Moderné problémy vedy a vzdelávania. Metódy hodnotenia apoptózy Markery apoptózy

Vyšetrených bolo 45 detí vo veku 3–15 rokov. Účelom štúdie bolo zistiť pripravenosť na apoptózu lymfocytov a neutrofilov periférnej krvi stanovením markerov apoptózy – CD95, CD95L, BSL2. Pri hodnotení apoptózy imunokompetentných buniek sa zistil pokles pripravenosti na programovanú bunkovú smrť lymfocytov a nárast neutrofilných granulocytov. Najvýraznejšie zmeny zaznamenávame vo vekovej skupine 7–15 rokov so skúsenosťou s ochorením viac ako 3 roky. Získané údaje môžu byť znakom potlačenia programovanej smrti autoreaktívnych lymfocytov v tkanive pankreasu, čo prispieva k predĺženiu imunitnej odpovede. Zvýšenie podielu leukocytových buniek exprimujúcich CD95L môže prispieť k zvýšeným procesom programovanej bunkovej smrti v β bunkách ostrovčekov pankreasu infiltrovaných imunokompetentnými bunkami.

apoptóza neutrofilov

apoptóza lymfocytov

diabetes mellitus 1. typu

1. Pekareva E. V. Markery apoptózy u pacientov s diabetes mellitus 1. typu na začiatku ochorenia / E. V. Pekareva et al. – 2009. – Číslo 4. – S. 86-89.

2. Pekareva E. V. Úloha apoptózy v patogenéze diabetes mellitus 1. typu / E. V. Pekareva, T. V. Nikonova, O. M. Smirnova // Diabetes mellitus. – 2010. – Číslo 1. – S.45-48.

3. Adeghate E. Aktualizácia etiológie a epidemiológie diabetes mellitus / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. – Vol. 1084. – S. 1–29.

4. Klinický význam apoptózy neutrofilov v periférnej krvi pacientov s diabetes mellitus 2. typu / S. Sudo et al. // Laboratórny hematol. 2007; 13(3):108-12 (redukované).

5. Filep J. G. Apoptóza neutrofilov: cieľ na zlepšenie riešenia zápalu / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. – 2009. – Zv. 108. – S. 1039–1046.

6. Ľudské polymorfonukleárne neutrofilné reakcie na Burkholderia pseudomallei u zdravých a diabetických subjektov / S. Chanchamroen a kol. // Infect Immun. – 2009. – Zv. 77. – S. 456–463 (apoptóza je znížená).

7. Impact of Lymphocyte Apoptosis in Diabetes mellitus / K. A. Awadhesh et al. // Asian Journal of Medical Sciences. – 2011. – č. 2. – S. 1-6.

8. Zápal je trvalejší u diabetických myší 1. typu / D. T. Graves et al. // J. Dent. Res., 2005. – Vol. 84. – S. 324–328.

9. Juliana C. Alves Infekcie u pacientov s diabetes mellitus: Prehľad patogenézy / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – marec 2012. – Supp l1. – Číslo 16. – S. 27–36.

10. Luo H. R. Konštitutívna apoptóza neutrofilov: mechanizmy a regulácia / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. – 2008. – Zv. 83. – S. 288–295.

Úvod

Diabetes mellitus 1. typu (T1DM) je polygénne, multifaktoriálne ochorenie spojené s tvorbou autoprotilátok a autoreaktívnych T lymfocytov voči β bunkám pankreasu.

Hlavnými väzbami v patogenéze autoimunitných lézií sú dysregulácia imunity a programovaná bunková smrť.

Riadená apoptóza sa dnes považuje za hlavný mechanizmus udržiavania optimálnej rovnováhy buniek v mieste zápalu, obmedzuje expanziu aktivovaných klonov a bráni rozvoju autoimunitných reakcií. Ak dôjde k defektu pri jeho realizácii, aktivované imunitné bunky sa môžu hromadiť, čo vedie k výskytu autoimunitných ochorení.

Účel štúdie: štúdium aktivačných markerov apoptózy CD95, CD95L, Bsl2 na periférnych krvných lymfocytoch a neutrofiloch pri diabetes mellitus 1. typu u detí.

Materiál a metódy výskumu

Uskutočnil sa prieskum u 45 detí s diabetes mellitus 1. typu vo veku 3-15 rokov. Skupina I zahŕňala 20 detí vo veku 3-6 rokov (predškoláci), skupina II - 12 detí vo veku 7-15 rokov (školáci) s trvaním ochorenia menej ako 3 roky, skupina III - 13 detí vo veku 7-15 rokov (školáci) so skúsenosťami s ochorením viac ako 3 roky. Kontrolnú skupinu tvorilo 30 zdravých detí vo veku 3-6 (15) a 7-15 (15) rokov. Štúdia bola vykonaná na základe endokrinologického oddelenia Detskej mestskej klinickej nemocnice pomenovanej po. G.K. Filippsky, Stavropol.

Na vyhodnotenie programovanej bunkovej smrti sa detegoval počet lymfocytov a neutrofilných granulocytov exprimujúcich markery apoptózy. Lymfocyty boli izolované na Ficoll-Paque hustotnom gradiente, neutrofily - na dvojitom hustotnom gradiente Ficoll-Paque a Ficoll-urografín (GE Healthcare, Švédsko). Bunková suspenzia sa trikrát premyla v médiu RPMI-1640 (Vector-Best, Rusko). V kultúrach lymfocytov a neutrofilov bol počet buniek exprimujúcich CD95, CD95L, Bsl2 hodnotený prietokovou cytometriou s použitím monoklonálnych protilátok (Invitrogen, USA).

Na štatistickú analýzu údajov sa použil softvérový balík „Primer of Biostat 4.0“, Attestat 10.5.1. Na vyhodnotenie rozdielov medzi skupinami sa použila analýza rozptylu opakovaných meraní s výpočtom Newman-Keulsovho a Dunnovho testu.

Kvantitatívne hodnoty boli nenormálne rozdelené a boli prezentované ako medián a interkvantil (25. a 75. percentil) rozsah (Me (Q1-Q)). Rozdiely v p sa považovali za významné.<0,05.

Výsledky a ich diskusia

Práca odhalila pokles počtu lymfocytov exprimujúcich Fas receptory (CD95) u pacientov všetkých skupín v porovnaní so zdravými deťmi (tabuľka 1). Minimálne ukazovatele boli pozorované u detí vo veku 7-15 rokov so skúsenosťami s ochorením viac ako 3 roky (tabuľka 1).

stôl 1

Indikátory apoptózy lymfocytov u detí s diabetes mellitus 1. typu

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой

Pri hodnotení úrovne expresie antiapoptotických markerov (Bsl2) sa zistilo jej zvýšenie v lymfocytoch detí všetkých skupín, výraznejšie u školákov s trvaním ochorenia viac ako 3 roky, čo tiež poukazuje na porušenie Fas- závislá apoptóza u detí s diabetes mellitus 1. typu, čo vedie k spomaleniu procesov bunkovej smrti autoreaktívnych foriem lymfocytov.

Naše výsledky môžu byť nepriamym znakom potlačenia programovanej smrti aktivovaných lymfocytov v tkanive pankreasu, čo prispieva k predĺženiu imunitnej odpovede.

Úroveň apoptickej pripravenosti lymfoidných buniek závisí od trvania ochorenia a u detí s T1DM klesá viac ako 3 roky.

Už skôr sa ukázalo, že pri diabetes mellitus existuje rezistencia lymfocytov na apoptózu, čo môže vysvetliť povahu a trvanie autoimunitnej odpovede.

V kultúre lymfocytov detí s diabetom bolo zistené zvýšenie percenta lymfocytov exprimujúcich CD95L (tab. 1) v porovnaní so skupinou zdravých detí. Najvyššie miery boli stanovené u detí vo veku 7-15 rokov so skúsenosťami s ochorením dlhším ako 3 roky (tabuľka 1).

Je známe, že pri T1DM sú pankreatické ostrovčeky infiltrované imunitnými bunkami produkujúcimi široké spektrum cytokínov, čo je sprevádzané aberantnou expresiou membránových receptorov. Pod vplyvom zvýšených koncentrácií glukózy a cytokínov začnú β-bunky na svojom povrchu exprimovať CD95, ktorý normálne prakticky chýba.

Zvýšená expresia CD95L na lymfoidných bunkách môže prispieť k výraznejšiemu apoptotickému procesu v β-bunkách pankreasu a ich následnému odstráneniu.

V posledných rokoch sa ukázalo, že neutrofilné granulocyty sa aktívne podieľajú na tvorbe autoimunitného zápalu. Reakcia neutrofilov zameraná na lokalizáciu a elimináciu autoantigénov do značnej miery závisí od sily a trvania antigénneho účinku na imunitný systém, ako aj od počiatočnej úrovne funkčnej aktivity buniek.

Zistili sme, že priebeh diabetes mellitus u detí je sprevádzaný zvýšením percenta neutrofilov exprimujúcich markery apoptózy (CD95) a znížením podielu buniek s antiapoptickými proteínmi Bsl2 na ich povrchu (tabuľka 2).

tabuľka 2

Indikátory apoptózy neutrofilov u detí s diabetes mellitus 1. typu

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keulsov test, Dunnov test).

Pri porovnávacích medziskupinových charakteristikách sú maximálne hodnoty CD95 ​​(str<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

Bolo zistené zvýšenie percenta polymorfonukleárnych leukocytov s CD95L na ich povrchu. Najvyššie miery boli pozorované u školákov s anamnézou ochorenia dlhšou ako 3 roky.

Výsledky štúdií apoptózy PMN u diabetes mellitus prezentované v literatúre sú rozporuplné. Existujú dôkazy o zvýšení rýchlosti apoptózy neutrofilov periférnej krvi u T1DM a T2DM.

Viaceré štúdie však zistili pokles apoptózy neutrofilných granulocytov u pacientov s diabetom 1. typu, najmä v podmienkach hyperglykémie, ktorá pravdepodobne spúšťa procesy chronického zápalu s poškodením tkaniva a tiež predisponuje k dlhotrvajúcim bakteriálnym infekciám u pacientov s typom 1 cukrovka.

Naše výsledky naznačujú, že pacienti s T1DM majú zvýšenú predispozíciu PMN k apoptóze, čo môže byť prejavom ochrannej reakcie zameranej na elimináciu „nadbytku“ aktívnych neutrofilov, ktorých tvorba zvyšuje poškodenie tkaniva.

Zvýšenie apoptotického potenciálu neutrofilných granulocytov je odrazom aktívneho zapojenia PMN do imunopatogenézy ochorenia.

Zvýšená expresia CD95L na neutrofilných granulocytoch u pacientov s diabetom môže pravdepodobne prispieť k eliminácii nielen pankreatických buniek, ale aj ich vlastných leukocytových buniek.

Pri hodnotení apoptózy imunokompetentných buniek u detí s diabetes mellitus 1. typu sa teda zistilo zníženie pripravenosti na programovanú bunkovú smrť lymfocytov a zvýšenie polymorfonukleárnych leukocytov.

Najvýraznejšie zmeny zaznamenávame vo vekovej skupine 7-15 rokov so skúsenosťou s ochorením viac ako 3 roky. U detí všetkých skupín sa zistilo zvýšenie podielu leukocytových buniek exprimujúcich CD95L na svojom povrchu.

Je známe, že PMN sú spojením medzi vrodenou a adaptívnou imunitou a hrajú vedúcu úlohu v antibakteriálnej ochrane.

Zvýšenie ich apoptotickej aktivity môže spôsobiť nízku odolnosť dieťaťa súvisiacu s vekom a náchylnosť na infekčné choroby.

Zníženie počtu lymfoidných buniek citlivých na indukciu apoptózy je nepriamym znakom potlačenia programovanej bunkovej smrti a zhoršenej eliminácie aktivovaných foriem lymfocytov.

závery

1. U detí trpiacich diabetes mellitus 1. typu dochádza k poklesu pripravenosti na apoptózu lymfocytov periférnej krvi, k zvýšeniu neutrofilných granulocytov, čo je sprevádzané zmenou expresie CD95 a Bsl2 a závisí od dĺžky trvania choroba.

2. Zvýšená expresia CD95L na lymfocytoch a neutrofilných granulocytoch pri T1DM môže prispieť k zvýšeným procesom programovanej bunkovej smrti v β-bunkách ostrovčekov pankreasu infiltrovaných imunokompetentnými bunkami.

Recenzenti:

Shchetinin E.V., doktor lekárskych vied, profesor, prorektor pre vedeckú a inovačnú prácu Štátnej lekárskej univerzity sv., vedúci katedry HBO vyššieho odborného vzdelávania „Stavropolská štátna lekárska univerzita“ Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie , Stavropol.

Golubeva M.V., doktor lekárskych vied, profesor, vedúci oddelenia detských infekčných chorôb Vyššej odbornej vzdelávacej inštitúcie HBO „Stavropolská štátna lekárska univerzita“ Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie, Stavropol.

Bibliografický odkaz

Apoptóza je programovateľná, geneticky sprostredkovaná forma bunkovej smrti, pri ktorej vonkajšie alebo vnútorné signály dávajú bunke impulz, aby vytvorila alebo aktivovala enzýmy, ktoré ju vedú k samodeštrukcii. Morfologicky je apoptóza charakterizovaná zmršťovaním buniek, kondenzáciou a fragmentáciou jadra, deštrukciou cytoskeletu a bulóznym výbežkom bunkovej membrány. Charakteristickým znakom apoptózy je, že umierajúca bunka si zachováva integritu svojej membrány, kým sa proces neskončí, a až potom je deštrukcia jej membrány signálom pre fagocyty v okolí, aby absorbovali zostávajúce fragmenty a dokončili proces bunkovej degradácie. Apoptotické bunky, ktoré neprechádzajú okamžitou fagocytózou, sa stávajú malými fragmentmi viazanými na membránu nazývanými „apoptotické telá“. Dôležitým znakom apoptózy je, že k odstráneniu odumierajúcich buniek dochádza bez rozvoja zápalu.

Apoptóza hrá dôležitú úlohu vo fyziologických procesoch: organogenéza, embryonálny vývoj, regulácia zloženia a počtu bunkových populácií v tkanivách dospelého organizmu, rôzne hormonálne zmeny v organizme. Úloha apoptózy je tiež dôležitá pri rôznych patologických procesoch. Najviac sa študoval pri raste nádorov.

Proces apoptózy možno rozdeliť do dvoch fáz:

· tvorba a vedenie apoptotických signálov – fáza rozhodovania;

· demontáž bunkových štruktúr – efektorová fáza.

Implementácia mechanizmov apoptózy je spojená s aktiváciou endogénnych bunkových enzýmov - cysteínových proteáz (kaspáz). Kaspázy sú v bunkách v neaktívnom stave (prokaspázy). K aktivácii dochádza ich proteolytickým štiepením a následnou dimerizáciou s tvorbou aktívnych podjednotiek. Cieľmi kaspáz sú proteíny zodpovedné za rôzne vitálne funkcie bunky. V súčasnosti je opísaných 14 typov kaspáz, ktoré možno podľa ich funkčných charakteristík rozdeliť do 3 skupín:

aktivátory cytokínov (kaspázy 1, 4, 5, 13)

kaspázy - induktory aktivácie efektorových kaspáz (kaspázy 2, 8, 9, 10)

· efektorové kaspázy – aktéri apoptózy (3, 6, 7)

Jedným z membránových bunkových receptorov zodpovedných za mechanizmy apoptózy je proteín nazývaný Fas receptor (CD95/APO1). Ligandom pre Fas receptor je proteín Fas ligand (Fas-L), ktorý patrí do rodiny tumor-nekrotických faktorov a môže byť prítomný buď vo forme membránového proteínu alebo v rozpustnej forme. Väzba Fas receptora na Fas ligand vedie k aktivácii mechanizmov apoptózy s aktiváciou kaspázových induktorov. S následnou aktiváciou efektorových kaspáz začína reťazec proteolytických reakcií, ktorých účelom je apoptotické „rozoberanie“ bunky: fragmentácia DNA, priame štiepenie štrukturálnych proteínov bunky, dysregulácia syntézy proteínov. Účasť efektorových kaspáz na apoptóze teda vedie k prasknutiu apoptotickej bunky s okolitými bunkami, reorganizácii cytoskeletu, zníženiu schopnosti opravy a replikácie DNA, prasknutiu jadrovej membrány a deštrukcii DNA, uvoľneniu signálov označujúcich bunku pre apoptóza a rozkúskovanie bunky na apoptotické telá. Nie je náhoda, že efektorové kaspázy sa nazývajú „popravné kaspázy“.

Metódy na štúdium apoptózy sú dosť rôznorodé. Spočiatku najbežnejším spôsobom stanovenia apoptózy bola elektroforéza extrahovanej DNA frakcie, ktorá umožňuje identifikovať diskrétnosť DNA s nízkou molekulovou hmotnosťou mol. hmoty (v dôsledku degradácie internukleozomálnej DNA). V morfologických štúdiách sa na detekciu zlomov DNA využíva metóda TUNEL, ktorá je založená na tvorbe inzertov značených oligonukleotidov v miestach zlomov DNA, ktorých vznik je katalyzovaný enzýmom TdT.

V súčasnosti sa na zaznamenávanie apoptózy lymfocytov čoraz viac využívajú metódy založené na prietokovej cytometrii. Do tejto skupiny patrí metóda založená na detekcii straty časti DNA bunkami (hypodiploidnými bunkami) pomocou fluorescenčného farbiva – propidium jodidu, ktorá je popísaná nižšie. Na stanovenie apoptózy sa používajú aj iné metódy založené na prietokovej cytometrii. Apoptózu lymfocytov je možné detegovať v skorých štádiách pomocou anexínu V značeného fluorochrómom, ktorý sa viaže na fosfatidylserín objavujúci sa na membráne buniek podstupujúcich apoptózu. Približnú predstavu o „sklone“ lymfocytov k rozvoju apoptózy možno získať stanovením expresie Fas receptora (CD95) na ich povrchu a v mitochondriách protokogénu bcl-2.

Klinický význam hodnotenia apoptózy počas klinického a imunologického vyšetrenia pacientov je nepochybný, pretože jej poškodenie je spojené s množstvom ochorení. Oslabenie apoptózy je spôsobené tvorbou autoimunitných ochorení (v dôsledku narušenia procesu likvidácie autošpecifických klonov lymfocytov). Zaznamenanie oslabenia apoptózy môže preto slúžiť ako zdroj informácií o patogenetických mechanizmoch takých autoimunitných ochorení, akými sú systémový lupus erythematosus, reumatoidná artritída, ale aj autoimunitný lymfoproliferatívny syndróm, ktorý je založený na mutáciách génov určujúcich receptory apoptotických signálov. . Zhoršená apoptóza je dôležitým mechanizmom vo vývoji malígnych procesov. V nádorových bunkách sa často zistí mutácia génu p53 kódujúceho proteín, ktorý sníma signál o prítomnosti neopravených zlomov DNA a chromozomálnych mutácií, čo vedie k rozvoju apoptózy. V dôsledku toho nie sú geneticky defektné bunky vyradené a stávajú sa zdrojom tvorby nádorov.

Pri mnohých iných ochoreniach sa naopak pozoruje zvýšenie apoptózy. K tomu dochádza pri infekčných procesoch (masívna apoptóza T buniek je často spôsobená mikrobiálnymi superantigénmi), sepse a rôznych vírusových ochoreniach vrátane AIDS. Apoptóza je zosilnená pri rade krvných ochorení a primárnych imunodeficiencií, keď je spôsobená nedostatočnou produkciou faktorov prežitia buniek, ktorých úlohu zohrávajú cytokíny. Pri jednej z foriem závažnej kombinovanej imunodeficiencie spojenej s mutáciou génu IL-7 alebo spoločného y-reťazca cytokínových receptorov teda dochádza k smrti lymfoidných prekurzorov v dôsledku nedostatku IL-7.

Najdôležitejšie je však hodnotenie „aktivovanej apoptózy“, ktorú lymfocyty podstupujú, keď sú stimulované mitogénmi. Faktom je, že apoptóza je spolu s proliferáciou formou reakcie lymfocytov na aktivačné stimuly. V skorých štádiách diferenciácie prevažuje apoptotická odpoveď a jej výsledkom je vytvorenie tolerancie na induktorový antigén. Zrelé lymfocyty reagujú na stimuláciu prevažne proliferáciou (ktorá slúži ako počiatočné štádium a predpoklad rozvoja imunitnej odpovede), ale určitá pravdepodobnosť ich vstupu do aktivačnej apoptózy zostáva. Pretože apoptóza pôsobí ako procesná alternatíva k proliferácii, ich pomer môže slúžiť ako miera účinnosti bunkovej odpovede na aktivačné signály. Čím vyšší je príspevok apoptózy k odpovedi lymfocytov na mitogén, tým menej účinná bude antigén-špecifická imunitná obrana. Stanovenie apoptózy počas aktivácie lymfocytov mitogénmi je teda najinformatívnejšie, ak podlieha paralelnému hodnoteniu proliferatívnej odpovede buniek na rovnaký stimul.

Počas procesu apoptózy prebieha v bunke na molekulárnej úrovni zložitý reťazec reakcií, ktorý vedie k zmenám v metabolických procesoch a fenotypových charakteristikách buniek. Tieto zmeny môžu byť stanovené biochemickými, mikroskopickými alebo cytometrickými metódami a používajú sa ako markery apoptózy.

Jedným zo skorých markerov apoptózy je objavenie sa na cytoplazmatickej membráne bunky. anexínové receptory. V apoptotických bunkách je fosfolipid fosfatyldiserín (PD) preorientovaný a lokalizovaný na povrchu bunkovej membrány. Lokalizácia PS na povrchu membrány sa pozoruje od
skoré štádium apoptózy pred úplnou degradáciou buniek. Rekombinantný-
ny proteín anexínu V (35-36 kDa), ktorý má vysokú afinitu
odolnosť voči PS v prítomnosti iónov Ca +2. Kontaktovanie FS na povrchu
ty bunky, slúži anexín V, konjugovaný s fluorochrómom
marker apoptózy. Annexin V sa zvyčajne používa v kombinácii s
propidium jodid (PI), ktorý umožňuje súčasné rozpoznanie
intaktné bunky (negatívne anexín V aj PI), bunky
sú v „časnej“ apoptóze (pozitívny na anexín V,
negatívne na PI) a bunky v neskorej apoptóze resp
pri nekróze (pozitívne pre anexín V aj PI).

CD95 Fas alebo APO-1 je transmembránový glykoproteín (45 kDa), ktorý je členom rodiny receptorov tumor nekrotizujúceho faktora (TNF-a). Antigén CD95 je exprimovaný vo významných množstvách na tymocytoch, CD4+, CD8+ lymfocytoch periférnej krvi a v menšom rozsahu na B lymfocytoch a NK bunkách. Tento antigén je tiež exprimovaný na granulocytoch a monocytoch, ale jeho expresia sa nenachádza na krvných doštičkách a erytrocytoch. Receptor CD95 je tiež pozorovaný na bunkách normálnych tkanív a nádorov. Väzba CD95 pomocou Fas ligandu (Fas-L, CD95L) indukuje apoptózu v bunkách, ktoré ho exprimujú. Monoklonálne protilátky proti CD95 umožňujú identifikovať populáciu buniek pripravených na apoptózu pomocou prietokovej cytometrie alebo fluorescenčnej mikroskopie.

CD95L (Fas-L)– nazývaný Fas ligand, je membránový proteín (40 kDa). Existuje aj rozpustná forma CD95L (sFas-L), čo je proteín (26 kDa) z rodiny (TNF-a) receptorov. Tento antigén je exprimovaný cytotoxickými E lymfocytmi a NK bunkami a bol tiež detegovaný na mnohých nádorových bunkách. Väzba Fas-L na receptor CD95 indukuje proces apoptózy v cieľových bunkách. Monoklonálne protilátky proti CD95L umožňujú identifikovať populáciu buniek pripravených na apoptózu pomocou prietokovej cytometrie alebo fluorescenčnej mikroskopie.

Bcl-2– proteín (26 kDa), ktorého nadmerná expresia blokuje apoptózu. Bcl-2 je intracelulárny proteín lokalizovaný na mitochondriách, preto je na jeho detekciu pomocou monoklonálnych protilátok potrebné vykonať predbežnú permeabilizáciu bunkovej membrány.

Koniec práce -

Táto téma patrí do sekcie:

Metódy hodnotenia imunitného stavu - učebnica pre študentov lekárskych, pediatrických a lekársko-profylaktických fakúlt

Štátna lekárska univerzita Kursk Federálna agentúra pre zdravie a sociálny rozvoj.. Oddelenie klinickej imunológie a alergológie..

Ak potrebujete ďalší materiál k tejto téme, alebo ste nenašli to, čo ste hľadali, odporúčame použiť vyhľadávanie v našej databáze diel:

Čo urobíme s prijatým materiálom:

Ak bol tento materiál pre vás užitočný, môžete si ho uložiť na svoju stránku v sociálnych sieťach:

Všetky témy v tejto sekcii:

Imunitný stav a metódy jeho hodnotenia
Imunitný stav (IS) je súbor laboratórnych parametrov charakterizujúcich kvantitatívnu a funkčnú aktivitu buniek imunitného systému. IP indikátory sú vysoké

Objekty a metódy imunologického výskumu
Ciele štúdia Metódy štúdia Fenotypové charakteristiky imunokompetentných buniek Prietoková cytofluorometria IMM

Lymfocyty
Ako súčasť buniek imunitného systému sú pravé imunocyty všetky varianty lymfocytov. Iné typy leukocytov (neutrofily, eozinofily, bazofily, monocyty), makrofágy, krvné doštičky, žírne bunky

MFS bunky
Monocyty periférnej krvi a tkanivové makrofágy pochádzajú z pluripotentných kmeňových buniek. Keď sa monocyty dostanú do krvného obehu, do 2-3 dní sa usadia v tkanivách, kde sa zmenia na tkanivo

Antimikrobiálny systém závislý od kyslíka
kyslíkovo závislé mechanizmy baktericídnej glukózy + NADP+ → fosfát pentózy + NADPH Cytochróm b245 NADP + O2 ͛

Sprostredkovateľské bunky
Granulocyty sú polymorfonukleárne leukocyty, ktoré cirkulujú v krvi a vznikajú podobne ako monocyto-makrofágové bunky z myeloidnej kmeňovej bunky v kostnej dreni. Existujú tri druhy granu

Metódy imunofenotypizácie lymfocytov
Pri štúdiu lymfocytov sa hodnotí ich počet v periférnej krvi a funkčná aktivita. Stanovenie počtu buniek sa uskutočňuje s prihliadnutím na diferenciačné antigény na a

Izolácia frakcie mononukleárnych buniek
Metóda izolácie mononukleárnych buniek je založená na rozdielnom vztlaku rôznych krviniek. Použitie gradientu určitej hustoty umožňuje oddeliť mononukleárne bunky (lymfocyty, monocyty, krvinky)

Prietoková cytometria
Metóda prietokovej cytometrie je založená na meraní optických vlastností buniek. Bunky sú zavádzané jednotlivo do laminárneho toku v kremennej kyvete, kde prechádzajú sústredeným svetlom

Metóda nepriamej imunofluorescencie
Nepriama imunofluorescencia je metóda založená na použití monoklonálnych protilátok značených fluorochrómom, pričom sa výsledky vyhodnocujú s prihliadnutím na špecifickú luminiscenciu buniek počas luminiscenčnej mikroskopie.

Imunocytochemická metóda
Imunocytochemické metódy sú založené na použití enzýmov, ako je peroxidáza a alkalická fosfatáza. V súčasnosti sa najčastejšie používa metóda PA (peroxidáza-antiperoxidáza), st.

Metódy štúdia funkčnej aktivity lymfocytov
Funkčná aktivita lymfocytov sa hodnotí podľa nasledujúcich účinkov: schopnosť rozpoznávať antigény, aktivácia, proliferácia a diferenciácia buniek. Schopnosť rozpoznávania lymfocytov

Reakcia transformácie lymfocytových blastov
Kontakt lymfocytu s cudzím antigénom alebo nešpecifickým mitogénom je sprevádzaný reakciou aktivácie a blastickej transformácie (BTLR), t.j. proliferáciu buniek s prechodom malých lymfocytov na blast

Zmiešaná kultúra lymfocytov
Kokultivácia lymfocytov s molekulami MHC-II rôznych haplotypov spôsobuje ich blastickú transformáciu a proliferáciu. Reagujúce bunky patria k T-lymfocytom a sú stimulované cudzími

Proteíny krvnej plazmy
V ľudskej plazme je prítomných viac ako dvesto proteínov, z ktorých väčšina bola izolovaná a opísaná štrukturálne a funkčne. Plazmatické proteíny sú zastúpené prevažne glykoproteínmi. S elektrofó

Globulíny
α1-antitrypsín je α1-globulín, ktorý predstavuje viac ako 80 % sérovej antiproteázovej aktivity a je hlavnou zložkou α-pásma. V srvátkovej sóde

Globulíny
Haptoglobín má polčas rozpadu 2-4 dni. Normálny obsah haptoglobínu v sére je 0,3 – 2,0 g/l. Jeho hlavným funkčným významom je viazanie voľného hemoglobínu v sére

Metódy elektroforézy proteínov
Elektroforéza sa široko používa na semikvantitatívne stanovenie sérových proteínov a na detekciu paraproteínov. Elektroforéza sa vykonáva so sérom, nie plazmou, tzv

Imunoglobulíny
Imunoglobulíny (Ig) sú špecifické proteíny, ktoré produkuje imunitný systém ako výsledok reakcie na cudzie antigény a akumulujú sa v krvnom sére a iných biologických tekutinách.

Ľudské imunoglobulíny
Vlastnosť IgM IgG IgA IgD IgE Molekulárna forma Pentamer

Metódy stanovenia imunoglobulínov
Na kvantitatívne stanovenie obsahu Ig rôznych tried v krvnom sére a iných biologických tekutinách sa široko používajú rôzne možnosti na stanovenie štádia precipitačnej reakcie v géli.

Paraproteíny
Paraproteíny sú imunoglobulíny alebo ich fragmenty produkované plazmatickými bunkami odvodenými z jednej špecifickej bunkovej línie B lymfocytov (monoklon). Paraproteíny často zlyhávajú

Kryoglobulíny
Kryoglobulíny sú patologické plazmatické bielkoviny (10-80 mg/ml), ktoré majú tú vlastnosť, že sa pri teplotách pod 37°C menia do rôsolovitého stavu. Väčšina kryoglobulínov sú polyklonálne komplexy

Metódy stanovenia imunitných komplexov
Väzba Ig na antigén je fyziologický proces vedúci k tvorbe imunitných komplexov (IC) zameraných na elimináciu antigénu z tela. Avšak za určitých podmienok

Stanovenie autoprotilátok v diagnostike systémových ochorení spojivového tkaniva
Podľa moderných koncepcií sa autoimunita týka stavov, pri ktorých sa v tele objavia protilátky alebo senzibilizované lymfocyty proti normálnym antigénom vlastných tkanív.

Hlavné sérologické markery autoimunitných ochorení
Antigén Pôvodný názov Molekulárna štruktúra Funkcia Diagnostická hodnota

Stanovenie ANA v nepriamej imunofluorescenčnej reakcii
Pri typickom teste sa sérum pacienta inkubuje s antigénnymi substrátmi (zvieracie pečeňové alebo obličkové tkanivo, bunková kultúra Hep-2), aby sa špecificky naviazali prítomné látky.

Nepriama imunofluorescencia
Charakter luminiscencie Špecifickosť antigénu Klinický význam Periférna alebo marginálna dsDNA, l

Stanovenie ANA a ENA pomocou ELISA na pevnej fáze
Testovací systém pre ELISA ANA (UBI MAGIWELL) - na skríningovú analýzu antinukleárnych protilátok poskytuje semikvantitatívne stanovenie širokého spektra protilátok proti komplexu sorbovanému v jamkách

Autoimunitné ochorenia
Typ patológie Výsledky imunologického výskumu. Typ protilátok a ich frekvencia (%)

Cytokínový systém
Cytokíny sú triedou rozpustných peptidových mediátorov imunitného systému, ktoré sú nevyhnutné pre jeho vývoj, fungovanie a interakciu s inými telesnými systémami. Oni definujú

interleukíny
IL-1 je imunoregulačný mediátor uvoľňovaný počas zápalových reakcií, tkanivových lézií a infekcií (prozápalový cytokín). IL-1 stimuluje proliferáciu a diferenciáciu

Interferóny
Interferón (IFN) bol objavený ako proteín s antivírusovou aktivitou. Antivírusový účinok IFN je spôsobený jeho schopnosťou zabrániť intracelulárnej replikácii vírusu v štádiu

Faktory nekrózy nádorov
Tumor nekrotizujúci faktor (TNF) je hlavným mediátorom produkovaným organizmom ako odpoveď na gramnegatívne baktérie. Účinnou látkou gramnegatívnych baktérií je LPS, súčasť bunkového systému.

Faktory stimulujúce kolónie
Množstvo cytokínov produkovaných počas vývoja imunitnej odpovede má stimulačný účinok na diferenciáciu prekurzorov kostnej drene. Tieto cytokíny sa nazývajú cytokíny stimulujúce kolónie.

Rastové faktory
Transformujúci rastový faktor (TGFp) je rodina príbuzných peptidov s viacerými účinkami na všeobecné procesy regulujúce rast a morfogenézu. TGFβ - hlavný cytokín

Metódy stanovenia cytokínov
Stanovenie obsahu cytokínov v rôznych biologických tekutinách má veľký význam pri hodnotení funkčnej aktivity imunokompetentných buniek a regulácii imunitnej odpovede. Samostatnými slovami

Doplnkový systém
Systém komplementu je komplex proteínov krvného séra schopných samoorganizácie a sprostredkovania reakcií humorálnej imunity a fagocytózy. V súčasnosti je známe, že

Metódy stanovenia aktivity komplementu
Celková aktivita (titer) komplementu sa stanovuje v hemolytickej reakcii pomocou ovčích erytrocytov. Komplement obsiahnutý v testovacom sére spôsobuje hemolýzu u senzibilizovaných oviec

Doplnkový titer pri 50 % HE
Hemolýza, % K Hemolýza, % K Hemolýza, % K Hemolýza, % K

Stanovenie zložiek komplementu
Na stanovenie zložiek komplementu sa používa ELISA a turbidimetrická metóda, ktorej implementácia je opísaná v návode priloženom k ​​diagnostickým testovacím systémom. V klinickej praxi

Dopĺňať komponenty
Zložka komplementu Klinické prejavy Nedostatok C1 Zvyčajne nespôsobuje klinicky významné poruchy, keďže sa stravuje

Metódy štúdia fagocytárnej aktivity granulocytov
Najdôležitejšou charakteristikou funkcie granulocytov je posúdenie ich fagocytárnej aktivity. Jeho pokles môže byť dôsledkom nedostatku sérových opsonizačných faktorov (protilátky, komplement

NST test
Nitromodrý tetrazóliový test (NBT test) sa používa na identifikáciu takzvaných aktivovaných granulocytov a monocytov. Aktivácia fagocytov je založená na prudkom zvýšení oxidačných reakcií

Metodológie výskumu
Potrebné reagencie a materiály: KN 42 OPO 44 0, Na 42 OPO 44 0, NaCl, glukóza, nitromodrá tetrazólium, heparín, metylalkohol, 1% vodný roztok metylénovej zelene (v príp.

Stanovenie myeloperoxidázy
Myeloperoxidáza oxiduje množstvo substrátov (benzidín, ortofenyldiamín) v prítomnosti peroxidu vodíka, čo je sprevádzané farebnou reakciou. Myeloperoxidáza je enzým obsiahnutý vo fágových granulách

Chemiluminiscencia
Spontánna luminiscencia, ku ktorej dochádza počas chemických reakcií v dôsledku energie reagujúcich látok, sa nazýva chemiluminiscencia (CL). Je súčasťou všetkých tkanív a buniek živého organizmu, pokiaľ ich obsahujú

Stanovenie obsahu IgE
Spomedzi imunologických metód na hodnotenie nešpecifických parametrov imunitného stavu pri väčšine atopických ochorení má najväčší význam stanovenie množstva celkového IgE. Avšak súhlasím

Basofilný degranulačný test
U alergických pacientov je významná časť IgE viazaná rôznymi leukocytmi prostredníctvom ich Fc receptorov. Prítomnosť buniek nesúcich protilátky indikuje ich senzibilizáciu na zodpovedajúci alergén. B

Test na stimuláciu bunkového antigénu bazofilov - CAST
V prípade alergických reakcií sprostredkovaných IgE sa spúšťací mechanizmus začína väzbou alergénu na špecifické molekuly IgE na povrchu bazofilov alebo žírnych buniek. E

Reakcia inhibície migrácie leukocytov
Reakcia sa uskutočňuje na identifikáciu lymfocytov senzibilizovaných na podozrivý alergén. Senzibilizované lymfocyty pri interakcii so špecifickým alergénom uvoľňujú mediátory (FPML

Úloha č.1
23-ročný pacient sa sťažuje na opakujúce sa vriedky lokalizované na tvári a nohách. Zaznamenáva časté prechladnutia (až 7-8 krát ročne), herpetické vyrážky na perách.

Problém č.2
Pacient N., 22-ročný, sa obrátil na imunológa so sťažnosťami na opakované akútne respiračné vírusové infekcie (až 7-krát do roka), často sprevádzané exacerbáciou chronickej obštrukčnej bronchitídy. Vedené antibakteriálne

Úloha č.3
Pacient T., 27 rokov, opakovane konzultoval s lekárom opakujúce sa akútne respiračné vírusové infekcie, tracheobronchitída, slabosť a malátnosť. Z anamnézy sa zistilo, že v priebehu roka trpel ARVI šesťkrát, dvakrát

Problém č.4
Pacient K, 45 rokov. Diagnóza: systémový lupus erythematosus. Imunologická štúdia odhalila: Leukocyty - 5,5 x 109/l Lymfocyty -37 %, abs. 2,03 x 109

Problém č.5
Dieťa, 5 rokov, patrí do skupiny často a dlhodobo chorých detí, recidívy ARVI raz za mesiac, ložiská chronickej infekcie (chronická sinusitída, adenoiditída), zväčšené krčné lymfatické uzliny

Počas imunologického vyšetrenia
Testy prvej úrovne Celkový počet bielych krviniek. Leukoformula T-lymfocyty B-lymfocyty

Všeobecná analýza krvi
Normálne jednotky SI Hemoglobín M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l

Hlavné CD markery buniek imunitného systému
CD marker Bunková populácia % buniek CD2 T a NK bunky

Subpopulácia lymfocytov u detí
lymfocyty 4-5 dní - 3 mesiace 4-8 mesiacov 1-2 roky 2-5 rokov nad 5 rokov všetko

Hladina imunoglobulínov v krvnom sére dospelých
IgM IgG IgA IgE 1,3 – 1,7 g/l 12 – 14 g/l 2,1 – 2,9 g/l

Alergický panel MAST (multiple allergosorbent test) na identifikáciu špecifických imunoglobulínov voči alergénom rôznych skupín
Food Ig E panel Ruský rozšírený Ig E panel Food Ig G panel Ruský univerzálny Ig E panel

Slovníček pojmov
Avidita je sila väzby antigénu na protilátku, ktorá je určená afinitou a valenciou protilátok. Aglutinácia - agregácia do

Zoznam skratiek a symbolov
AG – antigén AOK – bunka tvoriaca protilátku APC – bunka prezentujúca antigén AT – protilátka VLS – eferentná lymfatická cieva VVC – infikovaná vírusom

Marková A.A. 1Kashkina E.I. 1 Rubtsov V.S. 1 Lyakisheva R.V. 1

1 Štátna lekárska univerzita v Saratove pomenovaná po. IN AND. Razumovský, Saratov

Expresia markerov apoptózy a proliferácie bola analyzovaná u 61 pacientov s ulceróznou kolitídou v závislosti od trvania, závažnosti ochorenia a lokalizácie zápalového procesu v hrubom čreve. Porovnávaciu skupinu tvorilo 15 prakticky zdravých ľudí. Pacienti boli vyšetrení klinickými, laboratórnymi, endoskopickými a morfologickými metódami. V bioptických vzorkách sliznice hrubého čreva bola stanovená expresia imunohistochemických markerov Ki-67, P53, BAX a CEA. Štúdia odhalila štatisticky významný pokles proliferačnej aktivity sliznice hrubého čreva u pacientov s ulceróznou kolitídou v porovnaní so skupinou zdravých jedincov, ako aj zníženie proliferačných procesov a zvýšenie expresie markerov apoptózy ako trvanie a závažnosť klinických prejavov ochorenia sa zvýšil.

nešpecifická ulcerózna kolitída

markery apoptózy a proliferácie

1. Aruin L.I., Kapuller L.L., Isakov V.A. Morfologická diagnostika chorôb žalúdka a čriev. – M.: Triada-X, 1998. – 496 s.

2. Gastroenterológia a hepatológia: diagnostika a liečba: príručka pre lekárov / ed. A.V. Kalinina, A.F. Loginová, A.I. Khazanova. – 2. vyd., prepracované. a dodatočné – M.: MEDpress-inform, 2011. – 864 s.: chor.

3. Brown D. Gatter K. Monoklonálna protilátka Ki-67: jej použitie v histopatológii // Histopatológia. – 1990. – č.17. –

4. Bruno S., Darynkiewich Z. Expresia a stabilita jadrového proteínu závislá od bunkového cyklu detekovaná protilátkou Ki-67 v bunkách HL-60 // Bunka. Prolife. – 1992. – č.25. –

5. Porovnanie proliferačných markerov (BrdUrd, Ki-67, PCNA) stanovených v každej polohe buniek v kryptách normálnej ľudskej sliznice hrubého čreva / M. Bromley, D. Rew, A. Becciolini

a kol. //Eur. J. Histochem. – 1996. – Zv. 40. – S. 89–100.

6. Holt P.R., Moss S.F., Kapetanakis A.M. Je Ki-67 lepším proliferatívnym markerom v hrubom čreve ako jadrový antigén proliferujúcej bunky? Rakovina. Epidimiol // Biomarkery. Predch. – 1997. –

č. 6. – S. 131–135.

7. McCormick D., Chong C., Hobbs C. a kol. Detekcia antigénu Ki-67 vo fixovanom a voskom zaliatom reze s monoklonálnou protilátkou MIB-1 // Histopatológia. – 1993. –

č. 22. – S. 355–360.

8. Reed J. C. Bcl-2 a regulácia programovanej bunkovej smrti // J. Cell. Biol. – 1994. – Zv. 124. – S. 1–6.

Nešpecifická ulcerózna kolitída (UC) je jedným z najzávažnejších ochorení gastrointestinálneho traktu, ktoré vedie k invalidite a smrti pacientov.

V posledných desaťročiach došlo v rôznych krajinách sveta k nárastu výskytu UC, čo je do značnej miery spôsobené zlepšenou diagnostikou tohto patologického procesu.

V súčasnosti diagnostika UC využíva integrovaný prístup pomocou röntgenových, endoskopických a histologických metód výskumu. Jedným z perspektívnych spôsobov hodnotenia stavu sliznice hrubého čreva je imunohistochémia so stanovením markerov proliferácie a apoptózy.

Spomedzi metód imunohistochemického výskumu sa najviac používajú markery apoptózy bcl a p53. Je známe, že proteíny z rodiny bcl sú buď induktory apoptózy (Bad, Bax, Bak, atď.) alebo inhibítory apoptózy (Bcl-2, Bcl-XL, BOO, atď.). Treba poznamenať, že proteín p53 sa deteguje v mnohých transformovaných bunkách. Jeho funkcie sú zamerané na zabránenie prenosu poškodenej genetickej informácie z jednej generácie buniek do druhej, a to aj prostredníctvom iniciácie apoptózy. Vysoký obsah p53 vedie k zvýšeniu koncentrácie Bax v bunke a zníženiu koncentrácie bcl-2, čo podporuje bunkovú smrť apoptózou.

Ako markery proliferácie sa používa niekoľko antigénov. Nukleárny antigén proliferujúcich buniek (PCNA) sa podieľa nielen na proliferácii buniek, ale aj na oprave DNA po poškodení, čo robí tento antigén podmienečne špecifickým pre bunkový cyklus, pretože oprava DNA sa môže vykonávať v pokojovej fáze. Ďalším antigénom spoľahlivo spojeným s fázami bunkového cyklu je Ki-67. Expresia tohto proteínu nastáva počas presyntetickej fázy, zvyšuje sa počas bunkového cyklu a prudko klesá počas mitotickej fázy. Tento proteín sa na rozdiel od PCNA nepodieľa na oprave DNA. Expresia Ki-67 umožňuje identifikovať bunky vo všetkých fázach bunkového cyklu okrem pokojovej fázy.

Účelom štúdie je analyzovať expresiu markerov apoptózy a proliferácie u pacientov s ulceróznou kolitídou v závislosti od trvania, závažnosti ochorenia a lokalizácie zápalového procesu.

Materiály a metódy výskumu

Hlavnú skupinu tvorilo 61 pacientov s UC vo veku od 19 do 66 rokov (27 žien a 34 mužov), porovnávaciu skupinu - 15 prakticky zdravých ľudí. Pacienti boli vyšetrovaní klinickými, laboratórnymi, endoskopickými, morfologickými metódami, ako aj imunohistochemickým vyšetrením biopsií sliznice hrubého čreva.

Pacienti s UC boli rozdelení do skupín v závislosti od závažnosti klinických prejavov, trvania ochorenia a lokalizácie zápalového procesu.

Proliferatívna aktivita buniek bola stanovená proliferatívnym indikátorom Ki-67 pomocou vzorca:

Kde X- počet jadier v zornom poli mikroskopu. Počítanie sa uskutočnilo v najmenej 10 zorných poliach.

Apoptóza bola hodnotená expresiou proteínov p53 a BAX v povrchovom a glandulárnom epiteli hrubého čreva. Na posúdenie regeneračných procesov v sliznici hrubého čreva pri UC bola stanovená expresia rakovinového embryonálneho antigénu (CEA).

Výsledky výskumu a diskusia

Imunohistochemická štúdia stanovila závislosť expresie týchto markerov od trvania UC, závažnosti jej klinických prejavov a prevalencie zápalového procesu v hrubom čreve.

Pri štatistickom spracovaní získaných údajov po testovaní rovnosti rozptylov a normality rozdelenia sa dokázalo, že vzorka nezodpovedá zákonu normálneho rozdelenia, preto boli na porovnanie skupín použité neparametrické kritériá. Na opis kvantitatívnych charakteristík sa použili medián, horný a dolný kvartil.

Takže u zdravých jedincov bol Ki-67 PI 54 (46;67), čo naznačuje vysokú proliferatívnu aktivitu buniek hrubého čreva (tabuľka).

Index proliferácie Ki-67 epitelových buniek sliznice hrubého čreva (%) u zdravých ľudí a pacientov s ulceróznou kolitídou v závislosti od jej trvania, závažnosti a lokalizácie

Poznámky:

• R 0 - významnosť rozdielov s kontrolnou skupinou;
• R 1 - významnosť rozdielov s trvaním ochorenia menej ako 1 rok;
• R 2 - významnosť rozdielov s miernym priebehom ochorenia;
• R 3 - významnosť rozdielov s distálnou lokalizáciou ochorenia.

Expresia BAX u zdravých jedincov chýbala v 80 % prípadov a v 20 % bola nízka expresia markera. Expresia CEA bola pozorovaná v 50 % prípadov a bola tiež nízka.

Všetci pacienti boli v závislosti od dĺžky ochorenia rozdelení do 3 skupín: 1. s UC trvajúcou do 1 roka, 2. s trvaním od 1 do 5 rokov a 3. – viac ako 5 rokov.

Ako vyplýva z tabuľky, nárast Ki-67 PI v skupine pacientov s trvaním ochorenia od 1 do 5 rokov v porovnaní so skupinou 1 ( R≤ 0,02), možno vysvetliť zvýšenou proliferatívnou aktivitou buniek, ktorá odráža reparačné procesy v sliznici hrubého čreva. Nízky Ki-67 PI v skupine pacientov s ulceróznou kolitídou trvajúcou do 1 roka, dosahujúci 31(25;36), môže naznačovať výrazný pokles proliferatívnych procesov v sliznici čreva na začiatku ochorenia.

Pri štúdiu indikátora p53 v závislosti od dĺžky ochorenia sa nezistil žiadny vzor expresie tohto proteínu, je však rozdiel v expresii tohto markera medzi skupinou zdravých jedincov a skupinou pacientov s dĺžkou ochorenia od 1 roka do 5 rokov ( R≤ 0,05) a viac ako 5 rokov ( R ≤ 0,03).

Expresia BAX bola detegovaná v povrchovom aj glandulárnom epiteli hrubého čreva. Zistilo sa, že expresia tohto markera v povrchovom epiteli a v epiteli žliaz je v každom jednotlivom prípade takmer rovnaká. Expresia BAX u pacientov s UC bola zistená v 100 % prípadov medzi porovnávacou skupinou a pacientmi s UC boli zistené štatisticky významné rozdiely v expresii markerov (; R ≤ 0,01).

Pri porovnaní intenzity expresie CEA bol zaznamenaný významný nárast so zvyšujúcim sa trvaním ochorenia. V porovnávacej skupine sa expresia CEA prejavila len v ojedinelých prípadoch ( R ≤ 0,003).

V závislosti od závažnosti klinických prejavov UC boli zistené aj zmeny Ki-67 PI (pozri tabuľku). Ki-67 PI sa znížil u pacientov so stredne ťažkým ochorením ( R≤ 0,05) a ťažká forma ( R≤ 0,02) v porovnaní s pacientmi s miernym priebehom bol tiež rozdiel medzi skupinou zdravých jedincov a pacientmi s UC akejkoľvek závažnosti ( R ≤ 0,004).

Zmeny v expresii markera p53 záviseli od závažnosti exacerbácie (12,5 % pre miernu, 35,7 % pre stredne závažnú a 50 % pre závažnú). Štatisticky významné rozdiely boli získané medzi skupinami zdravých jedincov a pacientmi so stredne ťažkou a ťažkou formou UC ( R ≤ 0,03).

BAX a CEA boli exprimované v 100 % prípadov, nebola však zistená závislosť intenzity expresie týchto markerov od závažnosti klinických prejavov UC. Rozdiely v expresii markerov boli stanovené medzi porovnávacou skupinou a pacientmi s UC, bez ohľadu na závažnosť klinických prejavov (p≤0,01).

Pri analýze závislosti Ki-67 PI od lokalizácie zápalového procesu sa zistilo významné zvýšenie expresie markerov v skupine pacientov s UC v porovnaní so zdravými ľuďmi ( R≤ 0,002), avšak v porovnávacej analýze v rámci hlavnej skupiny neboli získané žiadne štatisticky významné rozdiely medzi expresiou markerov a rôznymi lokalizáciami procesu ( R ≥ 0,05).

Expresia p53 sa nezistila u všetkých pacientov. U pacientov s distálnou kolitídou bol pozitívny výsledok dosiahnutý len v 20 % prípadov, s ľavostrannou kolitídou u 18 % pacientov. Pri celkovom poškodení čreva bola expresia p53 zistená v 100 % prípadov ( R≤ 0,03 v porovnaní s distálnou kolitídou). Je potrebné poznamenať, že expresia bola najintenzívnejšia v oblastiach so známkami epitelovej metaplázie.

Intenzita expresie BAX v skupine s celkovou kolitídou bola signifikantne vyššia ako pri distálnej kolitíde ( R ≤ 0,03).

Expresia CEA nezávisela od lokalizácie zápalového procesu, ale bola signifikantne vyššia u pacientov s UC v porovnaní s porovnávacou skupinou ( R ≤ 0,03).

Pri nešpecifickej ulceróznej kolitíde je proliferatívna aktivita epiteliálnych buniek sliznice hrubého čreva výrazne nižšia a miera apoptózy je vyššia ako pri absencii zápalových zmien.

Predĺženie trvania nešpecifickej ulceróznej kolitídy je sprevádzané nízkou proliferatívnou aktivitou epitelu sliznice hrubého čreva, čo môže zhoršiť jeho reparáciu.

So zvyšujúcou sa závažnosťou klinických prejavov ulceróznej kolitídy dochádza nielen k zníženiu stupňa proliferačnej aktivity epiteliálnych buniek hrubého čreva, ale aj k zvýšeniu rýchlosti aktivácie apoptózy.

Keď sa zápalový proces rozšíri do proximálnych častí hrubého čreva, zistilo sa zvýšenie rýchlosti apoptózy.

Recenzenti:

Shvarts Yu.G., doktor lekárskych vied, profesor, vedúci. Katedra fakultnej terapie Štátnej lekárskej univerzity v Saratove pomenovaná po V.I. Razumovského“ Ministerstvo zdravotníctva a sociálneho rozvoja Ruska, Saratov;

Fedorina T.A., doktorka lekárskych vied, profesorka, prednosta. Katedra všeobecnej a klinickej patológie: patologická anatómia, patologická fyziológia, Štátna lekárska univerzita v Samare, Ministerstvo zdravotníctva a sociálneho rozvoja Ruska, Samara.

Dielo obdržala redaktorka 9.12.2011.

Bibliografický odkaz

CAD (kaspázou aktivovaná DNáza) na fragmenty veľkosti násobkov 180-200 nukleotidov. V dôsledku apoptózy vznikajú apoptotické telieska - membránové vezikuly obsahujúce neporušené organely a fragmenty jadrového chromatínu. Tieto telá sú pohltené susednými bunkami alebo makrofágmi prostredníctvom fagocytózy. Pretože extracelulárna matrica nie je ovplyvnená bunkovými enzýmami, dokonca ani pri veľkom počte apoptotických buniek nie je pozorovaný zápal.

Proces apoptózy je nevyhnutný pre fyziologickú reguláciu počtu telesných buniek, pre deštrukciu starých buniek, pre tvorbu lymfocytov, ktoré nereagujú na svoje antigény (autoantigény), pre jesenný opad listov rastlín, pre cytotoxický účinok zabíjačských T-lymfocytov, na embryonálny vývoj organizmu (miznutie kožných membrán medzi prstami u vtáčích embryí) a iné.

Narušenie normálnej bunkovej apoptózy vedie k nekontrolovanej bunkovej proliferácii a objaveniu sa nádoru.

1. Význam apoptózy

Apoptóza je neoddeliteľnou súčasťou života väčšiny mnohobunkových organizmov. Hrá obzvlášť dôležitú úlohu v procesoch vývoja. Napríklad končatiny tetrapodov sú tvorené ako rýľovitý výrastok a k tvorbe prstov dochádza v dôsledku odumierania buniek medzi nimi. Bunky, ktoré už nie sú potrebné, tiež podliehajú apoptóze, takže chvost u pulcov je počas metamorfózy obzvlášť zničený. V nervovom tkanive stavovcov počas embryonálneho vývoja viac ako polovica neurónov odumiera apoptózou hneď po vytvorení.

Apoptóza je tiež súčasťou systému kontroly „kvality“ buniek, umožňuje ničiť tie, ktoré sú nesprávne umiestnené, poškodené, nefunkčné alebo pre telo potenciálne nebezpečné. Príkladom sú B-lymfocyty, ktoré odumierajú, ak nenesú užitočné receptory špecifické pre antigén alebo sú autoreaktívne. Väčšina lymfocytov aktivovaných počas infekcie tiež odumiera prostredníctvom apoptózy po jej prekonaní.

V dospelých organizmoch súčasná regulácia bunkovej proliferácie a apoptózy umožňuje zachovať veľkosť celého jedinca a jeho jednotlivých orgánov. Napríklad po podaní lieku fenobarbital, ktorý stimuluje proliferáciu hepatocytov, sa pečeň potkanov zväčší. Ihneď po ukončení pôsobenia tejto látky však všetky nadbytočné bunky podstúpia apoptózu, čo spôsobí návrat pečene do normálnej veľkosti.

Apoptóza sa vyskytuje aj vtedy, keď bunka „vycíti“ veľké množstvo vnútorného poškodenia, ktoré nedokáže opraviť. Napríklad v prípade poškodenia DNA sa bunka môže premeniť na rakovinovú, aby tomu zabránila, za normálnych podmienok „spácha samovraždu“. Veľký počet buniek infikovaných vírusmi tiež odumiera apoptózou.

2. Markery apoptotických buniek

Markery apoptózy

Detekcia fragmentácie DNA v apoptotických bunkách pomocou metódy TUNEL Vzorka myšacieho pečeňového tkaniva, jadro apoptotickej bunky je hnedej farby, optická mikroskopia.

Detekcia fragmentácie DNA v apoptotických bunkách pomocou elektroforézy na agarózovom géli. Vľavo: DNA izolovaná z apoptotických buniek – je viditeľný „rebrík DNA“; stred: značky; prípad: kontrolná vzorka DNA z neošetrených buniek. Bunková línia H4IIE (potkaní hepatóm), induktor apoptózy - paraquat, vizualizácia pomocou etídium bromidu.

Hore: detekcia kondenzácie a fragmentácie chromatínu farbením fluorescenčným farbivom (Hoechst 34580). Stred: detekcia translokácie fosfadidylserínu do vonkajšej vrstvy plazmalemy farbením Annexinom V. Dole: Mikrosnímka apoptotických buniek v jasnom poli. Bunková línia - Jurkat, induktor apoptózy - TRAIL, konfokálny a svetelná optická mikroskopia.

Bunky, ktoré odumierajú apoptózou, možno rozpoznať podľa množstva morfologických charakteristík. Stávajú sa menšie a hustejšie (pyknóza), zaoblené a strácajú pseudopódia, cytoskelet v nich je zničený, jadrová membrána sa rozpadá, chromatín kondenzuje a fragmentuje. Na povrchu buniek sa objavuje veľké množstvo vezikúl, ak sú bunky dostatočne veľké, rozpadajú sa na fragmenty obklopené membránami – apoptotické telieska.

V apoptotických bunkách dochádza okrem morfologických aj k veľkému množstvu biochemických zmien. Časti DNA sú štiepené špeciálnymi nukleázami v spojovacích oblastiach medzi nukleozómami na fragmenty rovnakej dĺžky. Preto pri separácii všetkej DNA z apoptotickej bunky pomocou elektroforézy možno pozorovať charakteristický „rebrík“. Ďalšou metódou na detekciu fragmentácie DNA je označenie jej voľných koncov pomocou metódy TUNEL ( T erminálna deoxynukleotidyltransferáza d U TP n ick e nd l abeling ) .

Plazmatická membrána apoptotických buniek tiež prechádza zmenami. Za normálnych podmienok je negatívne nabitý fosfolipid fosfatidylserín obsiahnutý iba vo svojej vnútornej (vrátenej do cytosólovej) vrstvy, ale počas apoptózy „preskočí“ do vonkajšej vrstvy. Táto molekula slúži ako signál „zjedz ma“ blízkym fagocytom. Pohltenie apoptotických buniek vyvolané fosfatidylserínom, na rozdiel od iných typov fagocytózy, nemá za následok uvoľnenie zápalových mediátorov. Opísaná zmena plazmalemy je základom ďalšej metódy identifikácie buniek, ktoré odumierajú apoptózou - farbenie anexínom V, ktorý sa špecificky viaže na fosfatidylserín.

3. Kaspáza – mediátory apoptózy

Bunkové systémy, ktoré sprostredkúvajú apoptózu, sú podobné u všetkých zvierat, pričom rodina kaspázových proteínov zaujíma centrálne miesto. Kaspázy sú proteázy, ktoré majú cysteínový zvyšok v aktívnom centre a štiepia svoje substráty na špecifický zvyšok kyseliny asparágovej (odtiaľ názov: c od cysteín A asp od kyselina asparágová). Kaspázy sa v bunke syntetizujú ako neaktívne prokaspázy, ktoré sa môžu stať substrátmi pre iné, už aktivované kaspázy, ktoré ich rozrežú na jednom alebo dvoch miestach na aspartátovom zvyšku. Dva vytvorené fragmenty - väčší a menší - sú navzájom spojené a vytvárajú dimér, ktorý sa spája s rovnakým stmievačom. Takto vytvorený tetramér je aktívna proteáza, ktorá môže štiepiť substrátové proteíny. Okrem oblastí zodpovedajúcich hlavným a vedľajším podjednotkám prokaspázy niekedy obsahujú aj inhibičné prodomény, ktoré sú po štiepení degradované.

V dôsledku štiepenia a aktivácie niektorých kaspáz inými sa vytvára protealytická kaskáda, ktorá výrazne zosilňuje signál a od určitého bodu robí z apoptózy nezvratný proces. Tie prokaspázy, ktoré začínajú túto kaskádu, sa nazývajú iniciátory a ich substráty sa nazývajú efektory. Po aktivácii môžu efektorové kaspázy štiepiť iné efektorové prokaspázy alebo cieľové proteíny. Medzi ciele efektorových kaspáz, ktoré sú zničené pri apoptóze, patria najmä proteíny jadrovej laminy, ktorých rozpad vedie k rozpadu tejto štruktúry. Proteín tiež degraduje a za normálnych podmienok inhibuje endonukleázy CAD, čo vedie k fragmentácii DNA. Kaspázy a cytoskeletálne a intercelulárne adhézne proteíny sa štiepia, čo spôsobuje, že sa apoptotické bunky zaobľujú a oddeľujú od susedných buniek, a tak sa stávajú ľahšími cieľmi pre fagocyty.

Súbor kaspáz potrebných na apoptózu závisí od typu tkaniva a dráhy, ktorou sa aktivuje bunková smrť. Napríklad u myší, keď je gén kódujúci efektorovú kaspázu-3 „vypnutý“, apoptóza sa nevyskytuje v mozgu, ale normálne sa vyskytuje v iných tkanivách.

Gény prokaspázy sú aktívne v zdravých bunkách, a preto sú proteíny neustále prítomné, aby došlo k apoptóze, len ich aktivácia je potrebná na spustenie bunkovej samovraždy. Iniciačné prokaspázy zahŕňajú dlhú prodoménu obsahujúcu CARD ( doména náboru kaspázy , doména náboru Caspase). CARD umožňuje iniciačným prokaspázam viazať sa na adaptorové proteíny a vytvárať aktivačné komplexy, keď bunka prijme signál, ktorý stimuluje apoptózu. V aktivačných komplexoch sa niekoľko molekúl prokaspázy ocitne vo vzájomnej tesnej blízkosti, čo im stačí na to, aby vstúpili do aktívneho stavu, po ktorom sa navzájom seknú.

Dve najlepšie študované signálne dráhy na aktiváciu kaspázovej kaskády v cicavčích bunkách sa nazývajú vonkajšia a vnútorná (mitochondriálna), pričom každá z nich používa svoje vlastné iniciačné prokaspázy.

4. Cesty na aktiváciu apoptózy

4.1. Vonkajšia cesta

Bunka môže prijímať signál indukujúci apoptózu zvonku, napríklad z cytotoxických lymfocytov. V tomto prípade sa aktivuje tzv. externá cesta ( vonkajšia cesta), Počnúc receptormi smrti. Receptory smrti sú transmembránové proteíny, ktoré patria do rodiny receptorov faktora nekrózy nádorov (TNF), ako je samotný receptor TNF a receptor smrti Fas. Tvoria homotriméry, v ktorých má každý monomér extracelulárnu doménu viažucu ligand, transmembránovú doménu a doménu cytoplazmatickej smrti a priťahuje a aktivuje prokaspázy prostredníctvom adaptorových proteínov.

Ligandy receptorov smrti sú tiež homotriméry. Sú navzájom príbuzné a patria do rodiny signálnych molekúl tumor nekrotizujúceho faktora. Napríklad cytotoxické lymfocyty nesú na svojom povrchu ligandy Fas, ktoré sa môžu viazať na receptory smrti Fas na plazmaleme cieľových buniek. V tomto prípade sú intracelulárne domény týchto receptorov spojené s adaptorovým proteínom ( FADD, doména smrti spojená s Fas ), A tie zase priťahujú iniciačné prokaspázy 8 a/alebo 10. V dôsledku tejto série udalostí sa vytvorí signálny komplex vyvolávajúci smrť - DISC ( signálny komplex vyvolávajúci smrť ). Po aktivácii v tomto komplexe iniciačné kaspázy prerušia efektorové prokaspázy a spúšťajú apoptotickú kaskádu.

Mnohé bunky syntetizujú molekuly, ktoré ich do určitej miery chránia pred aktiváciou vonkajšej dráhy apoptózy. Príkladom takejto ochrany môže byť expresia takzvaných návnadových receptorov ( návnadové receptory), ktorý má extracelulárne domény viažuce ligand, ale nie domény cytoplazmatickej smrti, a preto nemôže spustiť apoptózu a súťažiť s konvenčnými receptormi smrti o ligandy. Bunky môžu tiež produkovať proteíny, ktoré blokujú vonkajšiu apoptotickú dráhu, ako je FLIP, ktorý je svojou štruktúrou podobný prokaspázam 8 a 10, ale nemá proteolytickú aktivitu. Inhibuje väzbu iniciačných prokaspáz na komplex DISC.

4.2. Vnútorná cesta

Apoptozóm

Apoptóza môže byť spustená aj zvnútra bunky, napríklad poranením, poškodením DNA, nedostatkom kyslíka, živín alebo signálmi extracelulárneho prežitia. U stavovcov sa táto signálna dráha nazýva vnútorná ( vnútorná dráha) Alebo mitochondriálne, kľúčovou udalosťou v ňom je uvoľnenie určitých molekúl z medzimembránového priestoru mitochondrií. Pred takýmito molekulami zocremu je citchróm c, ktorý vo väčšine prípadov prichádza do elektrónového transportného lancínu mitochondrií, proteín v cytoplazme má ďalšiu funkciu - prichádza na adaptorový proteín Apaf ( apoptotický faktor aktivujúci proteázu-l ), čo spôsobí, že sa oligomerizuje do kolesovej sedemčlennej štruktúry nazývanej apoptozóm. Apoptozóm získava a aktivuje iniciátor prokaspázu-9, ktorý potom môže aktivovať iniciátor prokaspázu.

V niektorých bunkách musí vonkajšia apoptózová dráha aktivovať vnútornú apoptózovú dráhu, aby bunku účinne zabila. Vnútorná dráha je prísne regulovaná proteínmi rodiny Bcl-2.

4.2.1. Regulácia vnútornej dráhy proteínmi rodiny Bcl-2

Rodina Bcl-2 zahŕňa evolučne konzervované proteíny, ktorých hlavnou funkciou je regulácia uvoľňovania cytochrómu c a iných molekúl z medzimembránového priestoru mitochondrií. Medzi nimi sú proapoptotické a antiapoptotické molekuly, ktoré môžu navzájom interagovať v rôznych kombináciách, potláčať sa navzájom, rovnováhu medzi svojimi aktivitami a určovať osud bunky.

V súčasnosti je známych asi 20 proteínov z tejto rodiny, z ktorých všetky obsahujú aspoň jednu zo štyroch alfa-helikálnych Bcl2 homologických domén, nazývaných BH1-4 ( bcl2 homológia). Antiapoptotické proteíny rodiny Bcl2 obsahujú všetky štyri domény, vrátane Bcl-2 samotnej, ako aj Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 a ​​A1. Proapoptotické proteíny sa delia do dvoch skupín, pričom členovia prvej z nich obsahujú tri BH domény (BH1-3), konkrétne Bak, Bax a Bok (posledná je exprimovaná iba v tkanivách reprodukčných orgánov). Najpočetnejšia z rodiny Bcl-2 je druhá skupina proapoptotických proteínov, ktoré obsahujú iba doménu BH3 (len BH3), sem patria Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

Za normálnych podmienok (t.j. keď bunka neprechádza apoptózou) sa antiapoptotické proteíny ako Bcl-2 a Bcl-XL viažu na proapoptotické proteíny BH123 (Bax a Bak) a bránia im v polymerizácii vo vonkajších mitochondriách. membrána na vytvorenie pórov. V dôsledku pôsobenia určitého apoptotického podnetu sa v bunke aktivujú alebo začnú syntetizovať proapoptotické proteíny obsahujúce len doménu BH3. Na druhej strane inhibujú antiapoptotické proteíny, čím odstraňujú inhibičný účinok na Bak a Bax, alebo s nimi priamo interagujú a podporujú ich oligomerizáciu a tvorbu pórov. V dôsledku permeabilizácie vonkajšej membrány sa cytochróm c, ako aj ďalšie mediátory apoptózy, ako je AIF, dostávajú do cytosólu. faktor indukujúci apoptózu ).

Napríklad, keď v bunke chýbajú signály prežitia, expresia BH3 proteínu Bim sa aktivuje prostredníctvom MAP kinázy JNK, ktorá spúšťa vnútornú dráhu apoptózy. V prípade poškodenia DNA sa hromadí tumor supresor p53, ktorý stimuluje transkripciu génov kódujúcich BH3 proteíny Puma a Noxa, ktoré sprostredkúvajú aj apoptózu. Ďalší proteín BH3, Bid, poskytuje spojenie medzi vonkajšou a vnútornou dráhou apoptózy. Po aktivácii receptorov smrti a v dôsledku toho kaspázy-8, kaspáza-8 štiepi Bid za vzniku skrátenej formy tBid (skrátený Bid), ktorá sa presúva do mitochondrií, kde potláča Bcl-2.