prípade môžu v štruktúrach látky a receptora existovať body spojenia aj body vzájomného odpudzovania. Je zrejmé, že existencia prvého určuje afinitu látky k receptoru. Prítomnosť týchto látok môže ovplyvniť afinitu, pretože vzájomné odpudzovanie niektorých skupín látky a receptora môže prispieť k špecifickej zmene v konformácii receptora.

Ak si predstavíme, že hlavné sily interakcie medzi asymetricky konštruovanou molekulou liečiva a aktívnym miestom receptora (alebo enzýmu) sú sústredené aspoň v troch bodoch, potom dva optické antipódy látky môžu rovnako orientovať iba dva z troch skupiny zúčastňujúce sa procesu vzhľadom na daný povrch.

Rozdielna orientácia tretej skupiny môže najlepšie vysvetliť rozdiel v biologickej aktivite optických izomérov a v závislosti od stupňa účasti tejto skupiny na procese interakcie s receptorom sa vplyv optickej izomérie prejaví vo väčšej miere. alebo v menšom rozsahu.

Ak látka interaguje s receptorom iba v dvoch bodoch, potom nemožno očakávať žiadny rozdiel v biologickej aktivite jej optických izomérov. Ak však tretia skupina v jednom izoméri priestorovo bráni látke v kontakte s receptorom v dvoch ďalších bodoch, potom by v tomto prípade mal existovať aj rozdiel medzi optickými antipódami. Napríklad z dvoch optických izomérov adrenalínu má len jeden všetky tri skupiny orientované tak, že sa môžu kombinovať s príslušnými skupinami receptora. V tomto prípade bude pozorovaná maximálna farmakologická aktivita zodpovedajúca D-(-)-adrenalínu. V L-(+)-adrenalíne je hydroxylová skupina alkoholu orientovaná nesprávne vzhľadom na povrch receptora a táto molekula môže interagovať s receptorom iba v dvoch bodoch. Preto má prírodný D-(-)-adrenalín desaťkrát väčšiu farmakologickú aktivitu ako umelo syntetizovaný L-(+)-izomér.

Biologicky aktívna látka s dvoma asymetrickými centrami má štyri diastereoméry, ako je b-blokátor labetalol. Vo väčšine prípadov bude jeden z týchto enantiomérov účinnejší ako jeho zrkadlový enantiomér v dôsledku lepšieho prispôsobenia receptorovej molekule. Napríklad 5(+)-enantiomér parasympatomimetického liečiva metacholínu je viac ako 250-krát aktívnejší ako R(-)-enantiomér. Ak si predstavíte receptor ako rukavicu, do ktorej sa molekula ligandu musí zmestiť, aby vyvolala účinok, je jasné, prečo sa „ľavoruké“ ligandy budú účinnejšie viazať na „ľavostranný“ receptor ako ich „ľavoruké“ pravotočivé“ enantioméry.

Aktívnejší enantiomér pre jeden typ receptora môže byť menej aktívny pre iný typ receptora, napríklad pre receptory zodpovedné za niektoré nežiaduce účinky. Karvedilol, liek, ktorý interaguje s adrenergnými receptormi, má jedno chirálne centrum, a teda dva enantioméry. Jeden z týchto enantiomérov, 5(-)-izomér, je aktívny β-blokátor. R(+) izomér má 100-krát slabší účinok na receptor. Ketamín je intravenózne anestetikum. Jeho (+)-enantiomér je aktívnejšie a menej toxické anestetikum ako (-)-enantiomér. Napriek tomu sa racemická zmes stále používa ako liek.

Nakoniec, pretože enzýmy sú typicky stereoselektívne, jeden enantiomér má často väčšiu afinitu k enzýmu metabolizujúcemu liečivo ako druhý. V dôsledku toho sa enantiméry môžu značne líšiť v trvaní účinku.

Bohužiaľ, väčšina štúdií klinickej účinnosti a eliminácie liekových zlúčenín u ľudí bola vykonaná skôr s použitím racemických zmesí liekov než ich jednotlivých enantiomérov. V súčasnosti je len asi 45 % chirálnych liečiv používaných na klinike dostupných ako aktívne enantioméry – zvyšok sa predáva len ako racemické zmesi. Výsledkom je, že mnohí pacienti dostávajú dávky látok, ktoré sú z 50 % alebo viac neaktívne alebo dokonca toxické. Vzrástol však záujem na vedeckej aj legislatívnej úrovni o výrobu chirálnych liečiv vo forme ich aktívnych enantiomérov.

Na modernom farmaceutickom trhu Bieloruskej republiky je však prítomných množstvo zlúčenín ako racemáty.

Obrázok 7. S- a R-izoméry ibuprofénu.

Napríklad rozšírené nesteroidné protizápalové liečivo ibuprofén (obrázok 7) je prítomné v zmesi dvoch izomérov, z ktorých jeden ((S)-(+)-ibuprofén) má cieľovú aktivitu a prejavuje sa ako analgetikum, antipyretikum a pôsobí protizápalovo, pričom R-izomér je toxický a môže sa hromadiť v tukových depozitoch vo forme esteru s glycerolom. V tomto smere sa stal komerčne dostupný podobný liek, ktorým je enantiomérne čistý (S)-(+)-ibuprofén, tzv. dexibuprofén. Ďalším výskumom sa zistilo, že ľudské telo obsahuje izomerázu schopnú premeniť neaktívny (R)-(-)-ibuprofén na aktívny (S)-(+)-ibuprofén.

Obrázok 8. R- a S-izoméry naproxénu.

Naproxén, nesteroidné protizápalové liečivo odvodené od kyseliny propiónovej, sa tiež predáva ako racemická zmes, hoci iba S-izomér má terapeutickú aktivitu a R-izomér má výraznú hepatotoxicitu.

S-amlodipín sa používa už viac ako 20 rokov pri liečbe arteriálnej hypertenzie (AH) a anginy pectoris, pričom väčšina liekov obsahujúcich amlodipín je reprezentovaná racemickou zmesou jeho S- a R-enantiomérov. Zistilo sa, že schopnosť blokovať pomalé kanály typu L v bunkách hladkého svalstva ciev, ktorá je základom terapeutického účinku tohto lieku, je vlastná iba jeho S-enantioméru, zatiaľ čo jeho R-enantiomér je v tomto 1000-krát menej aktívny. to znamená, že prakticky nemá takéto vlastnosti. R-izomér zároveň nie je farmakologicky inertný, pretože na rozdiel od S-izoméru je schopný stimulovať syntézu NO endotelovými bunkami mechanizmom závislým od kinínu. Zistilo sa, že nadmerná dilatácia prekapilárno-arteriolárneho spojenia ciev dolných končatín, spôsobená nadmernou tvorbou NO, neutralizuje realizáciu dôležitého fyziologického mechanizmu, ktorý zabraňuje vzniku edému tkanív dolných končatín pri telo je vo vzpriamenej polohe – takzvaný prekapilárny posturálny vazokonstrikčný reflex.

Práve táto okolnosť je základom vedľajších účinkov tradičného racemického amlodipínu vo forme periférneho edému, ktorý sa podľa rôznych údajov vyvíja v závislosti od dávky u 9 – 32 % pacientov, ktorí ho užívajú, často starších ľudí. V porovnávacej randomizovanej štúdii S-amlodipínu a pôvodného racemického amlodipínu vykonanej na Ukrajine bola incidencia edému počas 12-týždňovej liečby vo vyššie uvedených skupinách 1,6 % a 7,8 %, v uvedenom poradí, teda pri liečbe Asomexom (obchodná značka S-amlodipínu, vyrábaného spoločnosťou Actavis Group) znížilo riziko ich výskytu 4,8-krát. Výskyt periférneho edému počas liečby S-amlodipínom v dvoch veľkých štúdiách po uvedení lieku na trh bol len 0,75 % (14 z 1 859 pozorovaných) a 0,84 % (14 z 1 669). Okrem toho sa podľa 4-týždňového pozorovania ukázalo, že antihypertenzná aktivita S-amlodipínu v dávkach 2,5 a 5 mg/deň je ekvivalentná s aktivitou racemátu amlodipínu užívaného v dvojnásobných denných dávkach – 5 a 10 mg.

Niektoré lieky sú však dostupné ako opticky čisté zlúčeniny. Získavajú sa tromi spôsobmi: separáciou racemických zmesí, modifikáciou prírodných opticky aktívnych zlúčenín (medzi ne patria sacharidy, aminokyseliny, terpény, kyselina mliečna a vínna atď.) a priamou syntézou. Ten tiež vyžaduje chirálne zdroje, pretože akékoľvek iné tradičné spôsoby syntézy poskytujú racemát. To je jeden z dôvodov vysokej ceny niektorých liekov a nie je prekvapujúce, že z množstva syntetických chirálnych liekov vyrábaných po celom svete je len malá časť opticky čistá, zvyšok sú racemáty.

Je tiež možné, že každý enantiomér má svoj vlastný špecifický účinok. Levotočivý S-tyroxín (liek levotroid) je teda prirodzený hormón štítnej žľazy. A pravotočivý R-tyroxín („dextroid“) znižuje hladinu cholesterolu v krvi. Niektorí výrobcovia prichádzajú s palindromickými obchodnými názvami pre takéto prípady, napríklad „Darvon“ pre narkotické analgetikum a „Novrad“ pre liek proti kašľu.

Ako už bolo uvedené na príklade aminokyseliny leucínu, človek je chirálny tvor.

A to platí nielen pre jeho vzhľad. Enantiomérne liečivá, ktoré interagujú s chirálnymi molekulami v tele, napríklad s enzýmami, môžu pôsobiť rôznymi spôsobmi. „Správny“ liek zapadne do svojho receptora ako kľúč k zámku a spustí požadovanú biochemickú reakciu. Antiarytmikum S-anaprilín je stokrát silnejší ako R-forma. Antihelmintikum levamizol je aktívne hlavne v S-izoméri, zatiaľ čo jeho R-antipód spôsobuje nevoľnosť, preto bol v istom čase racemický levamizol nahradený jedným z enantiomérov. V 60. rokoch skúšali liečiť parkinsonizmus jedným z prekurzorov adrenalínu v tele – dioxyfenylalanínom (L-DOPA).

Ukázalo sa, že táto látka, ako aj jej príbuzný dopamín a metyldopa, sú účinné len vo forme S-izoméru. Súčasne R-DOPA spôsobuje vážne vedľajšie účinky, vrátane porúch krvi. Spoločnosť Merck vyvinula spôsob výroby antihypertenzívneho liečiva metyldopa, ktorý zahŕňa spontánnu kryštalizáciu iba požadovaného enantioméru zavedením malého zárodku tohto izoméru do roztoku.

Penicilamín (3,3-dimetylcysteín) je pomerne jednoduchý derivát aminokyseliny cysteínu. Táto látka sa používa pri akútnych a chronických otravách meďou, ortuťou, olovom a inými ťažkými kovmi, pretože s iónmi týchto kovov tvorí silné komplexy a tieto komplexy sa odstraňujú obličkami.

Penicilamín sa používa aj pri rôznych formách reumatoidnej artritídy, systémovej sklerodermii av mnohých ďalších prípadoch. V tomto prípade sa používa iba S-forma lieku, pretože R-izomér je toxický a môže viesť k slepote. Nie nadarmo sa na obálke vydania amerického časopisu „Journal of Chemical Education“ z júna 1996 objavila taká nezvyčajná kresba. Názov článku o antipodických liekoch bol nemenej výrečný: „Keď sa molekula pozrie do zrkadla“.

4. Geometrická izoméria

4.1 Všeobecné charakteristiky

Obrázok 9. Cis- a trans-dichlóretén.

farmakológia liečiv izoméria

Stereoizoméry sú látky, ktoré majú rovnaký chemický vzorec, ale ktorých molekuly sa líšia iba vzájomným usporiadaním atómov. Na rozdiel od štruktúrnych izomérov sú v molekulách stereoizomérov povaha a sekvencia chemických väzieb rovnaké. Najdôležitejšími typmi stereomérov sú cis-trans izoméry (E-Z izoméry), enantioméry, diastereoméry a konforméry. Posledný prípad platí pre veľké molekuly, napríklad proteíny, ktoré s rovnakou primárnou štruktúrou môžu mať rôzne konformácie.

Cis-trans izoméria sa týka usporiadania rôznych atómov alebo skupín vzhľadom na výhodnú väzbu, ako je napríklad dvojitá väzba. V cis izoméri sú tieto atómy umiestnené na jednej strane izolovanej väzby a v trans izoméri sú na opačných stranách. Najjednoduchším príkladom cis-trans izomérie sú zlúčeniny ako dichlóretén (obrázok 10). V zložitejších prípadoch sa na opis tohto druhu stereoizomérie používa nomenklatúra navrhnutá UPAK: pre Z-izoméry sú skupiny s najvyššou hmotnosťou na jednej strane väzby a pre E-izoméry sú na rôznych stranách.

4.2 Vplyv geometrickej izomérie na biologickú aktivitu

Obrázok 10. Ilustrácia inhibície rotácie vo vzťahu k peptidovej väzbe v proteínoch.

Cis-trans izoméry môžu byť tiež tvorené enantiomérmi chirálnych zlúčenín. Dôležitým príkladom je peptidová väzba v proteínoch tvorená zvyškami L-aminokyselín. Táto väzba má charakter čiastočnej dvojitej väzby, preto sú atómy hlavného reťazca peptidovej skupiny (-Cb-C?-N-Cb-) umiestnené v rovnakej rovine a skupina môže byť buď v cis alebo trans konformácii ( Obrázok 11).

Aj keď voľná izomerizácia prebieha v nezbalenom polypeptidovom reťazci a peptidové skupiny prijímajú obe konformácie, v natívnom proteíne má iba jedna z 1000 skupín cis konformáciu (zvyšok je v trans konformácii). Trans konformácia peptidových skupín je nastavená počas ich syntézy na ribozómoch a následne je udržiavaná. Ak však peptidová skupina obsahuje prolínový zvyšok (obrázok 12), ktorý je v bežných proteínoch zriedkavý, potom je pomer trans/cis 3/1. To znamená, že v tomto prípade prebieha izomerizácia oveľa rýchlejšie (hoci stále veľmi pomaly, s časovou konštantou okolo 20, pri teplote miestnosti) ako v peptidovej väzbe tvorenej inými aminokyselinovými zvyškami.

Obrázok 11. Molekula L-prolínu

Počas syntézy proteínov proces skladania polypeptidového reťazca za vzniku natívnej konformácie (skladanie) prebieha tisíckrát rýchlejšie ako cis-trans izomerizácia, niekedy sa však vytvorí peptidová skupina v cis konformácii. V tomto prípade sa proces skladania zastaví, kým nedôjde k správnej konformácii, alebo sa zastaví úplne. Stáva sa to naopak, keď aktívna forma proteínu vyžaduje nie trans konformáciu, ktorá vzniká pri syntéze, ale cis konformáciu, potom musíte počkať, kým sa vytvorí. V oboch prípadoch prichádza na pomoc špeciálny enzým - peptidylprolyl izomeráza, ktorý výrazne urýchľuje proces izomerizácie, v dôsledku čoho syntéza takýchto proteínov prebieha bez oneskorenia.

Obrázok 12. Molekula serotonínu

Nedávno sa zistilo, že cis-trans izomerizácia ovplyvňuje nielen štruktúru proteínu, ale takáto zmena štruktúry môže hrať dôležitú úlohu v regulácii biochemických procesov. Jedným z najdôležitejších neurotransmiterov zodpovedných za reguláciu veľkého počtu procesov v rôznych organizmoch - od hlíst až po ľudí - je serotonín (5-hydroxytryptamín, obrázok 13). U ľudí sa 80-90% serotonínu nachádza v špeciálnych bunkách čreva, kde sa používa na reguláciu peristaltiky. Zvyšok serotonínu je syntetizovaný v sérotonergných neurónoch v centrálnom nervovom systéme, kde sa podieľa na regulácii chuti do jedla, spánku, dobrej nálady a agresivity. Okrem toho stimuluje rast buniek, najmä v procese obnovy pečene po poškodení, a reguluje rast a resorpciu kostí. Serotonín sa vyrába aj v rastlinách a hubách, obsahujú ho aj niektoré druhy zeleniny a ovocia.

Rozmanitosť serotonínových regulačných funkcií je spôsobená prítomnosťou rôznych serotonínových receptorov v rôznych bunkách, ktoré tvoria takzvanú superrodinu serotonínových receptorov (5-HT receptory). Nedostatočná alebo nadmerná produkcia sérotonínu vedie k rôznym psychickým poruchám. Takže s nedostatkom serotonínu (alebo defektmi v jeho receptoroch) človek zažíva depresiu. Preto mnohé laboratóriá študujú reguláciu serotonínu, najmä mechanizmy interakcie serotonínu s rôznymi receptormi.

Všetky serotonínové receptory, okrem 5-HT3, fungujú tak, že aktivujú G proteíny, ktoré potom spôsobujú kaskádu biochemických reakcií vedúcich ku konkrétnemu výsledku. Receptor 5-HT3 je jediný, ktorý patrí k typu gatovaných iónových kanálov (jeho najbližším štruktúrnym analógom je nikotínový acetylcholínový receptor). Tento receptor je proteín, ktorý päťkrát prenikne cez bunkovú membránu nervovej bunky, v ktorej sa po naviazaní na serotonín vytvorí pór, ktorý umožňuje prechod katiónov sodíka, draslíka a vápnika. Prechod iónov cez otvorený kanál vedie k excitácii neurónu a vytvoreniu nervového impulzu.

Ako sa však kanál otvára v membráne, nebolo známe. Nedávno sa zistilo, že iniciátorom štrukturálnych preskupení v 5-HT3 receptore je izomerizácia jedného prolínového zvyšku umiestneného na kľúčovom mieste pre tento typ receptora (vrchol cysteínovej slučky). Ak je prolín v trans konformácii, potom je kanál uzavretý. Väzba serotonínu spôsobuje izomerizáciu prolínu a kanál sa otvára. Toto je možno prvýkrát, čo sa experimentálne ukázalo, že prepínanie iónového kanála medzi otvoreným a uzavretým stavom je spôsobené stereoizomerizáciou len jednej jednotky v polypeptidovom reťazci.

Napriek nižšiemu (v porovnaní s optickou izomériou) významu cis-trans izomérie pre farmáciu treba priznať, že stále má svoju niku.

Pozoruhodným príkladom rozdielov vo vlastnostiach biologicky aktívnych zlúčenín v kontexte geometrickej izomérie je kyselina linolová, čo je jednosýtna karboxylová kyselina s dvoma izolovanými väzbami - CH 3 (CH 2) 3 -(CH 2 CH=CH) 2 ( CH2)7COOH.

Obrázok 13. Kyselina linolová.

Kyselina linolová patrí do rodiny omega-6 polynenasýtených mastných kyselín a reguluje vlastnosti bunkových a subcelulárnych membrán v tele. Je pozoruhodné, že iba cis izomér kyseliny linolovej môže telo použiť na syntézu kyseliny arachidónovej, zatiaľ čo trans izoméry sú neaktívne a môžu sa hromadiť v orgánoch a tkanivách. Kyselina linolová je súčasťou mnohých liekov a doplnkov stravy predávaných v Bieloruskej republike. Napríklad kyselina linolová je jednou z hlavných zložiek liekov „Essentiale“ a „Essentiale Forte N“ (Sanofi Aventis), „Essentsikaps“ (MinskInterCaps), „Akulive“ (Lysi HF), „Phosphoglyph“ (Pharmstandard-Leksredstva ) a ďalšie.

Zároveň nie sú trans izoméry mastných kyselín vždy ľahostajné. Začiatkom 90. rokov minulého storočia sa objavilo množstvo publikácií poukazujúcich na súvislosť medzi konzumáciou transmastných kyselín a rizikom vzniku kardiovaskulárnych ochorení. Následne WHO odporučila znížiť spotrebu trans tukov na stopové množstvá, keďže sa objavili informácie potvrdzujúce vplyv trans izomérov mastných kyselín na výskyt rakoviny, cukrovky, Alzheimerovej choroby a iných rovnako nepríjemných ochorení.

Avšak nielen izoméry prírodného pôvodu vykazujú rôzne biologické aktivity. Napríklad cisplatina (cis-, cis-dichlórdiaminplatina(II) je alkylačné cytotoxické liečivo reprezentované, ako už názov napovedá, cis izomérom. Cisplatina má terapeutický účinok tým, že sa viaže na molekulu DNA a vytvára koordinačnú zlúčeninu medzi platinou. atómu a dvoch dusíkatých báz, čo vedie k nemožnosti ďalšieho čítania a reprodukcie dedičnej informácie Štúdia ukázala, že komplex cisplatina-DNA je stabilnejší ako podobný komplex obsahujúci trans-izomér Terapeutický účinok, ktorý, samozrejme, určil uvedenie cis-izoméru na trh. je zrejmé, že nie je možné uvažovať o jedinej zlúčenine bez toho, aby sa jej interakcia s molekulárnym cieľom nezdá byť optimálna.

Pri diskusii o problematike geometrickej izomérie nemožno nespomenúť našich krajanov, ktorí vyvíjajú lieky na báze komplexov paládia (II) s N-substituovanými tetrazolmi (Bieloruská štátna univerzita), čo sú účinné cytostatiká vykazujúce antiproliferatívnu aktivitu v cis- aj a. počet trans izomérov.

Záver

Aby sme to zhrnuli, možno poznamenať, že priestorová štruktúra liečivej zlúčeniny do značnej miery určuje jej farmakologickú aktivitu. Závažnosť biologického účinku a jeho smer závisí od štruktúry ligandu interagujúceho s molekulárnym cieľom.

V súčasnej fáze rozvoja farmaceutického priemyslu sa veľká pozornosť venuje metódam počítačom podporovaného navrhovania liečivých látok, čo je diktované tak ekonomickými faktormi (výrazne sa znižuje čas a náklady na vývoj), ako aj etickými faktormi – existujúcimi algoritmami. umožňujú predpovedať možnú toxicitu testovanej zlúčeniny a predchádzať tragédiám podobným talidomidu.

Podľa môjho názoru je jedným z najpozoruhodnejších aspektov vplyvu priestorovej štruktúry liečivej látky na farmakologickú aktivitu a farmakokinetiku štúdium interakcií ligand-receptor. Štúdium štruktúry biomolekuly a opätovné vytvorenie jej natívnej štruktúry umožňuje získať informácie o aktívnom centre, čo v budúcnosti pri použití dokovania umožňuje presne vybrať štruktúru, ktorá vytvorí optimálny účinok.

Ďalším zaujímavým faktom pre mňa bola existencia deskriptorov molekulovej štruktúry – špeciálnych matematických parametrov, ktoré dokážu zovšeobecniť priestorové usporiadanie atómov na nejakú kvantifikovateľnú hodnotu. Molekulárne deskriptory sa môžu neskôr použiť na zostavenie modelov, ktoré „zahŕňajú“ dostupné informácie týkajúce sa skúmanej zlúčeniny a výsledkom je „získanie“ parametra, ktorý nás zaujíma – farmakologickej aktivity.

Štúdium materiálov pri príprave seminárnej práce bolo veľmi zaujímavé, aj keď náročné, pretože adekvátne pochopenie pôsobenia liečivých látok nie je možné bez preštudovania mechanizmov, ktoré sa podieľajú na ich prieniku do tela. Bolo príjemné dozvedieť sa, že práca na získavaní nových liečivých zlúčenín sa vykonáva nielen abstraktne „v zahraničí“, ale aj vedci z krajín SNŠ, ako aj Bieloruska - najmä Národná akadémia vied republiky. Bieloruska dlhodobo a pomerne úspešne pracuje na probléme molekulárneho dizajnu ligandov pre mikrozomálne oxidačné enzýmy .

Tak či onak, vykonaná práca sa mi zdala užitočná, možno ani nie tak pre môj profesionálny rast ako farmaceuta-predpisujúceho lekára, ale pre vytvorenie širokého rozhľadu a hlbokého pochopenia úlohy farmaceutickej chémie ako vedy. .

Literatúra

1. MedUniver [Elektronický zdroj] / Farmakológia. - Režim prístupu: http://meduniver.com/Medical/farmacologia/25.html. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

2. Klinická farmakológia. Národné vedenie. Upravil Yu.B. Belousová, V.G. Kukesa, V.K. Lepakhina, V.I. Petrova-M: „GEOTAR-Media“, 2009-965 s.

3. Wikipedia [Elektronický zdroj] / Agonist. - Režim prístupu: http://ru.wikipedia.org/wiki/Agonist. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

4. Biochémia: Učebnica / Ed. E.S. Severina. - 3. vydanie, rev. - M.: Geotar-Media, 2005. - 784 s.

5. Chemická encyklopédia [Elektronický zdroj] / Fumarát hydratáza. - Režim prístupu: http://www.xumuk.ru/encyklopedia/2/4963.html. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

6. Soldatenkov A.T. Základy organickej chémie liečivých látok / A.T. Soldatenkov. - M.: Chémia, 2001.-- 192 s.

7. Tracy, T. S. Metabolická inverzia (R)-ibuprofénu. Epimerizácia a hydrolýza ibuprofenyl-koenzýmu A/T.S. Tracy, S.D. Hall // Drug Metab. Dispos. -- 1992. -- V.20. -- č. 2. -- S. 322-327.

8. Prchavé prírodné organické zlúčeniny [Elektronický zdroj] / Režim prístupu: http://fen.nsu.ru/posob/pochki/Tkachev.pdf. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

9. Burges, R.A. Vlastnosti amlodipínu blokujúce kalciový kanál v hladkom svalstve ciev a srdcovom svale in vitro: dôkaz modulácie napätia vaskulárnych dihydropyridínových receptorov / R.A. Burges // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 1987; 9(1):110-119.

10. Laufen, H. Enantioselektívna dispozícia perorálneho amlodipínu u zdravých dobrovoľníkov / H. Laufen, M. Leitold // Chiralita. - 1994. - V. 6 (7). - S. 531-536.

11. Cogolludo, A. Nové poznatky vo farmakologickej terapii arteriálnej hypertenzie / A. Cogolludo, F. Perez-Vizacaino, J. Tumargo // Curr. Opin. Nephrol. Hypertenzia. - 2005. - V.14. - S. 423-427.

12. Perna G.P. Účinnosť a tolerancia amlodipínu u pacientov so stabilnou angínou pectoris. Výsledky multicentrickej štúdie / G.P. Perná // Clin. Drug. investovať. - 1997. - V. 13. - S. 149-155.

13. Bobrov, V.A. Použitie S-amlodipínu pri liečbe pacientov s miernou a stredne ťažkou arteriálnou hypertenziou / V.A. Bobrov [atď.] // Zdravie Ukrajiny - 2007. - Číslo 12/1 - S. 1-4.

14. Leenson, I.A. Vľavo alebo vpravo / I.A. Leenson // M.: Chémia a život. - č. 5. - 2009. - S. 20-23.

15. Alekseev, V.V. Optická izoméria a farmakologická aktivita liečiv // Soros Educational Journal, 1998, č. 1, s. 49-55.

16. Yanitsky, P.K. Rozmanitosť štruktúry a foriem molekúl organických zlúčenín / P.K. Yanitsky, V. Reversky, V. Gumulka // Novinky z farmácie a medicíny. 1991. Číslo 4/5. s. 98-104.

17. Biológia [Elektronický zdroj] / Úloha stereoizometrie v biochemickej regulácii. Režim prístupu: http://bio.1september.ru/view_article.php?ID=200901701. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

18. Biochémia: Učebnica pre univerzity / Ed. E. S. Severina. -- GEOTAR-Media, 2003. -- S. 371-374

19. Príjem transmastných kyselín a riziko ischemickej choroby srdca u žien / Walter C. - Lancet. - V. 341. - S. 581--585.

20. Willett, W.C. Transmastné kyseliny: sú účinky len okrajové? /W.C. Willet, A. Ascherio American Journal of Public Health. - V. 84 (3). - 1994. - S. 722-724.

21. Vedecká aktualizácia WHO o transmastných kyselinách: zhrnutie a závery / R Uauy // European Journal of Clinical Nutrition. - č. 63. - 2009. - R. 68-75.

22. Nafisi, S. Porovnávacia štúdia o interakcii cis- a trans-platiny s DNA a RNA. / S. Nafisi, Z. Norouzi. // DNA Cell Biol. - V. 28(9). - 2009. - S. 469-477.

23. Moskovská štátna univerzita pomenovaná po. Lomonosov [Elektronický zdroj] / Protinádorová aktivita acetoxímových a hydroxylamínových komplexov platiny(II). Režim prístupu: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2007/23/Chemistry/kukushkin_nv.doc.pdf. - Dátum prístupu: 01.05.2013.

24. Syntéza a štruktúra nových komplexných zlúčenín paládia(ii) s n-substituovanými tetrazolmi / T.V. Serebryanskaya [a iní] // Minsk, „Sviridov Readings“, 2008. - S. 45-53.

25. Todeschini, R. Molecular Descriptors for Chemoinformatics / R. Todeschini, V. Consonni. - Willey-VCH, 2009. - 1265 s.

26. Kvantitatívne vzťahy medzi štruktúrou a aktivitou: Základy a aplikácia Hanschovej analýzy / Medzinárodná únia čistej a aplikovanej chémie. Brazília, 2006. - Spôsob prístupu: http://iupac.org/publications/cd/medicinal_chemistry. - Dátum prístupu: 20.04.2013.

27. Todeschini, R. Handbook of Molecular Descriptors / R. Todeschini, V. Consonni. - Wiley-VCH, 2000. - 688 s.

Podobné dokumenty

Štúdium hlavných znakov zápalového procesu. Charakteristika farmakologického účinku nesteroidných protizápalových liekov. Štúdium indikácií a spôsobu použitia, kontraindikácií, vedľajších účinkov.

kurzová práca, pridané 3.10.2014


Hlavné indikácie a farmakologické údaje pre použitie nesteroidných protizápalových liekov. Prípady zákazu ich používania. Charakteristika hlavných predstaviteľov nesteroidných protizápalových liekov.

abstrakt, pridaný 23.03.2011


Digitálne kódovanie liekov. Vplyv rôznych faktorov na spotrebiteľské vlastnosti a kvalitu liekov, spôsoby ochrany tovaru podľa štádií životného cyklu. Farmakologické pôsobenie, indikácie liekov na báze chaga.

kurzová práca, pridané 28.12.2011


Charakteristika liekov používaných pri poruchách sekrečnej funkcie žalúdka, dvanástnika a pankreasu. Analýza skupín liekov: ich farmakologický účinok, dávky, formy použitia a uvoľňovania, nežiaduce reakcie.

kurz práce, pridané 30.10.2011


Miesto nesteroidných protizápalových liekov medzi „symptomatickými“ liekmi v liečbe reumatických ochorení. Vlastnosti mechanizmu účinku, indikácie na použitie a dávkovanie, vedľajšie účinky liekov v tejto skupine.

kurzová práca, pridané 21.08.2011


Koncept biologickej dostupnosti liečiv. Farmakotechnologické metódy na hodnotenie dezintegrácie, rozpúšťania a uvoľňovania liečivých látok z liečivých prípravkov rôznych foriem. Prechod liečiv cez membrány.

kurzová práca, pridané 10.2.2012


Vlastnosti ruského farmaceutického trhu. Charakteristika skupiny nesteroidných protizápalových liekov. Tovarová analýza lieku na základe lieku. Marketingový prieskum produktov, stratégia propagácie.

kurz práce, pridané 30.11.2010


Štátna regulácia v oblasti obehu liekov. Falšovanie liekov je dôležitým problémom dnešného farmaceutického trhu. Analýza stavu kontroly kvality liekov v súčasnom štádiu.

kurzová práca, pridané 04.07.2016


Vlastnosti použitia nesteroidných protizápalových liekov pri reumatoidnej artritíde. Terapeutický efekt užívania liekov, možnosť nežiaducich účinkov, individualizácia výberu. Rizikové faktory pre gastrotoxicitu.

prezentácia, pridané 21.12.2014


Hlavné úlohy farmakológie: tvorba liekov; štúdium mechanizmov účinku liekov; štúdium farmakodynamiky a farmakokinetiky liečiv v experimentálnej a klinickej praxi. Farmakológia synaptotropných liekov.

1. 
   Nositelia genetickej informácie v mikroorganizmoch.
2. 
   Formy prejavu variability mikroorganizmov. Úpravy. Mutácie, ich klasifikácia. R-S disociácia. Praktický význam variability mikroorganizmov.
3. 
   Mutagény, klasifikácia, mechanizmus účinku mutagénov na genóm mikroorganizmov.
4. 
   Úloha cytoplazmatických genetických štruktúr vo variabilite mikroorganizmov.
5. 
   Genetické rekombinácie.
6. 
   Transformácia, etapy transformačného procesu.
7. 
   Transdukcia, špecifická a nešpecifická transdukcia.
8. 
   Konjugácia, štádiá procesu konjugácie.

1. V úlohách testu uveďte správne odpovede.

1. Prehliadka a skicovanie demonštračných príprav:

A) R-S disociácia baktérií.

Kontrolné otázky:

1. 
   Aký je materiálny základ dedičnosti mikroorganizmov?
2. 
   Aké formy prejavu variability mikroorganizmov existujú?

1. 
   Aký je praktický význam mikrobiálnej variability?
2. 
   Čo sú modifikácie?
3. 
   Čo sú mutácie?
4. 
   Aká je klasifikácia mutácií?
5. 
   Čo sú to mutagény?
6. 
   Aký je mechanizmus účinku mutagénov na genóm mikroorganizmov?

1. 
   Aká je úloha cytoplazmatických genetických štruktúr vo variabilite mikroorganizmov?
2. 
   Čo sú genetické rekombinácie?
3. 
   Čo je transformácia? Aké sú fázy tohto procesu?
4. 
   Čo je to transdukcia?
5. 
   Čo je konjugácia? Aké sú fázy tohto procesu?

TEST ZADANIA

Označte správne odpovede ety:

1. Čo sú extrachromozomálne genetické štruktúry?

A) ribozómy

B) polyzómy

B) plazmidy

D) mezozómy

D) transpozóny

2. Čo sú to mutagény?

A) gény, ktoré poskytujú mutáciu

B) faktory spôsobujúce mutáciu

B) faktory, ktoré prenášajú genetickú informáciu

D) Faktory opravy DNA

3. Čo je to exón?

A) virulentný bakteriofág

B) profág

B) časť génu, ktorá nesie určitú genetickú informáciu

D) mierny bakteriofág

4. Čo je to inverzia?

A) metóda genetickej rekombinácie

B) korekcia poškodených úsekov DNA

B) chromozomálna mutácia

D) bodová mutácia

5. Čo je modifikácia?

B) fenotypové zmeny, ktoré neovplyvňujú bunkový genóm

B) prenos genetického materiálu pomocou bakteriofága

D) dedičná náhla zmena znaku

6. Konjugácia je charakterizovaná:

A) prenos genetického materiálu pomocou bakteriofága

B) je potrebný kontakt medzi bunkami darcu a príjemcu

B) prenos genetického materiálu pomocou RNA

D) prenos genetického materiálu sexom

7. Čo je to reparácia?

A) lyzogenéza

B) oprava poškodenej DNA

C) spôsob prenosu genetickej informácie

D) viropexiu

8. Čo charakterizuje „mínusové“ vlákno RNA?

A) má infekčnú aktivitu

B) má dedičnú funkciu

B) je schopný integrovať sa do bunkového chromozómu

D) nemá funkciu messenger RNA

9. U ktorých mikroorganizmov je RNA materiálnym základom dedičnosti?

A) v baktériách

B) v spirochétách

D) v mykoplazmách

10. Čo sú mutácie?

A) korekcia poškodených úsekov DNA

B) prenos genetického materiálu pomocou bakteriofága

B) dedičná náhla zmena vlastnosti

D) proces tvorby bakteriálneho potomstva obsahujúceho charakteristiky darcu a príjemcu

11. Čo je to transformácia?

A) oprava poškodenej DNA

B) prenos genetickej informácie pri kontakte bakteriálnych buniek rôznej „sexuálnej“ orientácie

C) prenos genetickej informácie pomocou fragmentu DNA

D) prenos genetickej informácie z bunky darcu do bunky príjemcu pomocou bakteriofága

INFORMAČNÁ MATERIAL NA TÉMU TRIED

Inscenácia transformačného zážitku

Príjemca - kmeň Bacillus subtilis Str (bacillus subtilis, citlivý na streptomycín); donor - DNA izolovaná z kmeňa IN.Subtilis Str (rezistentné na streptomycín). Selektívne médium na selekciu rekombinantných (transformantov) živného agaru obsahujúceho 100 U/ml streptomycínu.

Do 1 ml bujónovej kultúry IN.Subtilis pridajte 1 ug/ml roztoku DNázy v 0,5 ml roztoku chloridu horečnatého, aby ste zničili DNA, ktorá neprenikla do bakteriálnych buniek kmeňa príjemcu, a inkubujte 5 minút. Na stanovenie počtu vytvorených rekombinantov (transformantov) rezistentných na streptomycín sa 0,1 ml nezriedenej zmesi vysieva na selektívne médium v ​​Petriho miske. Na stanovenie počtu buniek recipientnej kultúry v izotonickom roztoku chloridu sodného pripravte 10-násobné riedenia na 10 -5 -10 -6 (na získanie spočítateľného počtu kolónií), naočkujte 0,1 ml na živný agar bez streptomycínu, a na kontrolu - na agare so streptomycínom. Kultúra príjemcu by nemala rásť na druhom médiu, pretože je citlivé na streptomycín. Inokulácia sa inkubuje pri 37 °C. Nasledujúci deň sa zohľadnia výsledky experimentu a frekvencia transformácie sa určí pomerom počtu narastených rekombinantných buniek k počtu buniek recipientného kmeňa.

Predpokladajme, že keď sa vysieva 0,1 ml kultúry recipientného kmeňa v riedení 10-5, narastie 170 kolónií a keď sa vysieva 0,1 ml neriedenej zmesi, narastie 68 kolónií rekombinantného kmeňa. Pretože každá kolónia bola vytvorená ako výsledok reprodukcie iba jednou bakteriálnou bunkou, 0,1 ml naočkovanej recipientnej kultúry obsahuje 170 x 105 životaschopných buniek a 1 ml - 170 x 106 alebo 1,7 x 108. Súčasne 0,1 ml zmesi obsahuje 68 rekombinantných buniek a 1 ml - 680 alebo 6,8 x 102.

Frekvencia transformácie v tomto experimente sa teda bude rovnať:

Nastavenie konkrétneho transdukčného experimentu

Príjemcom je kmeň E. coli lac-, ktorému chýba 3-galaktozidázový operón, ktorý riadi fermentáciu laktózy. Transdukčným fágom je fág X dgal, v genóme ktorého sú niektoré gény nahradené (operónom 3-galaktozidázy E. coli. Je defektný, t.j. nie je schopný spôsobiť produktívnu infekciu, ktorá končí v lýza Escherichia coli, a označuje sa písmenom d (fág dgal ) s názvom gal operónu obsiahnutého v genóme Selektívne médium - Endo médium, na ktorom tvoria bezfarebné kolónie laktózovo-negatívne baktérie recipientného kmeňa a laktóza. -pozitívne kolónie rekombinantného kmeňa získajú červenú farbu s kovovým odtieňom 1 sa pridá do 1 ml 3-hodinovej bujónovej kultúry recipientného kmeňa ml transdukujúceho fága dgal v koncentrácii 10 6 - 10 7 častíc v 1 ml Zmes sa inkubuje 60 minút pri teplote 37 °C, potom sa pripraví séria 10-násobných riedení (v závislosti od očakávanej koncentrácie baktérií), aby sa získal spočítateľný počet kolónií s riedením 10 -6, naočkujte 0,1 ml kultúry do 3 Petriho misiek s Endo médiom a tekutinu rovnomerne rozdeľte špachtľou po povrchu média.

Plodiny sa inkubujú 1 deň, potom sa zaznamenajú výsledky experimentu a frekvencia transdukcie sa vypočíta ako pomer počtu rekombinantných buniek (transduktantov) nájdených na všetkých miskách k počtu buniek recipientného kmeňa.

Napríklad po vysiatí 0,1 ml zmiešanej kultúry v riedení 10 -6 na 3 poháre s médiom Endo vyrástlo 138, 170 a 160 bezfarebných kolónií recipientného kmeňa v prvom a poslednom pohári - 5 a 1. kolónie červených transduktantov. Preto bude frekvencia prenosu v tomto prípade rovná:

Nastavenie konjugačného experimentu za účelom prenosu fragmentu chromozómu, katktorý obsahuje génleu, ktorý riadi syntézu leucínu.

Darca - kmeň E.coli K12 Hfr leu str S; príjemca - kmeň E.Coli K12 F - leu+ Str R. Hfr je označenie pre stav charakterizovaný vysokou frekvenciou rekombinácií. Selektívne médium na izoláciu rekombinantov - minimálne glukózo-soľné médium: KH2PO 4 - 6,5 g, MgS04 - 0,1 g, (NH 4)2SO 4 - 1 g, Ca(NO 3)2 - 0,001 g, FeSO 4 - 0,0005 g, glukóza - 2 g, streptomycín - 200 U / ml, destilovaná voda - 1 l.

Pridajte 1 ml kultúry darcovského bujónu do 2 ml 3-hodinovej recipientnej kultúry. Plodiny sa inkubujú pri 37 °C počas 30 minút. Potom sa zmes zriedi na 10 -2 -10 3 a 0,1 ml sa naočkuje na selektívne agarové médium v ​​Petriho miskách, na ktorých budú rásť len rekombinantné kolónie. Ako kontrola sa darcovské a recipientné kmene vysievajú na rovnaké médium, nebudú na ňom rásť, pretože prvý kmeň je citlivý na streptomycín a druhý je auxotrofný na leucín. Okrem toho sa kultúra darcovského kmeňa vysieva na selektívne médium bez streptomycínu a kultúra prijímajúceho kmeňa sa vysieva na kompletné médium (živný agar) s antibiotikami na stanovenie počtu životaschopných buniek. Plodiny sa inkubujú pri 37 °C do nasledujúceho dňa. Po spočítaní počtu pestovaných kolónií sa frekvencia rekombinácií určí pomerom počtu rekombinantných buniek k bunkám príjemcu.

Napríklad po vysiatí 0,1 ml zmesi donorových a recipientných kultúr v riedení 10-2 vyrástlo 150 kolónií rekombinantov a po vysiatí 0,1 ml recipientnej kultúry z riedenia 10-6 vyrástlo 75 kolónií. Frekvencia rekombinácie sa teda bude rovnať:

VZDELÁVACIE VÝSKUMNÉ PRÁCE č.7

Téma: Bakteriologická metóda diagnostikyagnostikov

infekčné choroby. Výživa baktérií. Princípy kultivácie mikroorganizmov. Živné médiá. Metódy sterilizácie

Cieľ učenia: Ovládajte bakteriologickú metódu diagnostiky infekčných chorôb. Študovať druhy bakteriálnej výživy, princípy kultivácie mikroorganizmov, klasifikáciu kultivačných médií a metódy sterilizácie.

Požadovaná počiatočná úroveň vedomostí: Fyziológia mikroorganizmov.

Praktické vedomosti a zručnosti, ktoré by mal študent na hodine získať:

Otázky zvažované počas skúškyyatii:

1. 
   Bakteriologická metóda diagnostiky infekčných chorôb, jej účel a štádiá.
2. 
   Druhy bakteriálnej výživy.
3. 
   Princípy kultivácie mikroorganizmov.

1. 
   Živné médiá; požiadavky na živné pôdy.
2. 
   Klasifikácia živných pôd, ich zloženie a príprava.
3. 
   Metódy sterilizácie: fyzikálne, chemické, biologické a mechanické.
4. 
   Mikrób ako predmet sterilizácie a dezinfekcie. Vzťah k štruktúre mikrobiálnej bunky. Hlavné ciele molekulárnej štruktúry mikroorganizmov pod sterilizačnými a dezinfekčnými vplyvmi.
5. 
   Rozdiely medzi pojmami kontaminácia a dekontaminácia, dezinfekcia a sterilizácia, asepsa a antiseptiká.
6. 
   Klasifikácia nástrojov, zariadení, spôsobov spracovania a typov expozície na sterilizáciu a dezinfekciu.

1. 
   Moderné sterilizačné technológie a zariadenia.
2. 
   Metódy sledovania účinnosti sterilizácie a dezinfekcie.

Samostatná práca študentov:

1. Experiment na stanovenie vplyvu vysokej teploty (80°C) na spórotvorné (antrakoidné) a asporogénne (Escherichia coli a stafylokoky) mikroorganizmy.

Učiteľ vysvetľuje skúsenosť:

A) na každej tabuľke je uvedená suspenzia stafylokoka, E. coli a spórového bacilu (antrakoid);

B) každá suspenzia sa pred zahrievaním naočkuje na šikmý agar;

C) skúmané suspenzie sa umiestnia na 20 minút do vodného kúpeľa s teplotou 80 °C;

D) každá suspenzia sa po zahriatí naočkuje na šikmý agar;

D) vyplní sa protokol v tomto formulári:

Vegetatívne formy patogénnych mikroorganizmov odumierajú pri 50-60 °C počas 30 minút a pri teplote 70 °C počas 5-10 minút. Bakteriálne spóry sú odolnejšie voči vysokým teplotám, čo sa vysvetľuje obsahom vody v nich vo viazanom stave, vysokým obsahom vápenatých solí, lipidov a hustotou a viacvrstvovou schránkou. V dôsledku toho stafylokok a E. coli po zahriatí uhynú, ale spóry antrakoidov prežijú. Toto je potrebné vziať do úvahy pri hodnotení výsledkov sejby.

2. Vyplňte tabuľku sami:

3. V úlohách testu uveďte správne odpovede.

Praktické práce študentov:

1. Prehliadka demonštračných prípravkov a zariadení:

A) živné médiá (MPB, MPA, krvný agar, sérový agar, Hissovo médium, Endo médium, Ploskirevovo médium);

B) Pasteurova pec, autokláv.

Testy vankety:

1. 
   Aké sú ciele a štádiá bakteriologickej metódy diagnostiky infekčných ochorení?
2. 
   Čo je to bakteriálna výživa?
3. 
   Aké druhy bakteriálnej výživy existujú?
4. 
   Aké sú zásady pestovania mikroorganizmov?
5. 
   Čo sú to kultúrne médiá?
6. 
   Aké sú požiadavky na živné pôdy?
7. 
   Aká je klasifikácia živných médií?
8. 
   Ako sa pripravujú kultivačné médiá?
9. 
   Čo je sterilizácia?
10. 
    Aké metódy sterilizácie existujú?
11. 
    Aký je rozdiel medzi pojmami kontaminácia a dekontaminácia, dezinfekcia a sterilizácia, asepsa a antiseptiká?
12. 
    Aké bunkové štruktúry mikroorganizmov ovplyvňujú sterilizačné a dezinfekčné faktory?
13. 
    Aká je klasifikácia nástrojov, zariadení, metód spracovania a typov expozície na sterilizáciu a dezinfekciu?
14. 
    Aké moderné sterilizačné technológie a zariadenia sú známe?
15. 
    Aké metódy sa používajú na monitorovanie účinnosti sterilizácie a dezinfekcie?

TESTOVACIE ÚLOHY

Prosím, uveďte správne odpovede:

1. Ktoré živné pôdy sú jednoduché?

A) Endo médium

B) krvný agar

D) peptónová voda

2. Čo je sterilizácia?

A) úplná sterilizácia predmetov zo všetkých druhov mikróbov a ich spór

B) zničenie patogénnych mikroorganizmov

C) ničenie vegetatívnych foriem mikroorganizmov

D) zabránenie vstupu mikroorganizmov do rany

D) ničenie špecifických typov mikróbov na objektoch

3. Aké faktory sa používajú pri autoklávovaní?

Teplota

B) filtre

D) tlak

4. Aké faktory sa používajú v Pasteurovej peci?

A) tlak

B) suché teplo

D) antibiotiká

5. Živné pôdy sa podľa účelu delia na:

Jednoduchý

B) voliteľné

B) kvapalina

D) diferenciálna diagnostika

D) doprava

6. Vo vzťahu k rastovým faktorom sa mikroorganizmy delia na:

A) autotrofy

B) heterotrofy

B) auxotrofy

D) litotrofy

D) prototrofy

E) organotrofy

7. Optimálna teplota pre pestovanie väčšiny patogénnych mikroorganizmov je:

8. Fyzikálne metódy sterilizácie zahŕňajú:

A) ultrazvuk

B) ultrafialové lúče

B) antibiotiká

D) filtrovanie

D) sterilizácia parou

E) sterilizácia suchým teplom

9. Rast baktérií ovplyvňujú tieto kultivačné podmienky:

B) pH prostredia

B) teplota

D) vlhkosť prostredia

D) rastové faktory

E) všetky odpovede sú nesprávne

10. Hustota živných médií závisí od obsahu v nich:

A) chlorid sodný

B) peptón

B) agar-agar

D) sacharóza

D) krvné sérum

11. Mikróby, ktoré využívajú anorganické zdroje uhlíka a redoxné reakcie na výrobu energie, sa nazývajú:

A) chemoorganotrofy

B) fotoorganotrofy

B) chemolithotrofy

D) chemoautotrofy

D) chemoauxotrofy

12. Uveďte spôsoby sterilizácie, ktoré zbavia predmet spór mikróbov:

A) ultrafialové žiarenie

B) autoklávovanie

B) pasterizácia

D) suché teplo

D) gama žiarením

13. Usporiadajte procesy spracovania laboratórnych prístrojov v správnom poradí:

A) predsterilizačné čisteniesterilizácia

B) predsterilizačné čistenie, sterilizáciadezinfekcia

C) predsterilizačné čisteniedezinfekcia-sterilizácia

D) dezinfekciapredsterilizačné čisteniesterilizácia

14. Súbor opatrení zameraných na ničenie patogénnych mikroorganizmov sa nazýva:

A) asepsa

B) antiseptikum

B) dezinfekcia

D) sterilizácia

D) tyndalizácia

INFORMAČNÝ MATERIÁL K TÉME LEKCIE

Mikrobiologické vyšetrenie realizované s cieľom izolovať čisté kultúry mikroorganizmov, kultivovať ich a študovať ich vlastnosti. Je nevyhnutný pri diagnostike infekčných chorôb, pri určovaní druhov mikróbov, pri výskumných prácach, pri získavaní odpadových produktov mikróbov (toxíny, antibiotiká, vakcíny a pod.). Na pestovanie mikroorganizmov v umelých podmienkach sú potrebné špeciálne substráty - živné pôdy. Sú základom mikrobiologickej práce a určujú výsledky celej štúdie. Prostredie musí vytvárať optimálne podmienky pre život mikróbov.

POŽIADAVKY, PREDPREDSTAVUJE SA V STREDU:

1. 
   Musí byť výživný, t.j. obsahovať v ľahko stráviteľnej forme všetky látky potrebné na uspokojenie nutričných a energetických potrieb mikroorganizmov.
2. 
   Majú optimálnu koncentráciu vodíkových iónov.
3. 
   Byť izotonický pre mikrobiálnu bunku.
4. 
   Buďte sterilní.
5. 
   Buďte mokrí.
6. 
   Majú určitý redoxný potenciál.
7. 
   Buďte čo najviac jednotní.

Pre efektívne fungovanie mnohobunkového organizmu je potrebná precízna koordinovaná interakcia medzi rôznymi biologickými molekulami, supramolekulárnymi a subcelulárnymi štruktúrami, bunkami a orgánmi, ktoré predstavujú funkčne jednotný ucelený systém. Fyziologické funkcie orgánu, orgánového systému a tela ako celku nemôžu vykonávať izolované špecializované bunky a ešte viac subcelulárne útvary. Jednou z kľúčových etáp evolúcie živých organizmov bolo získanie schopnosti makromolekúl reverzibilnej, špecifickej medzimolekulovej interakcie, vedúcej k zmene ich funkčnej aktivity, čo v konečnom dôsledku predurčilo reguláciu fyziologických procesov na rôznych úrovniach organizácie organizmu. biologický systém - molekulárny, supramolekulárny, subcelulárny, bunkový, orgánový a napokon aj v tele ako celku. Biochemické procesy vo vnútri buniek mnohobunkového organizmu sú koordinované a zároveň primerané schopnostiam jednotlivej bunky, jej schopnosti podieľať sa na práci celého organizmu. Táto povaha bunkového správania v mnohobunkovom organizme je spôsobená schopnosťou buniek vstupovať do medzibunkových, matrix-bunkových a humorálno-bunkových interakcií regulovaných z bunky aj z tela prostredníctvom špecializovaných štruktúr peptidovej povahy – receptorov. Prostredníctvom medzibunkových, matrix-bunkových a humorálno-bunkových interakcií sa z buniek rôznych fyziologických špecializácií vytvára funkčne jednotná štruktúra tkaniva, orgánu a organizmu ako celku, v ktorej prebieha koordinovaná regulácia metabolickej aktivity, čo im umožňuje vykonávať fyziologické funkcie vlastné orgánu/orgánovému systému.

Štruktúry cytoplazmatickej membrány mnohobunkového organizmu počas evolúcie vznikli na základe už existujúcich vnútrobunkových štruktúr peptidovej povahy 1 . Modifikácia zodpovedajúcich génov a evolučný výber zabezpečili jednak zachovanie určitých domén molekuly proteínu, nazývaných evolučne konzervatívne, jednak prispeli k vzniku nových, určených na vykonávanie špecializovaných funkcií. Prítomnosť evolučne konzervovaných domén v molekuly peptidovej povahy na rôzne funkčné účely je významný okrem iného aj pre reguláciu ich funkčnej činnosti podľa spoločných zásad, spoločných vplyvov.

domény molekuly peptidovej povahy, obohatené o zvyšky síry v zložení cysteínu, patria k evolučne konzervatívnym zložkám molekulárnej štruktúry. Evolučne konzervované domény obohatené cysteínom sa nachádzajú v zložení extracelulárnych a intracelulárnych transportných, regulačných, senzorických, výkonných, štrukturálnych a iných, podľa ich funkčného účelu, molekuly peptidovej povahy

Receptorové tyrozínkinázy majú evolučne konzervovanú extracelulárnu doménu obohatenú o cysteínové zvyšky. Sulfhydrylové skupiny cysteínové zvyšky v bunkových povrchových doménach receptorov sú citlivé na pôsobenie oxidačných činidiel, čo vedie k tvorbe intramolekulárnych a intermolekulárnych disulfidové zosieťovanie (väzby) zmena funkčného stavu bunkovej povrchovej domény (napríklad zvýšenie tropizmu a/alebo špecificity pre agonistu alebo agonistu) a/alebo iniciácia aktivity receptorovej tyrozínkinázy 2.

Zvyšky síry v zložení cysteínových evolučne konzervovaných domén molekuly peptidovej povahy sú jedným z najdôležitejších bodov aplikácie faktorov ovplyvňujúcich konformáciu molekuly peptidovej povahy 3 4 .

Možnosť reverzibilných, regulovaných zmien v konformácii extracelulárnej a intracelulárnej molekuly peptidovej povahy(vrátane receptorov, membránových transportérov, iónových kanálov, enzýmov a iných špecializovaných molekuly peptidovej povahy), spolu s ich schopnosťou vykonávať fyziologické funkcie, urobili z konformačných preskupení na úrovni terciárnych a kvartérnych štruktúr jeden z účinných univerzálnych mechanizmov ovplyvňovania aktivity rôznych proteínov, vrátane molekúl zodpovedných za medzibunkové, matrix-bunkové, humorálno-bunkové interakcie. , iónová výmena a substráty, organizácia bunkovej štruktúry a jej metabolická aktivita 5 6 7

Regulačné účinky na zvyšky síry v cysteíne evolučne konzervovaných štruktúrnych a funkčných domén molekuly peptidovej povahy extracelulárne a intracelulárne priestory sú determinované okrem iného aj redoxným prostredím. Redoxné prostredie odráža úroveň pomeru interkonvertibilných oxidovaných a redukovaných špecifických redoxných párov. Redoxné prostredie tvorené prepojenými redoxnými pármi v biologických tekutinách extracelulárneho priestoru, cytosóle a bunkových organelách je určené súčtom redukčného potenciálu v nich a redukčnej kapacity týchto redoxných párov.

Redukujúce ekvivalenty prevládajú vo vnútrobunkovom priestore aj mimo bunky, ale hodnota ich pomeru k oxidačným formám mimo bunky a v rade organel je o niečo nižšia ako vnútrobunková hodnota v cytosóle. Výsledkom je, že prostredie obklopujúce bunky a prostredie mnohých vnútrobunkových organel sa vyznačuje vyššou oxidačnou kapacitou v porovnaní s cytosolom 8 9 10

Funkčne aktívne konformácie molekúl v intracelulárnom a extracelulárnom priestore sú prispôsobené evolučne stanoveným vlastnostiam redoxných podmienok. Ako je uvedené vyššie, zvyšky síry v zložení cysteínu majú štrukturálne a regulačné vlastnosti molekuly peptidovej povahy sú jedným z najdôležitejších bodov aplikácie efektorových molekúl, ktoré vykonávajú redoxnú moduláciu. Cysteín je koncentrovaný v evolučne konzervovaných doménach štruktúrnych a funkčných molekúl peptidovej povahy. Cysteínové zvyšky evolučne konzervovaných regulačných, štrukturálnych, katalytických domén molekuly peptidovej povahy, ktorých redoxná modulácia sírovej väzby vedie k zmene konformácie a/alebo funkčnej aktivity, sa označujú ako „horúce cysteíny“. Sulfhydrylové skupiny cysteínu sa zúčastňujú väčšiny reakcií vo forme merkaptidového iónu RS?. Proteínové merkaptidové ióny sú reaktívnejšie a ľahšie náchylné na oxidáciu ako nedisociované sulfhydrylové skupiny. Hodnota pKa (ionizačná konštanta) SH skupín proteínov sa značne líši a je do značnej miery určená ich interakciou so susednými funkčnými skupinami v molekule. Prítomnosť kladne nabitej skupiny v tesnej blízkosti skupiny SH znižuje jej ionizačnú konštantu. Hodnota pKa väčšiny SH skupín v aktívnych miestach enzýmov je približne 8,5 11 12. Preto pri fyziologickom pH v bunkovom mikroprostredí a bunke (~7,4) existujúce sulfhydrylové skupiny väčšiny molekuly peptidovej povahy zostávajú neionizované vďaka vysokej hodnote pKa, takže sú odolné voči oxidácii. „Horúce cysteíny“ evolučne konzervovaných domén sú obklopené blízkymi kladne nabitými skupinami, v dôsledku čoho sa ich pKa pohybuje od 4,7 do 5,4. Takže sulfhydrylová skupina v ich zložení je ionizovaná aj pri fyziologickom pH a ľahko podlieha oxidačnej modifikácii. Funkčne aktívna konformácia väčšiny intracelulárnych buniek molekuly peptidovej povahy vzniká pri redukcii zvyškov síry v zložení „horúcich cysteínov“ na sulfhydrylové skupiny 13 14 15 16. Naopak, funkčne aktívna konformácia väčšiny extracelulárnych molekuly peptidovej povahy vzniká pri tvorbe disulfidovej väzby medzi sírovými zvyškami „horúcich cysteínov“ 17 18 19 20.

Redukovaný (GSH) a oxidovaný glutatión (GSSG) predstavujú jeden z hlavných biochemických párov biologických priestorov, ktorých hodnota pomeru (GSH/GSSG) určuje hodnotu redoxného potenciálu zodpovedajúceho fyziologického priestoru 21 22 . Fyziologicky potrebná hodnota pomeru GSH/GSSG je regulovaná a tvorená zodpovedajúcimi biochemickými systémami, monitorovanými molekulárnymi redoxnými senzormi v štruktúre bunkových povrchových receptorov, iónových kanálov, bioregulátorov, enzýmov, cytoplazmatických membránových transportérov a iných molekuly peptidovej povahy intracelulárne a extracelulárne priestory 23 24. Dôsledkom reakcie molekulárneho redoxného senzora na zmenu hodnoty redoxného potenciálu je vznik regulačného signálu, ktorý ovplyvňuje biochemické procesy alebo proces, bunkovú reakciu alebo reakcie 25 26, ktoré určujú na jednej strane bunkovej odozve a na druhej strane obnovy fyziologicky adekvátnej hodnoty redoxného potenciálu. V tomto ohľade faktory ovplyvňujúce pomer medzi redukovaným a oxidovaným glutatiónom (reaktívne formy kyslíka 27, reaktívne formy dusíka 28 29 30, oxid uhoľnatý 31, organické peroxidy 32) sú schopné modulovať biochemické procesy a bunkové reakcie zmenou hodnoty redox potenciál a pomer redukovaného/oxidovaného glutatiónu v systéme.

Obrázky 2 a 3 na príklade bioregulátorov a ich receptorov ilustrujú princíp molekulárneho mechanizmu účasti sulfhydrylových skupín evolučne konzervovaných domén obsahujúcich cysteín, redukovaného (GSH) a oxidovaného (GSSG) glutatiónu na riadení funkčnej aktivity molekuly peptidovej povahy extracelulárneho priestoru.

Obr.2. Vplyv s účasťou redukovaného glutatiónu (GSH) na disulfidové priečne väzby (väzby) v štruktúre funkčne aktívnych extracelulárnych a/alebo ich bunkových povrchových receptorov vedie k vytvoreniu skupiny molekúl, ktorých konformácia obmedzuje ich fyziologicky adekvátne interakcie.

Obr.3. Vplyv na sulfhydrylové (SH) skupiny v štruktúre funkčne neaktívnych extracelulárnych bioregulátory peptidovej povahy a/alebo ich bunkových povrchových receptorov, spôsobených znížením redoxného potenciálu v dôsledku zvýšenia množstva oxidovaného glutatiónu (GSSG), vedie k vytvoreniu skupiny molekúl, ktorých konformácia je primeraná povahe situačne determinovanej fyziologickej interakcie.

Je potrebné poznamenať, že reaktívne formy kyslíka, reaktívne formy dusíka a organické peroxidy sú schopné priamo vykonávať oxidačnú modifikáciu sulfhydrylových skupín na sulfenáty. Fyziologická podstata takéhoto účinku sa však prejaví, ak po vytvorení sulfenátu za účasti GSH vznikne zmiešaný disulfid s glutatiónom (glutationylačná reakcia) a následne sa uskutoční usporiadaný enzymatický proces na vytvorenie správneho disulfidu. zosieťuje alebo redukuje zvyšok síry v zložení cysteínu ​​33. V opačnom prípade môže dôjsť k ireverzibilnej oxidácii sírového zvyšku v cysteíne na kyselinu cystínsulfónovú (Cys-S03H) a v dôsledku toho k strate schopnosti regulovať funkciu proteínu.