Princip i postupak određivanja stadija vi hemaglutinacije. Reakcija neizravne hemaglutinacije

reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI)

RHA se temelji na sposobnosti crvenih krvnih stanica da se lijepe zajedno kada se na njih adsorbiraju određeni antigeni. Kao testni materijal za hemaglutinaciju koriste se alantoisna i amnionska tekućina, suspenzija korioalantoisnih membrana pilećih embrija, suspenzije i ekstrakti kultura ili organa životinja zaraženih virusima te nativni infektivni materijal. RGA nije serološki, jer se javlja bez sudjelovanja imunološkog seruma i koristi se za odabir radnog razrjeđenja antigena za izvođenje RGA ili prisutnost antigena (virusa) u ispitivanom materijalu (na primjer, za influencu). U reakciji se koriste crvena krvna zrnca životinja, ptica i ljudi I. krvne grupe (0).

Za postavljanje približnog RGA, kap 5%-tne suspenzije crvenih krvnih stanica i kap ispitivanog materijala nanesu se na predmetno staklo i dobro promiješaju. Ako je nalaz pozitivan, nakon 1-2 minute makroskopski se uočava pojava flokulentne aglutinacije eritrocita.

Za postavljanje RGA u nesavijeni red u jažice polistirenskih ploča pripremaju se dvostruko veća razrjeđenja ispitivanog materijala u fiziološkoj otopini u volumenu od 0,5 ml. U sve epruvete dodaje se 0,5 ml 0,25 - 1% suspenzije crvenih krvnih stanica. Rezultati se uzimaju u obzir nakon potpune sedimentacije eritrocita u kontroli (eritrociti + fiziološka otopina). Reakcija se uzima u obzir prirodom sedimenta eritrocita. U pozitivnim slučajevima stupanj aglutinacije označen je plusevima. Reakcija koja izgleda kao tanki film ljepljivih crvenih krvnih zrnaca koji prekriva dno epruvete (kišobran) ocjenjuje se s četiri plusa; reakcija s prazninama u filmu označava se s tri plusa; prisutnost filma s nazubljenom čipkom rubovi ljepljivih crvenih krvnih stanica označeni su s dva plusa; jednom plusu odgovara flokulentan sediment crvenih krvnih stanica okružen zonom aglutiniranih grudica eritrocita. Oštro definiran sediment eritrocita koji se ne razlikuje od kontrole ukazuje na odsutnost aglutinacije. Za titar se uzima maksimalno razrjeđenje ispitivanog materijala koje je izazvalo aglutinaciju eritrocita za dva plusa.

Ako je rezultat RHA pozitivan, ispitivanje se nastavlja, određujući tip izoliranog virusa pomoću reakcije inhibicije hemaglutinacije sa serumima specifičnim za tip.

RTGA se temelji na svojstvu antiseruma da suzbija virusnu hemaglutinaciju, budući da virus neutraliziran specifičnim antitijelima gubi sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica. Za probno tipiziranje virusa koristi se kapljična metoda na staklu. Da bi se definitivno utvrdio tip izoliranog virusa i titrirala antitijela u serumu, prošireni RTGA se stavlja u epruvete ili jažice. U tu svrhu pripremaju se dvostruka razrjeđenja seruma u fiziološkoj otopini i razlijevaju u 0,25 ml. U razrjeđenja seruma dodajte jednu kap materijala koji sadrži virus i jednu kap 1% suspenzije crvenih krvnih stanica.

Kod RTGA za određivanje tipa virusa koriste se tipospecifični serumi koji se dodaju jednakom volumenu radnog razrjeđenja antigena. Tip izoliranog virusa određuje se specifičnim imunološkim serumom koji je pokazao najveći titar protutijela na ovaj virus.

RGA i RTGA naširoko se koriste za dijagnostiku virusnih infekcija (krpeljni encefalitis, gripa itd.) kako bi se otkrila specifična protutijela i identificirali mnogi virusi prema njihovim antigenima.

Reakcija imunofluorescencije (RIF)

RIF se temelji na kombinaciji antigena bakterija, rikecija i virusa sa specifičnim antitijelima obilježenim fluorescentnim bojama (fluorescein izotiocijanat, rodamin, B-izoticijanit, lisatin rodamin B-200, sulfoklorid itd.) koja imaju reaktivne skupine (sulfoklorid, izotiocijanit). , itd.). Ove skupine se spajaju sa slobodnim amino skupinama molekula protutijela, koje ne gube svoj specifični afinitet za odgovarajući antigen kada se tretiraju fluorokromom. Rezultirajući kompleksi AG–AT postaju jasno vidljive, jarko blistave strukture pod fluorescentnim mikroskopom (Slika 48). RIF može otkriti male količine bakterijskih i virusnih antigena. Metoda RIF koristi se u dvije inačice: izravna i neizravna metoda.

Izravna metoda temelji se na izravnoj kombinaciji antigena s obilježenim protutijelom. Neizravna metoda temelji se na postupnom otkrivanju kompleksa AG–AT pomoću fluorescentnih boja. Prva faza je stvaranje imunoloških kompleksa specifičnog antigena sa specifičnim protutijelima. Druga faza je identifikacija ovog kompleksa tretiranjem obilježenim antigamaglobulinom.

Prednost RIF-a je jednostavnost, visoka osjetljivost i brzina dobivanja rezultata. RIF se koristi kao metoda za ranu ekspresnu dijagnozu gripe, dizenterije, malarije, kuge, tularemije, sifilisa itd. Za provođenje takve studije koristi se fluorescentni mikroskop.

Radioimunotest (RIA)

RIA je jedna od najosjetljivijih imunodijagnostičkih metoda. Koristi se za otkrivanje antigena virusa hepatitisa B u bolesnika s virusnim hepatitisom. Da biste to učinili, testnom se serumu dodaje referentni serum (serum koji sadrži antitijela na virus hepatitisa B). Smjesa se inkubira 1-2 dana na temperaturi od 40 °C, zatim se doda referentni antigen (antigen obilježen izotopom 125 J) i inkubacija se nastavi još 24 sata. Dobivenom kompleksu antigen-antitijelo dodaju se precipitirajući antiimunoglobulini protiv referentnih serumskih proteina, što dovodi do stvaranja precipitata (slika 49). Rezultat se uzima u obzir prisutnošću i brojem impulsa u talogu koje bilježi brojač. Ako u ispitivanom serumu postoji antigen koji se vezao na specifična protutijela, potonja ne stupaju u interakciju s obilježenim antigenom i stoga se ne detektira u precipitatu. Dakle, RIA se temelji na principu kompetitivne interakcije detektiranog antigena i poznate količine obilježenog antigena s aktivnim centrima protutijela.

Imunoenzimska metoda (ELISA)

Metoda se koristi za otkrivanje antigena pomoću njihovih odgovarajućih protutijela konjugiranih na enzim tag (peroksidaza hrena, b-galaktoza ili alkalna fosfataza). Nakon spajanja antigena s imunološkim serumom obilježenim enzimom, u smjesu se dodaju supstrat i kromogen . Supstrat se cijepa pomoću enzima, a produkti njegove razgradnje uzrokuju kemijsku modifikaciju kromogena. Pritom kromogen mijenja svoju boju - intenzitet boje je upravno proporcionalan broju vezanih molekula antigena i antitijela (slika 50).

Najčešća je čvrsta faza ELISA, u kojoj se jedna od komponenti imunološke reakcije (antigen ili protutijelo) adsorbira na čvrsti nosač. Polistirenske mikroploče koriste se kao čvrsti nosač. Pri određivanju protutijela u jažice s sorbiranim antigenom redom se dodaju serum krvi bolesnika, enzimom obilježeni antiglobulinski serum te mješavina otopina enzima i kromogenog supstrata. Svaki put nakon dodavanja druge komponente, nevezani reagensi se uklanjaju iz jažica temeljitim pranjem. Ako je rezultat pozitivan, mijenja se boja otopine kromogena.

Nosilac čvrste faze može se senzibilizirati ne samo antigenom, već i antitijelom. Potom se u jažice sa sorbiranim antitijelima dodaje željeni antigen, dodaje se imunološki serum protiv antigena obilježenog enzimom, a zatim se dodaje mješavina otopina supstrata za enzim i kromogen.

ELISA se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih virusnim i bakterijskim patogenima.

ODJELJAK VII. OSNOVE VIRUSOLOGIJE

Pravilno provedena krvna slika pomaže u otkrivanju uzročnika raznih složenih bolesti u tijelu u ranim fazama njihova razvoja, a ponekad i prije nego što se pojave klinički simptomi bolesti. Vrlo često liječnici propisuju pacijentima test reakcije aglutinacije. Zatim ćemo shvatiti što je to - RPGA test krvi, kada se koristi i što nam može reći?

Princip rada

Reakcija neizravne hemaglutinacije (također nazvana reakcija pasivne hemaglutinacije, također poznata kao RPHA, RNGA) događa se kada su crvene krvne stanice koje su adsorbirale antigen izložene imunološkom serumu koji odgovara danom antigenu.

Studije su dokazale da je ova metoda značajno superiorna u odnosu na druge serološke testove u pogledu specifičnosti i osjetljivosti. Stoga se često koristi za otkrivanje bolesti uzrokovanih bakterijama ili rikecijama. Antigeni za takvu analizu mogu biti bakterijski ekstrakti, pročišćeni antigeni raznih mikroba i komponente bakterijskih cjepiva.

Nakon što patogena bakterija uđe u ljudsko tijelo, počinje proizvoditi specifična i nespecifična protutijela, tvoreći specifičan imunološki odgovor. Kod sifilisa, čiji je uzročnik Treponema pallidum, koja spada u gram-negativne spirohete, u krvi čovjeka stvaraju se netreponemska ili treponemska protutijela. Na njihovoj identifikaciji temelje se laboratorijske dijagnostičke pretrage koje bi trebale potvrditi ili opovrgnuti prisutnost uzročnika virusa u tijelu.

Kod RPHA crvene krvne stanice, čija površina ima adsorbirane antigene treponeme pallidum, kada se doda serum s antitijelima na treponemu iz materijala osobe zaražene sifilisom, lijepe se jedna za drugu, odnosno aglutiniraju.

Pouzdanost studije

Važno je zapamtiti da se antitijela na blijedu spirohetu počinju pojavljivati ​​u tijelu zaraženih ljudi 2-4 tjedna nakon infekcije, au nekim slučajevima to se razdoblje može produžiti i do 6 tjedana.

Iz tog razloga, osjetljivost analize za RPHA u primarnoj fazi bolesti je oko 86%, što je značajno inferiorno u odnosu na točnost dijagnosticiranja pacijenata u sljedeće dvije faze. Osjetljivost analize za takve pacijente, kao i za nositelje latentnog sifilisa, doseže 99-100%.

Međutim, reakcija pasivne hemaglutinacije ima vrlo visoku specifičnost, koja doseže razinu od 96-100%.

To omogućuje korištenje ovog pregleda za potvrdu dijagnoze u slučaju pozitivne reakcije iz preliminarne netreponemske studije, na primjer, reakcija mikroprecipitacije raka mokraćnog mjehura.

S obzirom na to da osjetljivost treponemskih testova, uključujući RPGA, znatno premašuje osjetljivost netreponemskih metoda, takvi se pregledi sve češće propisuju pri provođenju testova probira na sifilis. Međutim, ako se dobije pozitivna reakcija testa probira, potrebna je još jedna specifična (treponemalna) analiza, ali ne RPGA, kako bi se razjasnila dijagnoza.

Transkript analize

Kada se serum s antitijelima na treponemu iz materijala osobe zaražene sifilisom doda reagensu s kojim se provodi studija, dolazi do aglutinacije crvenih krvnih stanica, zbog čega se talože.

Na broj ljepljivih crvenih krvnih stanica utječe razina antitijela u serumu. Stoga pasivna hemaglutinacija ne samo da pokazuje prisutnost protutijela, već vam također omogućuje određivanje njihove količine. Rezultat studije predstavljen je razinom titra antitijela.

Pozitivna reakcija ukazuje na prisutnost patogena u tijelu pacijenta. Međutim, tijekom dijagnostičkog procesa mogu se pojaviti lažno pozitivne reakcije čiji broj statistički ne prelazi razinu od 0,05-2,5% od ukupnog broja istraživanja.

Pozitivna RPHA reakcija kod ljudi koji nisu zaraženi sifilisom može se pojaviti ako:

• sistemske bolesti vezivnog tkiva,
• u krvi pacijenta antitijela na patogene slične Treponemi pallidum,
• fiziološke patologije, kao što je infarkt miokarda,
• hepatitis B ili C,
• onkološke bolesti,
• tifus, leptospiroza, tuberkuloza,
• HIV infekcije,
• borelioza krpeljne etiologije,
• opsežne ozljede ili prijelomi,
• trudnoća,
• u slučaju ubrizgavanja opojnih droga.

U većini slučajeva lažno pozitivne reakcije popraćene su niskim titrom. Visoki titri tipični su za sekundarni stadij bolesti i prethodno latentni sifilis. Međutim, mogu se pojaviti i tijekom lažno pozitivne reakcije u bolesnika s malignim neoplazmama.

Kod ljudi koji su barem jednom imali sifilis, RPHA reakcija ostaje pozitivna do kraja života.

Rijetke iznimke mogu biti one situacije kada je bolest identificirana u ranoj fazi razvoja, nakon čega je provedena intenzivna i učinkovita terapija. Stoga se RPGA analiza ne može koristiti za procjenu dinamike oporavka ili komparativnu dijagnozu ranih ili kasnih stadija bolesti.

Ako se dobije pozitivna reakcija, potrebno je pregledati članove obitelji oboljele osobe i osobe koje su s njim imale spolni kontakt.

Negativna reakcija može se dobiti u sljedećim slučajevima:

• osoba nema sifilis,
• krv je pogrešno uzeta za testiranje,
• Prošla su 2-4 tjedna od infekcije, a proizvodnja antitijela još nije počela.

U svakom slučaju, rezultat studije mora se procijeniti u kombinaciji s dodatnim laboratorijskim i anamnestičkim pokazateljima.

Kome je analiza indicirana?

Liječnik može uputiti pacijente da daju krv za RPHA u sljedećim slučajevima:

• u prisutnosti kliničkih manifestacija sifilisa: ulcerativni osip, povećani limfni čvorovi, difuzna alopecija i drugi,
• ako sumnjate na moguću infekciju u slučaju kontakta s već oboljelim osobama,
• darivatelji koji žele darovati krv,
• osobe koje su na godišnjim preventivnim pregledima ili izdaju zdravstvene svjedodžbe,
• pacijenti s pozitivnim testom probira,
• prije hospitalizacije u stacionarnoj bolnici,
• tijekom prijeoperativnog pregleda,
• identificirati uzročnike salmoneloze, difterije, dizenterije metodom RPGA s odgovarajućim dijagnostikumom.

Postupak provođenja studije

Uzorak venske krvi koji je dao pacijent šalje se na testiranje. Kako ne bi dobili pogrešan zaključak, pacijent bi trebao biti odgovoran u pripremi za analizu. Kako bi rezultati ispitivanja bili pouzdani, trebate se pridržavati sljedećih preporuka:

• Test treba uzeti samo na prazan želudac.
• Na dan analize možete piti mineralnu vodu bez plina u minimalnim količinama.
• Ne smijete pušiti najmanje 30 minuta prije analize, ali je bolje povećati ovo vrijeme na nekoliko sati.
• Uvedena je izravna zabrana konzumacije alkoholnih pića.
• Pacijenti koji trebaju redovito uzimati bilo koji lijek moraju o tome obavijestiti liječnika koji ih upućuje na pregled.
• Ako se ne osjećate dobro ili se ne osjećate dobro, morate o tome obavijestiti medicinsku sestru koja vadi krv ili liječnika u ambulanti u kojoj trebate obaviti pretragu.

Budite odgovorni ne samo prema pitanju gdje se testirati, već i prema pripremi za pregled.

Dijagnostika drugih zaraznih bolesti

Ne treba misliti da se studija kao što je RPGA može provesti samo za identifikaciju uzročnika sifilisa u tijelu.

Analiza s dijagnostikom salmonele omogućuje otkrivanje prisutnosti infekcije u probavnom sustavu - salmonele. Počevši od četvrtog dana nakon infekcije, tijelo proizvodi antitijela na antigene salmonele, koje RPGA metoda pomaže identificirati. Negativan rezultat ukazuje na odsutnost infekcije, a pozitivan titar, koji se povećava od 1:200 do 1:800 u akutnoj fazi, ukazuje na njezinu prisutnost.

Metoda izvođenja RPGA s markerom difterije omogućuje dijagnosticiranje difterije i procjenu imuniteta nakon cijepljenja. Protutijela imunološki sustav počinje proizvoditi već sljedeći dan nakon infekcije, a u tijelu ostaju nekoliko tjedana. Osjetljivost ove analize je bolja od bakteriološke metode istraživanja. Titar 1:80 potvrđuje prisutnost difterije u tijelu.

Dizenterijski marker za RPHA najpreciznije otkriva šigelozu (bakterijsku dizenteriju), čak i u usporedbi s laboratorijskom dijagnostičkom metodom bakterijskom kulturom. Ako pacijent ne dobije kvalitetno liječenje, bolest se razvija u kronični proces, u kojem se često javljaju recidivi. Analiza vam omogućuje dijagnosticiranje akutne i kronične faze proljeva, prepoznavanje uzročnika dizenterije, razlikovanje bakterijske šigeloze od kolorektalnog karcinoma, endokrinih poremećaja ili upale debelog crijeva. Negativna reakcija ukazuje na odsutnost bacila, a njegovu prisutnost potvrđuje titar 1:80 za djecu odnosno 1:320 za odrasle.

Provođenje testa s markerom ospica omogućuje određivanje bolesti ospica. Takav pregled može postati alternativa RTGA analizi koja se često izvodi za dijagnosticiranje ospica.

Dakle, RPGA test krvi - što je to? Ukratko, možemo sa sigurnošću reći da je ovo suvremena, visoko osjetljiva i pouzdana metoda za dijagnosticiranje različitih bolesti bakteriološke etiologije.

U kontaktu s

U laboratoriju se koriste dvije reakcije hemaglutinacije s različitim mehanizmima djelovanja.

Prvi RGA je serološki. U ovoj reakciji, crvene krvne stanice su aglutinirane u interakciji s odgovarajućim antitijelima (hemaglutinini). Reakcija se široko koristi za određivanje krvnih grupa.

Drugi RGA nije serološki. U njemu, prianjanje crvenih krvnih stanica nije uzrokovano

antitijela, već posebne tvari koje stvaraju virusi. Na primjer, virus influence aglutinira crvena krvna zrnca kokoši i zamoraca, a polio virus aglutinira crvena krvna zrnca ovaca. Ova reakcija omogućuje procjenu prisutnosti određenog virusa u materijalu koji se proučava.

Reakcija se provodi u epruvetama ili na posebnim pločama s jažicama. Materijal ispitan na prisutnost virusa razrijedi se izotoničnom otopinom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml svakog razrjeđenja pomiješa se s jednakim volumenom 1-2% suspenzije crvenih krvnih stanica. U kontroli se 0,5 ml eritrocita pomiješa s 0,5 ml izotonične otopine. Epruvete se stave u termostat na 30 minuta, a ploče se ostave na sobnoj temperaturi 45 minuta.

Računovodstvo za rezultate. Ako je reakcija pozitivna, na dnu epruvete ili jažice pojavi se talog crvenih krvnih stanica s nazubljenim rubovima („kišobran”) koji prekriva cijelo dno jažice. Ako je rezultat negativan, crvena krvna zrnca stvaraju gusti sediment s glatkim rubovima ("gumb"). Isti sediment treba biti i u kontroli. Intenzitet reakcije izražava se znakom “+”. Titar virusa je maksimalno razrjeđenje materijala u kojem dolazi do aglutinacije.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije

To je serološka reakcija u kojoj specifična antivirusna protutijela u interakciji s virusom (antigenom) neutraliziraju virus i oduzimaju mu sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica, odnosno inhibiraju reakciju hemaglutinacije. Ova reakcija vam omogućuje određivanje vrste i vrste virusa.

Postavljanje reakcije. 0,25 ml antivirusnog seruma pomiješa se s jednakim volumenom materijala koji sadrži virus. Smjesa se protrese i stavi u termostat na 30 minuta, nakon čega se doda 0,5 ml 1-2% suspenzije crvenih krvnih stanica.

Računovodstvo za rezultate. Ako je pokus pravilno izveden, treba formirati "gumb" u kontroli seruma i eritrocita - nema faktora aglutinacije eritrocita; u kontroli antigena formira se "kišobran" - virus je izazvao aglutinaciju crvenih krvnih stanica. Ako je serum homologan virusu koji se proučava, formira se "gumb" - serum je neutralizirao virus.

Reakcija neizravne hemaglutinacije

Neizravna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (RIHA) temelji se na činjenici da crvene krvne stanice, ako se topljivi antigen adsorbira na njihovoj površini, stječu sposobnost aglutinacije u interakciji s protutijelima na adsorbirani antigen.

Postavljanje reakcije. Serum se zagrijava 30 minuta na 56 °C, razrijedi sekvencijalno u omjeru 1:10 - 1:1280 i ulije u 0,25 ml epruvete ili jažice, gdje se zatim dodaju 2 kapi crvenih krvnih stanica s antigenima adsorbiranim na njima.

Kontrole: suspenzija eritrocita s antigenima adsorbiranim na njima s očito imunološkim serumom, suspenzija eritrocita s antigenima adsorbiranim na njima s normalnim serumom; suspenzija normalnih crvenih krvnih stanica s ispitnim serumom. U prvoj kontroli treba doći do aglutinacije, u drugoj i trećoj ne.

Kontrolna pitanja.

1. Što pokazuje pozitivan rezultat rendgenske analize između crvenih krvnih stanica i materijala koji se testira na prisutnost virusa?

2. Hoće li doći do reakcije aglutinacije crvenih krvnih stanica ako im se doda virus i njegov odgovarajući serum? Kako se zove reakcija koja otkriva ovu pojavu?

PRAKTIČNI RAD br.12.

Reakcija fiksacije komplementa.

Reakcija vezanja komplementa (FFR) temelji se na činjenici da specifični kompleks antigen-antitijelo uvijek adsorbira (veže) komplement na sebe.

Ova reakcija ima široku primjenu u identifikaciji antigena i serodijagnostici infekcija, posebice bolesti uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.

RKS je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sustava antigen-protutijelo. U biti, radi se o dvije serološke reakcije.

Desni glavni sustav sastoji se od antigena i antitijela (jedno je poznato, drugo nije). Dodana mu je određena količina komplementa. Ako se antigen i antitijelo ovog sustava podudaraju, oni će se povezati i vezati kompliment. Nastali kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.

Stvaranje ovog kompleksa detektira se pomoću drugog hemolitičkog ili indikatorskog sustava. Uključuje ovčje crvene krvne stanice (antigen) i odgovarajući hemolitički serum (antitijela), tj. gotovi imunološki kompleks. U ovom sustavu, liza crvenih krvnih stanica može se dogoditi samo u prisutnosti komplementa. Ako je komplement vezan prvim sustavom, tada u drugom sustavu neće doći do hemolize, jer bez slobodnog komplementa. Odsutnost hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu nalazi sediment eritrocita) bilježi se kao pozitivan rezultat RSC.

Ako u prvom sustavu antigen ne odgovara protutijelu, tada se imunološki kompleks neće formirati, a komplement će ostati slobodan. Ostajući slobodan, kompliment sudjeluje u drugom sustavu, uzrokujući hemolizu, rezultat RSC je negativan (sadržaj epruveta je proziran - "lakirana krv").

Komponente, reakcije fiksacije komplementa:

1. Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten,

rjeđe suspenzija mikroorganizama.

2. Antitijela - serum bolesnika.

3. Komplement - serum zamorca.

4. Antigen – ovčji eritrociti.

5. Antitijelo – hemolizin na ovčje eritrocite.

6. Izotonična otopina.

Zbog činjenice da je veliki broj složenih komponenti uključen u RSC,

prethodno ih je potrebno titrirati i unijeti u reakciju u točnim količinama i jednakim volumenima: 0,5 ili 0,25, rjeđe 0,2, 1,25 ili 1,0 ml (veći volumeni daju točniji rezultat). Titracija komponenti reakcije provodi se u istom volumenu kao i eksperiment, zamjenjujući sastojke koji nedostaju izotoničnom otopinom.

Sadržaj teme "Imunomodulatori. Imunodijagnostika zaraznih bolesti.":











Detaljna reakcija aglutinacije (RA). Za određivanje AT u krvnom serumu pacijenta, a ekstenzivna reakcija aglutinacije (RA). Da biste to učinili, nizu razrjeđenja krvnog seruma dodaje se dijagnostikum - suspenzija ubijenih mikroorganizama ili čestica s sorbiranim Ag. Maksimalno davanje razrjeđenja aglutinacija Ag se naziva serumski titar.

Vrste reakcija aglutinacije (RA) za otkrivanje AT - test kapi krvi na tularemiju (sa dijagnostikumom nanesenim na kap krvi i pojavom vidljivih bjelkastih aglutinata) i Huddlesonov test na brucelozu (sa dijagnostikumom obojenim encijan violetom nanesenim na kap krvi). serum).

Približna reakcija aglutinacije (RA)

Za identifikaciju izoliranih mikroorganizama, približna RA se stavlja na stakalce. Da biste to učinili, kultura patogena se dodaje kapi standardnog dijagnostičkog antiseruma (razrijeđenog 1:10, 1:20). Ako je rezultat pozitivan, provodi se detaljna reakcija s rastućim razrjeđenjima antiseruma.

Reakcija smatra se pozitivnim ako se aglutinacija uoči u razrjeđenjima bliskim titru dijagnostičkog seruma.

OAS. Somatski O-Ags stabilni su na toplinu i mogu izdržati vrenje 2 sata.U interakciji s AT stvaraju sitnozrnate agregate.

N-Ag. N-Ag (flagelati) su termolabilni i brzo se razgrađuju na 100 °C, kao i pod utjecajem etanola. U reakcijama s H-antiserumom, nakon 2 sata inkubacije, stvaraju se rastresite velike ljuskice (tvore ih bakterije koje se slijepe flagelama).

Vi-Ar bakterija tifusa je relativno stabilna na toplinu (podnosi temperature od 60-62 °C 2 sata); Kada se inkubira s Vi antiserumom, formira se fino zrnati aglutinat.

Reakcije izravne hemaglutinacije

Najjednostavniji od ovih reakcije - aglutinacija crvenih krvnih zrnaca ili hemaglutinacija, koja služi za određivanje krvnih grupa u ABO sustavu. Za određivanje aglutinacija(ili nedostatak istih) koristiti standardne antiserume s anti-A i anti-B aglutininima. Reakcija se naziva izravnom, budući da su Ag koje se proučavaju prirodne komponente crvenih krvnih stanica.

Zajednički sa izravna hemaglutinacija virusna hemaglutinacija ima mehanizme. Mnogi virusi sposobni su spontano aglutinirati eritrocite ptica i sisavaca; njihov dodatak suspenziji eritrocita uzrokuje stvaranje nakupina iz njih.

Čimbenici virulencije Salmonella typhoid uključuju Vi-antigen, koji je kapsularni polisaharid koji ih štiti od fagocitoze i komplementa. Vi antigen je odsutan u velikoj većini drugih salmonela. Zahvaljujući mikrokapsuli, S. typhi i S. paratyphi prianjaju na enterocite tankog crijeva. Nakon adhezije dolazi do djelomične kolonizacije sluznice. U tom slučaju većina salmonela ulazi u Peyerove mrlje i fagocitira ih makrofag, u kojem se aktivno razmnožava. Iz limfnih čvorova salmonele ulaze u opći limfni tok, a zatim u krv, uzrokujući bakterijemiju. S krvlju prodiru u koštanu srž i slezenu, naseljavaju određena područja tih organa i prenose se u žučni mjehur. Tamo se intenzivno razmnožavaju, jer je žuč njihov selektivni hranjivi medij. Sa žuči salmonele prodiru u dvanaesnik, a potom sekundarno u tanko crijevo i Peyerove mrlje, gdje se nalaze T-efektori HNL-a, oslobađajući citokine. To u konačnici dovodi do imunološke upale koja može rezultirati pucanjem stijenke crijeva i pojavom peritonitisa. Kada su salmonele uništene, oslobađa se endotoksin, nakon čega počinje intoksikacija tijela.

Imunitet

Kod trbušnog tifusa, kao rezultat humoralnog imunološkog odgovora, u krvnom serumu pojavljuju se različita protutijela (aglutinini, fiksatori komplementa i dr.) koja osiguravaju intenzivan imunitet. Osim toga, sekretorni imunoglobulini SIgA, koji pokrivaju sluznicu tankog crijeva, osiguravaju lokalni imunitet. Vjeruje se da tijekom trbušnog tifusa postoji i stanični imunološki odgovor kao rezultat stvaranja T-efektora HNL-a u Peyerovim mrljama.

Ekologija i epidemiologija

Trbušni tifus i paratifus su antroponoza, za razliku od ostalih salmoneloza koje spadaju u zooantroponozne infekcije. Izvor zaraze su bolesni ljudi, a posebno nositelji bakterija, koji dugi niz godina mogu predstavljati opasnost za druge. Prijenos infekcije događa se isključivo oralnim putem. Salmonela je relativno otporna na čimbenike okoliša. Dugo se zadržavaju (30-90 dana) u vodi otvorenih rezervoara, otpadnim vodama i tlu, gdje padaju s izmetom. Otopine za dezinfekciju (izbjeljivač i sl.) imaju štetan učinak na njih u roku od 2-3 minute.

Trbušni tifus i paratifus

Trbušni tifus i paratifus su akutne zarazne bolesti praćene bakterijemijom, dugotrajnom stalnom vrućicom, oštećenjem limfnih tvorevina crijeva, teškom intoksikacijom i fekalno-oralnim mehanizmom prijenosa. Uzročnici trbušnog tifusa su Salmonella typhi, paratifus A-S. paratifi A, paratifusi B-51 schottmuelleri, paratifusi CS. paratyphi C. Trbušni tifus i paratifus A tipične su antroponoze, a uzročnici paratifusa B i C, osim kod ljudi, mogu uzrokovati bolesti i kod životinja i ptica. Sve navedene bakterije pripadaju rodu Salmonella, obitelji Enterobacteriaceae. Bolesnici ili kliconoše izlučuju uzročnike fecesom, urinom i slinom. Na temelju kliničke slike gotovo je nemoguće razlikovati trbušni tifus od paratifusa. Konačna klinička dijagnoza može se postaviti tek nakon izolacije i identifikacije uzročnika.

Uzimanje materijala za istraživanje

Za uspješnu laboratorijsku dijagnostiku trbušnog tifusa i paratifusa važno je pravilno i pravovremeno uzimanje materijala za ispitivanje, ovisno o fazi patogeneze i vremenu trbušnog tifusa. Mikrobiološke studije za paratifus provode se na isti način kao i za trbušni tifus. Ako je moguće, ispitni materijal za izolaciju čiste kulture uzročnika treba uzeti prije početka antibiotske terapije. Najčešće se uzima krv, koštana srž, duodenalni sadržaj (žuč), eksudat iz rozeole, stolica, urin, gnoj, cerebrospinalna tekućina, presečni materijal u smrtnim slučajevima.

Bakteriološke metode istraživanja

Za ranu dijagnostiku trbušnog tifusa i paratifusa učinkovito je izolirati uzročnika iz krvi i koštane srži, a manjim dijelom iz žuči, urina, fecesa i drugih materijala za ispitivanje. Kultura bacila tifusa i paratifusa iz krvotoka ili koštane srži ima apsolutnu, 100% dijagnostičku vrijednost.

Metoda hemokulture

Pažljivo poštujući pravila asepse, krv pacijenta u količini od 10 ml uzima se štrcaljkom iz ulne vene u ranim stadijima (počevši od prvih sati bolesti) i uz bolesnikov krevet se sije u bočicu. sa 100 ml žučne juhe ili Rapoport medija (10% žučne juhe od 2% glukoze, 1% Andrade indikatora, prije sterilizacije u medij se stavi stakleni plovak za zadržavanje plina). Ako hemokultura nije moguća kod pacijenta uz krevet, u laboratorij se dostavlja u epruveti. Serum se odvaja od ugruška i koristi za serološke pretrage. Ugrušak se dobro zdrobi i nacijepi na istu podlogu u omjeru 1:10. Ovo razrjeđivanje je neophodno za uklanjanje baktericidnih svojstava krvi. U kasnijim razdobljima bolesti, u prisustvu groznice, potrebno je orati 15-20 ml krvi i sijati na 150-200 ml hranjivog medija. Žučne sredine su selektivne za patogene trbušnog tifusa i paratifusa. Kod male djece krv za inokulaciju uzima se iz ušne resice, pete ili nožnog prsta i to u manjim količinama.Cijepljene bočice se inkubiraju na 37°C.Drugi dan se proučava obrazac rasta. Ako nema rasta, boce se ostavljaju u termostatu do 10 dana, a ako se sumnja na L-forme do 3-4 tjedna. Sljedeći testovi na diferencijalnoj podlozi rade se nakon 48 i 72 godine, 5. i 10. dana. Salmonela trbušnog tifusa uzrokuje crvenilo Rapoportove juhe kao posljedicu fermentacije glukoze u kiselinu, a uzročnici paratifusa također uzrokuju nakupljanje plinova u plovku. . Kultura uzgojena u boci sije se na podlogu s tri kukuruza Olkenitsky i Endo (Ploskirev, Levin, bizmut-sulfitni agar). Ako je kultura čista (pod mikroskopom, gram-negativne šipke), nastavljaju raditi samo s Olkenitskyjevom podlogom.Cijepiva samo na Endo (ili drugim elektivnim podlogama) ispituju se u slučajevima kada na Olkenitskyjevom agaru raste nečista kultura, koja rijetko se događa. U ovom slučaju, tipične izolirane kolonije se potkulturiraju na Olkenitskyjevu podlogu (ili MPA kosi), dobiva se i identificira čista kultura. Kolonije sva tri uzročnika na podlogama Endo, Levin i Ploskirev su bezbojne, nježne, prozirne, a na bizmut-sulfitnom agaru su crne.

Metoda mijelokulture

U fazi parenhimske difuzije iz koštane srži mogu se izolirati uzročnici trbušnog i paratifusnog tifusa. Tehnika sternalne punkcije je sigurna za pacijenta, proširila je mogućnosti bakteriološke dijagnostike ovih bolesti. Mjesto uboda se tretira alkoholom i anestezira novokainom. Za prikupljanje materijala koristi se Beer igla s pokretnom spojnicom, koja vam omogućuje podešavanje dubine prodiranja igle. Nakon punkcije štrcaljkom se isiše 0,3-0,5 ml punktata iz grudne kosti i ubrizga u 5-10 ml žučnog bujona ili Rapoport medija. Izolacija čiste mijelokulture provodi se na isti način kao i hemokultura. Metoda mijelokulture daje pozitivne rezultate češće nego metoda hemokulture. Posebno se preporuča primjena kod blagih i suptilnih kliničkih oblika bolesti.

Metoda bikulture

Za bakteriološku pretragu žuči provodi se duodenalna intubacija. Najprije se kroz tanku sondu u duodenum ubrizga 30-40 ml 25% otopine magnezijevog sulfata. U laboratorij se dostavljaju epruvete s dvije ili tri porcije žuči (A i B, ili A, B, C). Svaki od obroka može se sijati zasebno ili se smjesa sva tri zajedno u količini od 5-10 ml sije u bočice s 50-100 ml selenitnog bujona ili Rapoport medija. Kiseli duodenalni sadržaj, njegova bjelkasta boja i prisutnost ljuskica čine materijal neprikladnim za bakteriološka istraživanja. Usjevi se inkubiraju na 37°C 18-20 sati, a čiste kulture se izoliraju i identificiraju. Metoda zaslužuje posebnu preporuku za identifikaciju bakterijskih nositelja i utvrđivanje formiranja stabilnog bakterijskog nositeljstva u rekonvalescenata.

Metoda rozeokulture

Metoda rozeokulture koristi se u slučajevima nesigurnog tijeka bolesti, kada metode hemokulture i bikulture nisu dale pozitivne rezultate, a koža bolesnika ima tipičan osip. Koža na mjestu rozeole se prebriše alkoholom, a oštrim skalpelom se skarificira rozeola dok se ne pojave kapljice limfe. Na njih sterilnom pipetom nakapajte nekoliko kapi žučnog bujona, promiješajte i brzo uvucite smjesu u Pasteurovu pipetu. Sjetva se vrši uz krevet bolesnika u 50 ml selenita ili žučnog bujona. Ako je potrebno dostaviti materijal u laboratorij, kraj pipete se zatvori na vatri.

Metoda urinokulture

Metoda urinokulture prvenstveno se koristi za dijagnosticiranje bakterijskog nositeljstva u rekonvalescenata. Najčešće se bakterije otkrivaju u mokraći 3-4 tjedna bolesti. Nakon temeljite toalete vanjskih spolnih organa, bolje je uzeti urin pomoću katetera u sterilnu posudu. U laboratoriju se 30-50 ml urina centrifugira i sediment sije u medij za obogaćivanje (selenit, Muller, Kaufman), kao iu 1-2 čaše s Endo medijem (Ploskirev, bizmut-sulfitni agar). Izolacija i identifikacija provode se na isti način kao i kod proučavanja drugih materijala.

Metoda koprokulture

Metoda koprokulture rijetko se koristi za dijagnosticiranje bolesti, jer se bakterije kasno pojavljuju u stolici. Češće se koristi za pregled rekonvalescenata na bakterijsku infekciju i zdravih osoba koje se zapošljavaju i rade u sustavu javne prehrane, vodoopskrbe i dječjih ustanova. Materijal se uzima od bolesnika i rekonvalescenata bez upotrebe laksativa. Zdravim osobama daje se 30 g magnezijeve soli 3-4 sata prije uzorkovanja. Uzorak se uzima iz tekućeg dijela fecesa. Ako u izmetu postoje patološke nečistoće (sluz, gnoj, krv), one se uključuju u prikupljeni materijal. Uzorci izmeta u količini od 5-10 g stavljaju se drvenom lopaticom u posebne standardne sterilne plastične uloške za jednokratnu upotrebu ili staklenke sa širokim grlom. Na njih se stavlja naljepnica s datumom prikupljanja, prezimenom i inicijalima pacijenta te svrhom studije. Najbolje je kulturu obaviti uz bolesnikov krevet. Ako je nemoguće brzo dostaviti materijal u laboratorij, dodaje se konzervansu u omjeru 1:3. Najčešće se za to koristi tekućina koja sadrži 30% sterilnu otopinu glicerola u fosfatnom puferu.U bakteriološkom laboratoriju izmet se sije istovremeno na dva načina - izravno na selektivne medije (bizmut-sulfitni agar, Ploskireva, Endo, Levin) i na jednom od medija za obogaćivanje (selenit, Muller, Kaufman). Odabir podloge provodi bakteriolog.Pri izravnoj inokulaciji na odgovarajuću čvrstu podlogu mala količina stolice stavi se u peptonsku vodu ili u 0,85% otopinu natrijeva klorida i ostavi 30 minuta da se krupne čestice talože. Uzima se kap materijala s površine tekućine i inokulira u zdjelice sa selektivnim podlogama.Sjetva na podlogu za obogaćivanje (u kojoj se salmonele razmnožavaju bolje i brže od popratne mikroflore) istovremeno s izravnom inokulacijom obvezna je kod testiranja zdravih ljudi na bakterijsku kočije, budući da izlučuju malu količinu bakterija . Međutim, zbog široke uporabe raznih antibiotika u stanovništvu, potrebno je koristiti podloge za obogaćivanje kod inokulacije fecesa od bolesnika, posebno za epidemijske indikacije.Kod sjetve na podloge za obogaćivanje, komadić fecesa se emulgira u 10 ml iste. srednji. Sljedeće vješanje s njega na gustu elektivnu podlogu preporučljivo je učiniti nakon 5-6 sati uzgoja u termostatu Cerebrospinalna tekućina se ispituje kod prisutnosti meningealnog i meningoencefalitičkog sindroma. Kulture gnoja, eksudata, sputuma i majčinog mlijeka trudnica izvode se istim redoslijedom kao što je gore opisano. Prilikom ispitivanja sekcijskog materijala sije se krv iz srca, komadići parenhimskih organa i sadržaj tankog crijeva. U laboratoriju se materijal melje u tarionicima sa sterilnim pijeskom, prelazi u tekuću fazu i ispituje se na isti način kao i stolica.

Istraživanje vode

Ispitivanja vode za otkrivanje tifusnih i paratifusnih mikroba provode se tijekom istraživanja vodenih epidemija bolesti i drugih epidemioloških indikacija. Budući da se patogeni nalaze u malim količinama u vodi, za njihovu pouzdanu detekciju koriste se metode koje omogućuju koncentriranje bakterija iz volumena vode koja se proučava. To se najbolje može učiniti pomoću membranskih filtara. Da biste to učinili, 2-3 litre vode prolaze kroz filtere br. 2 (ili br. 3). Filtri s bakterijama adsorbiranim na njima uranjaju se u selenitni bujon ili stavljaju na bizmut-sulfitni agar. Nakon 8-10 sati inkubacije u termostatu, provodi se nasađivanje iz selenitne juhe na jedan od diferencijalnih krutih medija kako bi se dobile izolirane kolonije i potom izolirale čiste kulture. S površine filtera na bizmut-sulfit agaru nakon 24-48 sati uzgoja u termostatu crne kolonije se potkulturiraju na Olkenitskyjevu podlogu i identificiraju izolirane kulture.Ako se uzročnici trbušnog tifusa i paratifusa ne mogu otkriti. , voda se može ispitati na prisutnost odgovarajućih bakteriofaga. Da bi se to postiglo, voda se najprije filtrira kroz filtar i 1-2 ml filtrata se doda u sterilnu Petrijevu zdjelicu, prelije sa 15 ml rastopljene i ohlađene na 45-50 °C MPA, te dobro promiješa. Površina skrutnutog agara inokulirana je sektorima kulture uzročnika tifusa i paratifusa. Pojava negativnih kolonija ukazuje na prisutnost odgovarajućeg faga.

Identifikacija čistih kultura

Izolirane kulture identificiraju se morfološkim, kulturalnim, biokemijskim svojstvima, antigenskom strukturom i fagolizom. Kod mikroskopije razmaza obojenih po Gramu, bakterije tifusa i paratifusa izgledaju kao crvene štapiće sa zaobljenim krajevima, veličine 0,5-0,8 g 1-3 µm, aktivno pokretne u visećim ili pritisnutim kapljicama.Rast u MPB-u prati zamućenje. Na MPA rastu nježne, okrugle, glatke, prozirne ili prozirne kolonije veličine 2-4 mm. Međutim, kolonije tifusnih mikroba koje imaju Vi antigen su mutne. Kod S. paratyphi kolonije su hrapave, periferija kolonija nakon nekoliko dana stvara mukozni greben.Na podlogama Endo, Levin i Ploskirev kolonije su bezbojne, prozirne, više ružičaste (Endo) ili blago plavkaste. (Munja). Na bizmut-sulfitnom agaru mikrobi tifusa stvaraju crne kolonije, ponekad sa svijetlim rubom. Paratifusne bakterije mogu na ovoj podlozi stvoriti smećkaste ili zelenkaste kolonije. Nakon uklanjanja kolonije na podlozi ostaje crni trag.Na podlozi Olkenitskyja bacil tifusa razgrađuje glukozu do kiseline (stupac agara požuti), laktoza i saharoza ne fermentiraju (boja kosog dijela se ne mijenja), a oslobađa sumporovodik (crnjenje na rubu stupa i kosom dijelu). Paratifusne bakterije fermentiraju glukozu u kiselinu i plin (žutilo i lomi u stupcu agara) Biokemijski znakovi tifusno-paratifusnih mikroba proučavaju se kada se posijaju na „šaroliku” Hissovu seriju medija Tablica 37 Enzimska svojstva Escherichia i tifusno-paratifusnih bakterija Serološki identifikacija izoliranih kultura u reakciji je pouzdanija aglutinacija s dijagnostičkim serumima. Najprije se reakcija provodi na staklu s adsorbiranim aglutinirajućim serumima koji sadrže antitijela na antigene 09 (S. typhi% 02 (S. paratyphi A) i 04 (S. schottmuelleri). Ako je izolirana kultura po biokemijskim svojstvima slična tifusu, ali je aglutiniran serumom 09, mora se aglutinirati sa Vi-serumom.Za postavljanje reakcije aglutinacije kap odgovarajućeg seruma se nanese na predmetno staklo i pored kapi fiziološke otopine. Bakteriološkom petljom se kultura se prikupi iz medija Olkenitskog, emulgira u kapi fiziološke otopine i pomiješa s kapi seruma.Ako kultura i serum odgovaraju, dolazi do aglutinacije, na temelju čijih se rezultata utvrđuje pripadnost kulture koja se proučava serogrupama.Serovari utvrđuju se u reakciji aglutinacije s monoreceptorskim H-serumima. Ako u laboratoriju nema seruma adsorbiranih monoreceptorima, provodi se detaljna reakcija aglutinacije u epruvetama (Gruberova otopina) sa specifičnim tifusnim i paratifusnim serumima. Dijagnostički serum mora se razrijediti do titra navedenog na naljepnici ampule. Ako reakcija aglutinacije padne na titar ili barem na polovicu titra, tada kultura odgovara vrsti seruma.

Fagotipizacija izoliranih kultura

Fagotipizacija tifusno-paratifusnih mikroba ima veliku epidemiološku važnost, posebice za identifikaciju izvora infekcije. Uzročnike tifusne groznice s Vi antigenom liziraju Vi bakteriofagi. Ima ih 86 vrsta. Svi su vrlo specifični. Postoje i setovi faga za titraciju paratifusne salmonele.Za fagotipizaciju uzimaju se mlade kulture (stare 4-6 sati) sojeva koji se proučavaju, setovi tipičnih bakteriofaga u testnim razrjeđenjima i standardna svježe pripremljena i dobro osušena podloga. Usjev se sije kontinuiranim travnjakom, čašice se moraju sušiti u termostatu. Tipični fagi se nanose na površinu travnjaka pomoću Pasteurove pipete, žiga replikatora ili kalibracijske petlje. Prvo se dno zdjelice označi u kvadratiće u koje se upisuje broj tipskog faga. Nakon što se kapi osuše, čašice se inkubiraju u termostatu 5-6 sati i rezultati se uzimaju u obzir. Tip faga određen je prisutnošću lize kulture od strane odgovarajućeg faga. Za utvrđivanje izvora infekcije provodi se i salmonelozni kolitis.U posljednje vrijeme dobro opremljeni mikrobiološki laboratoriji koriste osjetljivije i specifičnije metode laboratorijske dijagnostike trbušnog i paratifusnog tifusa. Dakle, za otkrivanje O- i Vi-antigena u krvi, izmetu i drugim materijalima, koristi se RSK, neizravna reakcija hemaglutinacije s eritrocitnim protutijelima može se koristiti za dijagnosticiranje majke. Primjena koaglutinacijskih reakcija, agregatne aglutinacije i ELISA također obećava. Za brzu identifikaciju uzročnika trbušnog tifusa i paratifusa koristi se DNK sonda koja nosi gen Vi-antigen. Rezultat se dobiva za 3-4 sata.

Serološka studija

Serološko testiranje provodi se kako za dijagnosticiranje bolesti tako i za utvrđivanje nositeljstva bakterije. U dijagnostičke svrhe provodi se detaljna volumetrijska Widal i RIGA reakcija s O- i Vi eritrocitnim dijagnostikumima. RIGA je pouzdaniji i specifičniji. Nedavno se sve više koristi određivanje protutijela ELISA metodom. Dijagnostička vrijednost seroloških reakcija značajno se povećava kada se provode metodom uparenih seruma.

Vidalova reakcija

Aglutinini na patogene tifusa i paratifusa otkrivaju se u krvnom serumu počevši od 8-10 dana bolesti i kasnije. Dinamika njihove akumulacije vrlo je osebujna: prvo se pojavljuju antitijela na O-antigen, ali njihov titar brzo opada nakon oporavka. H- i Vi-antitijela pojavljuju se kasnije, ali ostaju u visokom titru godinama nakon bolesti, cijepljenja i kod nositelja bakterija. U tom smislu za ispravnu procjenu serološke reakcije važno je istovremeno detektirati sve vrste aglutinina.Za provođenje Widalove reakcije aglutinacije potrebne su tri komponente: 1) protutijela (serum bolesnika) 2) antigen (bakterijski ili eritrocitni). diagnosticum) 3) 0,85% otopina natrijevog klorida (elektrolit). Za dobivanje seruma od bolesnika uzme se 2-3 ml krvi iz vene, prsta ili ušne resice u sterilnu epruvetu, stavi u termostat na 30 minuta da se zgruša. Dobiveni ugrušak se zaokruži Pasteur-ovom pipetom, odvoji od stijenki epruvete, stavi na 30-40 minuta u hladnjak, isiše serum i napravi njegovo radno razrjeđenje u omjeru 1:50. paralelnim redovima aglutinacijskih epruveta rade se sljedeća razrjeđenja seruma od 1:100 do 1:1600 prema standardnoj shemi Kao antigeni za reakciju aglutinacije 09 i Hd koriste se tifusni monodijagnostikumi, kao i paratifusni O- i H-dijagnostikumi. .To su 3 milijarde suspenzija ovih bakterija ubijenih toplinom ili formaldehidom. O-dijagnostikumi se pripremaju kuhanjem kultura ili tretiranjem alkoholom, H-dijagnostikumi tretiranjem kultura formaldehidom. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svaku epruvetu reda, osim u šestu (serumska kontrola - CS). Sedma epruveta je dijagnostički test (CD). Stalci s epruvetama se snažno protresu i stave u termostat na 2 sata, nakon čega se prethodno zabilježe rezultati reakcije. Završno brojanje se provodi nakon 18-20 sati držanja epruveta na sobnoj temperaturi. Uz pozitivnu reakciju aglutinacije, na dnu epruvete stvara se bjelkasti talog iznad kojeg se nalazi više ili manje prozirna tekućina. Ako je reakcija negativna, tekućina ostaje mutna i na dnu epruvete nema taloga. Aglutinacija se smatra specifičnom kada se u kontrolnim epruvetama (CS i CD) ne stvara aglutinat. Pri uzimanju u obzir rezultata obratiti pažnju na prirodu aglutinativa: O-aglutinacija će biti sitnozrnata, a H-aglutinacija krupnozrnata.Uz tipičnu kliničku sliku trbušnog tifusa dijagnostički titar Widal reakcija kod bolesnika koji nisu cijepljeni smatra se razrjeđenjem od 1:100 ili većim, s atipičnim ili izbrisanim oblicima bolesti - ne nižim od 1:200. Nedavno se Vidalove reakcije ne smatraju vrlo specifičnima. Može biti pozitivna i kod drugih bolesti praćenih vrućicom, nakon cijepljenja ili prethodne bolesti itd. Ipak, visoka specifičnost reakcije može se otkriti kada se mjeri kroz vrijeme metodom uparenih seruma. Ni anamnestička, ni cijepna niti grupna protutijela neće pokazati porast titra s drugim serumom uzetim nakon 10-12 dana. Sve te značajke u određenoj su mjeri ograničile formulaciju ove reakcije u dijagnostičke svrhe. To je osobito istinito kada se pacijenti rano liječe antibioticima. Potonji u velikoj mjeri inaktiviraju antigene (patogene); titar protutijela u takvih je bolesnika nizak i ne može se smatrati dijagnostičkim.

Vi-reakcija hemaglutinacije

U serološkoj dijagnostici trbušnog tifusa i paratifusa RNGA se u novije vrijeme sve više koristi, posebice za dokazivanje Vi protutijela. Odnosi se prvo na kompleksni eritrocitni dijagnostikum ABCD, zatim na tifusni eritrocitni dijagnostikum 09- i Hd i na kraju na Vi-eritrocitni dijagnostikum.Vi-antitijela za trbušni tifus nemaju značajniju dijagnostičku ni prognostičku vrijednost. Detekcija ovih protutijela važna je za identifikaciju osoba za koje se sumnja da su nositelji bakterije.Reakcija se provodi u plastičnim pločicama s jažicama. Krv se uzima od pacijenata ili nositelja bakterija na isti način kao i za Widalovu reakciju. Serum se razrjeđuje u jažicama od 1:10 do 1:160 u volumenu od 0,5 ml. Zatim se u svaku jažicu doda 0,25 ml eritrocitnog dijagnostikuma. Tablete se stave u termostat 2 sata, zatim se ostave na sobnoj temperaturi još 18-20 sati. Rezultati se uzimaju u obzir prema sustavu chotiriplus: + + + + - crvene krvne stanice su potpuno aglutinirane, na dnu jažice nalazi se rahli sediment u obliku prevrnutog "kišobrana"; + + + - "kišobran" je manji, nisu sva crvena krvna zrnca bila slijepljena; + + - aglutinata je malo, postoji sediment neglutiniranih eritrocita; (-) - negativna reakcija, na dnu jažice nalazi se gusti sediment crvenih krvnih stanica u obliku “novčića”.Dijagnostičku vrijednost ima reakcija s titrom 1:40 ili više. No, da bi se postavila konačna dijagnoza "prijevoza bakterije", potrebno je izolirati čistu kulturu patogena pomoću metode koprobilija ili kulture urina.

Alergotest

Kao pomoćna metoda za dijagnosticiranje trbušnog tifusa koristi se kožni alergotest s Vi-tifinom koji sadrži Vi-alergen, koji u interakciji s Vi-antitijelima izaziva lokalnu alergijsku reakciju kože u vidu crvenila i otoka nakon 20-ak 30 minuta. Vi-typhine test postaje pozitivan tijekom razdoblja rekonvalescencije i može se koristiti za retrospektivnu dijagnozu.

Prevencija i liječenje

Trenutno se koristi kemijsko cjepivo protiv tifoparatifusa i tetanusa (TABte) adsorbirano na aluminijevom gelu. Sastoji se od kompletnih antigena Salmonella typhoid, paratyphoid A i B i toksoida tetanusa. Dobri rezultati se postižu kada se koristi cjepivo koje sadrži antigen S. typhi Vi. Za liječenje tifusnih paratifusnih infekcija koriste se kloramfenikol i drugi antibiotici koji djeluju na gram-negativne bakterije.