Tandem tömegspektrometria (HPLC-MSMS) alkalmazása a klinikai diagnosztikában. Tandem tömegspektrometria (HPLC-MSMS) alkalmazása a klinikai diagnosztikában HPLC MS mit

A Clinical Biochemist Reviews című folyóiratban megjelent áttekintés szerint a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és a tandem tömegspektrometria (HPLC-MS/MS) alkalmazása a klinikai laboratóriumokban rendkívüli mértékben megnövekedett az elmúlt 10-12 évben. A szerzők megjegyzik, hogy a HPLC-MS/MS analízis specificitása szignifikánsan felülmúlja az immunológiai módszereket és a klasszikus nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) a kis molekulatömegű molekulák analízisében, és lényegesen nagyobb az áteresztőképessége, mint a gázkromatográfiás-tömegspektrometriáé (GC). -KISASSZONY). E módszer népszerűsége a rutin klinikai elemzésekben jelenleg a módszer egyedülálló képességeivel magyarázható.

A HPLC-MS/MS módszer fő előnyei:
• Kis molekulák pontos kvantitatív elemzésének lehetősége;
• Több célvegyület egyidejű elemzése;
• Egyedülálló sajátosság;
• Nagy sebességű elemzés.

Az elmúlt években nagy figyelmet fordítottak az elemzési időre, és ennek eredményeként a laboratóriumi termelékenység növelésére. Az elemzési idő jelentős csökkentését teszi lehetővé a HPLC/MS/MS-hez rövid analitikai oszlopok használata, miközben drámaian megnöveli az analízis specifitását. Az atmoszférikus nyomású ionizáció (API), a tandem tripla kvadrupólus tömegspektrométer és a fejlett, nagy teljesítményű folyadékkromatográfia, valamint a kapcsolódó minta-előkészítési technikák alkalmazása a HPLC-MS/MS-t a klinikai kutatás modern analitikai módszereinek élvonalába emelte.

A HPLC/MS/MS fő alkalmazási területei a klinikai gyógyászatban:
• A szteroid panelek, purinok, pirimidinek és egyéb vegyületek teljes metabolikus profiljának elérése,
  újszülöttek szűrése veleszületett anyagcsere-hibákra (több tucat betegség kimutatása egy tesztben);
• Gyógyszerek - immunszuppresszánsok, perikonvulzív szerek, antiretrovirális szerek, antikoagulánsok és bármely más - terápiás monitorozása, függetlenül a gyártó készleteinek elérhetőségétől. Nincs szükség drága készletek vásárlására minden egyes anyaghoz - kifejlesztheti saját módszereit;
• Klinikai toxikológia – több mint 500 kábítószer és metabolitjuk elemzése egy elemzésben, megerősítő elemzés nélkül
  proteomika és metabolomika.

Ezenkívül a HPLC-MSMS-t vizelet oligoszacharidok, szulfatidok, hosszú szénláncú zsírsavak, hosszú szénláncú epesavak, metilmalonsav, porfíria vizsgálatok, valamint purin- és pirimidin-anyagcsere-zavarban szenvedő betegek szűrésére is használják.

A folyadékkromatográfia alkalmazási példái
tandem tömegspektrometriával kombinálva a klinikai elemzésekben.

Újszülött szűrés: A HPLC-MS/MS klinikai diagnosztikában való széles körű alkalmazásának első példája az újszülöttek veleszületett anyagcsere-hibáinak szűrése volt. Jelenleg a fejlett országokban ez egy rutin módszer, és több mint 30 különböző betegséget fed le, beleértve az acedémiát, az aminoacidopátiát és a zsírsav-oxidációs hibákat. Különös figyelmet érdemelnek a születési rendellenességekkel kapcsolatos tanulmányok, amelyek súlyos problémákhoz vezethetnek, ha nem kezelik azonnal (például szív- vagy májnagyobbodás vagy agyduzzanat). A HPLC-MS/MS újszülöttek szűrésére való alkalmazásának előnye, hogy egyidejűleg minden aminosavat és acilkarnitint gyorsan, olcsón és nagyon specifikusan elemezhetünk.

Terápiás gyógyszerellenőrzés: A szirolimusz (rapamycin) immunszuppresszív gyógyszer kifejlesztése és bevezetése a szervátültetés utáni kilökődés megelőzésére a HPLC-MS/MS klinikai laboratóriumokba való bevezetésének egyik fő hajtóereje. A modern HPLC-MS/MS módszer lehetővé teszi a takrolimusz, szirolimusz, ciklosporin, everolimusz és mikofenoinsav egyidejű meghatározását.

A HPLC-MS/MS-t citotoxikus, antiretrovirális gyógyszerek, triciklusos antidepresszánsok, görcsoldók és egyéb, egyedi adagolást igénylő gyógyszerek elemzésére is használják.

A HPLC-MSMS módszer lehetővé teszi a warfarin R- és S-enantiomereinek elkülönítését és mennyiségi meghatározását 0,1-500 ng/ml koncentráció tartományban.

Kábítószerek és fájdalomcsillapítók: A HPLC-MS/MS-t széles körben alkalmazzák ezeknek a vegyületeknek az elemzésére a könnyű minta-előkészítés és a rövid elemzési idő miatt. A módszert jelenleg klinikai laboratóriumokban alkalmazzák számos gyógyszer jelenlétének szűrésére. A módszer egyedülálló specificitása és érzékenysége lehetővé teszi több mint 500 különböző osztályba tartozó vegyület egyidejű elemzését egy mintában minimális minta-előkészítés mellett. Tehát vizelet analízis esetén elegendő a minta egyszerű 50-100-szoros hígítása. A haj elemzésekor egy csomó 100-200 hajszál helyett egyetlen hajszál is elegendő a kábítószer-használat tényeinek megbízható azonosításához.

Endokrinológia és szteroid elemzés: A HPLC-MS/MS-t széles körben használják számos endokrinológiai laboratóriumban szteroidok – tesztoszteron, kortizol, aldeszteron, progeszteron, ösztriol és sok más – elemzésére.

Egyre több laboratórium kezdi alkalmazni a HPLC-MS/MS-t a D3- és D2-vitamin vérszintjének meghatározására.

I. Szteroidok meghatározása (szteroid profil).

A kórházi és klinikai laboratóriumok ma már képesek több szteroid egyidejű meghatározására is HPLC/MS/MS segítségével. Ebben az esetben nincs szükség nagy mintatérfogatra, ami különösen fontos a gyermekgyógyászati ​​minták elemzésekor.

Olyan esetek, amikor tanácsos több (profilozó) szteroidot meghatározni:
• A congenitalis adrenalis hyperplasia (CAH) a szteroid bioszintézis veleszületett rendellenessége. Ez a betegségek egy örökletes csoportja, amelyet a mellékvesekéregben lévő enzimek nem megfelelő működése okoz, ami a kortizol termelésének csökkenéséhez vezet. A NAS megbízható diagnózisához ajánlott a kortizol, az androszténdion és a 17-hidroxi-progeszteron mérése. A HPLC/MS/MS lehetővé teszi mindhárom szteroid pontos mennyiségi meghatározását egyetlen elemzésben, 100%-os biztonsággal.
• Az újszülöttek rutinszerű immunvizsgálati szűrését a pozitív és hamis negatív eredmények magas aránya jellemzi. A HPLC/MS/MS módszerrel nemcsak a kortizol, hanem az aldoszteron és a 11-dezoxikortizol meghatározása is lehetővé teszi az elsődleges és másodlagos mellékvese-elégtelenség megkülönböztetését.
• A HPLC/MS/MS lehetővé teszi a szteroidok meghatározását prosztatagyulladás és krónikus kismedencei fájdalom szindróma esetén.
• A HPLC-MS/MS képes meghatározni a szteroidprofilokat és azonosítani a mellékvesekéreghez kapcsolódó korai pubertás okait kisgyermekeknél. Azt találták, hogy ezekben a gyermekekben a tesztoszteron, androszténdion, dehidroepiandroszteron (DHEA) és szulfátjának koncentrációja valamivel magasabb volt, mint az idősebb kontroll gyermekekben.
• Az aktív dohányzóktól, passzív dohányzóktól és nemdohányzóktól származó szérumot 15 szteroid hormon és pajzsmirigyhormon jelenlétére elemezzük, hogy megvizsgáljuk a páciens füstexpozíciója és a hormonkoncentráció közötti összefüggést.
• A HPLC/MS/MS-t egyes női szteroid hormonok vizeletben történő profilálására használják.
• HPLC/MS/MS módszert alkalmaztunk a neuroaktív hormonok koncentrációjának értékelésére a diabéteszes neuropátia megelőzésére.

II. A pajzsmirigyhormonok meghatározása

A pajzsmirigyhormonok meghatározásának rutin módszerei általában a radioimmunoassay eljárásokon alapulnak, amelyek költségesek és csak a T3-at és a T4-et mutatják ki, ami korlátozhatja a pajzsmirigyfunkció meghatározásának és teljes szabályozásának képességét.

• Jelenleg HPLC-MSMS segítségével szérummintákban öt pajzsmirigyhormon egyidejű elemzését végzik, köztük a tiroxin (T4), 3,3′,5-trijódtironin (T3), 3,3′,5′- (rT3) 3,3'-dijódtironin (3,3'-T2) és 3,5-dijódtironin (3,5-T2) 1-500 ng/ml koncentráció tartományban.
• A HPLC/MS/MS módszert a pajzsmirigyeltávolításon átesett betegek hormonösszetételének elemzésére is használják. Meghatározzuk a tiroxin (T4), a trijódtironin (T3), a szabad T4 és a pajzsmirigy-stimuláló hormon (TSH) koncentrációját a műtét után. A HPLC/MS/MS kiváló módszernek bizonyult a TSH és a pajzsmirigyhormon-koncentráció közötti kapcsolat megállapítására.
• A HPLC/MS/MS módszert alkalmaztuk a tiroxin (T4) humán nyálban és szérumban történő meghatározására. A módszert nagy reprodukálhatóság, pontosság és 25 pg/ml-es kimutatási határ jellemzi. Tanulmányok kimutatták, hogy diagnosztikus kapcsolat van a nyál T4-koncentrációjában az euthyreoid betegek és a Graves-kórban szenvedő betegek között.

A HPLC/MS/MS módszer ma már rendelkezik azzal az érzékenységgel, specificitással és pontossággal, amely a biológiai folyadékokban lévő összes szteroid megbízható meghatározásához szükséges, és ezáltal javítja a diagnosztikai képességeket, különösen a szteroidkészletek meghatározása esetén.

III. A 25-hidroxi-D-vitamin meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

A 25-hidroxi-D-vitamin (25OD) a D-vitamin fő keringési formája és aktív formájának prekurzora. (1,25-dihidroxi-D-vitamin). Hosszú felezési ideje miatt a 25OD meghatározása fontos a D-vitamin státuszának meghatározásához a páciens szervezetében. A D-vitamin két formában létezik: D3-vitamin (kolekalciferol) és D2-vitamin (ergokalciferol). Mindkét forma a megfelelő 25OD formákra metabolizálódik. A diagnózis szempontjából nagy jelentősége van azoknak az analitikai módszereknek, amelyek nagy pontossággal meghatározzák a vitamin mindkét formáját, és lehetővé teszik a D-vitamin hiányos betegek monitorozását. Az eddig alkalmazott módszerek nem tették lehetővé a D2- és D3-vitamin külön meghatározását. Ezenkívül a D2-vitamin magas koncentrációinál a D3 kimutatható mennyiségét alulbecsülik. További hátránya a radioaktív izotópok használata. A HPLC/MS/MS módszer alkalmazása nemcsak a radioaktív izotópok használatának elkerülését tette lehetővé, hanem a vitamin mindkét aktív formájának külön-külön történő meghatározását is.

A módszer a következő betegeknél alkalmazható:
1. Ha gyanítja, hogy alacsony a D-vitamin szintje a szervezetben;
2. Ha megmagyarázhatatlan toxicitás gyanúja merül fel;
3. A kezelés alatt álló betegek alacsony D-vitamin-szintjének vizsgálatakor;
4. A HPLC/MS/MS használata lehetővé tette mindkét forma külön meghatározását a betegek monitorozása során.

IV. Az immunszuppresszánsok meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

Szervátültetés után immunszuppresszív gyógyszereket kell szedni egy életen át a kilökődés elkerülése érdekében. A nagyon szűk terápiás tartományú és nagy toxicitású immunszuppresszánsok egyéni adagolást igényelnek a maximális hatás elérése érdekében. Ezért a főbb immunszuppresszív szerek: ciklosporin A, takrolimusz, szirolimusz és everolimusz monitorozása létfontosságú, hogy a gyógyszerek adagját minden egyes beteg esetében a vérben lévő gyógyszerkoncentrációtól függően módosítsák.

Immunvizsgálatokat továbbra is alkalmaznak ezeknek a gyógyszereknek a monitorozására, de ezek a módszerek drágák, és korlátozott a specifitásuk, pontosságuk és reprodukálhatóságuk. Az immunológiai módszerekkel kapott eredmények alapján előfordulnak olyan esetek, amikor a betegek az immunszuppresszánsok helytelen adagolása miatt meghaltak. Jelenleg a klinikai laboratóriumokban az immunológiai vizsgálatokat a HPLC/MS/MS váltja fel. Így a müncheni egyetemi klinikán naponta körülbelül 70 mintát elemeznek szirolimusz és ciklosporin A tartalmára HPLC/MS/MS rendszerrel. Minden minta-előkészítést és műszerellenőrzést egy alkalmazott végzi. A laboratórium is átáll a takrolimusz ezzel a módszerrel történő tesztelésére.

• Leírják a HPLC/MS/MS alkalmazását a takrolimusz, szirolimusz, aszkomicin, demethixiszirolimusz, ciklosporin A és ciklosporin G rutin egyidejű meghatározására a vérben. A koncentráció által meghatározott tartomány 1,0 - 80,0 ng/ml. Ciklosporin esetén 25-2000 ng/ml. Az év során a laboratórium több mint 50 000 mintát elemzett.
• Mivel a takrolimusz és a szirolimusz egyidejű alkalmazása pozitív terápiás hatást fejt ki, egy egyszerű és hatékony HPLC/MS/MS módszert fejlesztettek ki ezek elkülönített meghatározására a vérben klinikai elemzés céljából. Egy minta elemzése 2,5 percet vesz igénybe, a takrolimusz esetében 2,46% és 7,04% közötti, a szirolimusz esetében pedig 5,22% - 8,30% pontossággal a teljes analitikai görbét tekintve. A takrolimusz kimutatásának alsó határa 0,52 ng/ml, a szirolimusz esetében - 0,47 ng/ml.

V. A homocisztein meghatározása HPLC/MS/MS módszerrel

A homocisztein szív- és érrendszeri betegségekben (tromboembólia, szívbetegség, érelmeszesedés) és egyéb klinikai állapotokban (depresszió, Alzheimer-kór, csontritkulás, terhességi szövődmények stb.) érdekes. A homocisztein analízis jelenlegi módszerei, beleértve az immunológiai vizsgálatokat is, drágák. A homocisztein analízisére szolgáló gyors HPLC/MS/MS módszert fejlesztettek ki rutin klinikai felhasználásra nagyszámú minta elemzésére. Az ionizációt elektrospray módszerrel végeztük. A módszer reprodukálható, nagyon specifikus és pontos. A módszer előnye a reagensek alacsony költsége és a minta-előkészítés egyszerűsége is. Lehetőség van napi 500 vagy több minta elemzésére.

Következtetés

Meg kell jegyezni, hogy annak ellenére, hogy manapság jelentősen továbbfejlesztett immunológiai vizsgálati módszereket alkalmaznak, alapvető technikai korlátok miatt ez a módszer soha nem lesz olyan pontos és specifikus a célanyagra vonatkozóan, mint a HPLC-MSMS, különösen metabolitok jelenlétében. Ez nemcsak az ELISA-módszer alacsony pontosságához és a hamis pozitív és álnegatív eredmények magas százalékához vezet, hanem nem teszi lehetővé a különböző klinikai osztályokon ELISA módszerrel kapott eredmények összehasonlítását. A HPLC-MS/MS alkalmazása kiküszöböli ezt a hátrányt, és lehetővé teszi nagyszámú minta rendkívül specifikus, pontos és gyors elemzését nagy megbízhatósággal metabolitok jelenlétében, valamint a plazmában és vérben található egyidejű és endogén anyagok által okozott interferencia nélkül. betegek.

A műszerkomplexum látszólag magas költsége ellenére, amint azt a világgyakorlat mutatja, megfelelő működés mellett ez a komplexum 1-2 év alatt megtérül. Ez mindenekelőtt annak köszönhető, hogy egy elemzés alacsony költsége van több tíz és több száz vegyület egyidejű elemzése miatt, és nincs szükség drága diagnosztikai készletek vásárlására. Ezenkívül a laboratóriumnak lehetősége van önállóan kifejleszteni a szükséges elemzési módszereket, és nem függ a készlet gyártójától.

A megfelelő műszerkonfiguráció kiválasztása

Számos különböző tömegspektrometriás módszer és tömegspektrométer típus létezik, amelyeket a legkülönfélébb problémák megoldására terveztek – a több százezer dalton tömegű komplex fehérje-makromolekulák szerkezeti azonosításától a kis molekulák rutinszerű, nagy áteresztőképességű kvantitatív elemzéséig.

A probléma sikeres megoldásához az egyik fő feltétel a megfelelő típusú berendezés kiválasztása. Nincs olyan univerzális eszköz, amely lehetővé tenné az analitikai problémák teljes skálájának megoldását. Így a mikroorganizmusok azonosításának problémájának megoldására tervezett eszköz nem képes kis molekulák mennyiségi elemzésére. És fordítva. A helyzet az, hogy a közönséges név ellenére teljesen különböző eszközökről van szó, amelyek különböző fizikai elveken működnek. Az első esetben ez egy repülési idő tömegspektrométer lézer-ionizációs forrással - MALDI-TOF, a másodikban pedig - háromszoros kvadrupólus elektropermet ionizációval - HPLC-MSMS.

A második legfontosabb paraméter a megfelelő rendszerkonfiguráció kiválasztása. Számos nagy tömegspektrometriás berendezés gyártó létezik. Az egyes gyártók készülékeinek nemcsak erősségei, hanem gyengeségei is vannak, amelyekről általában inkább hallgatnak. Minden gyártó saját termékcsaládot gyárt. Egy analitikai komplexum költsége 100 000 és 1 000 000 dollár között mozog vagy több. Az optimális gyártó és a megfelelő berendezés-konfiguráció kiválasztása nemcsak jelentős anyagi forrásokat takarít meg, hanem a feladatot is hatékonyabban oldja meg. Sajnos számos példa van arra, amikor a laboratóriumi berendezéseket anélkül végezték el, hogy ezeket a tényezőket figyelembe vették volna. Az eredmény tétlen berendezések és kidobott pénz.

A harmadik tényező, amely meghatározza a laboratórium sikeres működését, a személyzet. A tömegspektrométerek működtetéséhez magasan képzett személyzetre van szükség. Sajnos Oroszországban egyetlen egyetemen sem létezik modern gyakorlati tömegspektrometria képzés, különösen a klinikai alkalmazásokkal kapcsolatban, és az egyes laboratóriumokban a személyzet képzésének feladatait önállóan kell megoldani. A módszer alapjainak megértéséhez és a készülék kezelésében való jártasság elsajátításához természetesen nem elegendő a gyártó által a berendezés forgalomba hozatalát követő 2-3 napos bevezető oktatás.

A negyedik tényező a kész elemzési módszerek hiánya. Minden laboratóriumnak megvannak a maga kiemelt feladatai, amelyekhez saját módszereket kell kidolgozni. Ezt olyan személy végezheti, aki legalább 2-3 éves tapasztalattal rendelkezik a készülék kezelésében. A gyártók időnként egy-két általános ajánlási módszert kínálnak, de nem igazítják azokat a laboratórium konkrét feladataihoz.

BAN BEN BioPharmExpert LLC Sok éves tapasztalattal rendelkező szakembereket alkalmazunk különféle tömegspektrométereken, módszerek kidolgozásában és nagy áteresztőképességű elemzések elvégzésében. Ezért az alábbi szolgáltatásokat nyújtjuk:

1. Az optimális eszközkonfiguráció kiválasztása az ügyfél konkrét feladataihoz.
2. Berendezések beszerzése, szállítása és bevezetése vezető tandem tömegspektrométer gyártóktól.
3. Kész módszerek és adatbázisok összessége alapvető klinikai problémák megoldására.
4. Analitikai módszerek kidolgozása és az ügyfél speciális problémáinak megoldása laboratóriumában munkatársai bevonásával.
5. Módszertani támogatás a munka minden szakaszában.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) egy oszlopkromatográfiás módszer, amelyben a mozgófázis (MP) egy állófázissal (szorbenssel) töltött kromatográfiás oszlopon áthaladó folyadék. A HPLC oszlopokat nagy hidraulikus nyomás jellemzi az oszlop bemeneténél, ezért a HPLC-t néha "nagynyomású folyadékkromatográfiának" is nevezik.

Az anyagok szétválási mechanizmusától függően a következő HPLC lehetőségeket különböztetjük meg: adszorpció, megosztás, ioncsere, méretkizárás, királis stb.

Az adszorpciós kromatográfiában az anyagok szétválása a fejlett felületű adszorbens, például szilikagél felületéről való eltérő adszorpciós és deszorpciós képessége miatt következik be.

A megoszlásos HPLC-ben az elválasztás az állófázis (általában kémiailag egy álló hordozó felületére ojtott) és a mozgófázis között elválasztott anyagok eloszlási együtthatóinak különbsége miatt következik be.

A polaritás alapján a PF és NP HPLC normál fázisra és fordított fázisra osztható.

A normál fázisú kromatográfia egy olyan változata, amely poláris szorbenst (például szilikagélt vagy szilikagélt ojtott NH 2 vagy CN csoportokkal) és nem poláris PF-t (például hexánt különféle adalékokkal) használ. A kromatográfia fordított fázisú változatában apoláros, kémiailag módosított szorbenseket (például nem poláros C18 alkilcsoport) és poláris mozgófázisokat (például metanolt, acetonitrilt) használnak.

Az ioncserélő kromatográfiában az oldatban kationokká és anionokká disszociált anyagok keverékének molekulái a szorbensen (kationcserélőn vagy anioncserélőn) való áthaladáskor szétválnak a szorbens ioncsoportjaival való eltérő kicserélődési sebességük miatt.

A méretkizárásos (szita, gélpermeáció, gélszűrés) kromatográfiában az anyagok molekuláit méret szerint különítik el, mivel eltérő az állófázis pórusaiba való behatolási képességük. Ebben az esetben a legnagyobb molekulák (legnagyobb molekulatömegű), amelyek képesek az állófázis minimális számú pórusaiba behatolni, először hagyják el az oszlopot, és a kis molekulaméretű anyagok távoznak utoljára.

az elválasztás gyakran nem egy, hanem több mechanizmuson keresztül történik egyszerre.

A HPLC módszer bármilyen nem gáz halmazállapotú analit minőségének ellenőrzésére használható. Az elemzés elvégzéséhez megfelelő eszközöket - folyadékkromatográfokat - használnak.

A folyadékkromatográf általában a következő fő összetevőket tartalmazza:

– PF előkészítő egység, beleértve a mozgófázist tartalmazó tartályt (vagy a mozgófázisban lévő egyedi oldószereket tartalmazó tartályokat) és a PF gáztalanító rendszert;

– szivattyúrendszer;

– mobilfázisú keverő (ha szükséges);

– mintabevezető rendszer (injektor);

– kromatográfiás oszlop (termosztátba szerelhető);

– detektor;

– adatgyűjtő és -feldolgozó rendszer.

Szivattyúrendszer

A szivattyúk adott állandó sebességgel szállítják a PF-et az oszlopra. A mozgófázis összetétele állandó vagy változhat az analízis során. Az első esetben a folyamatot izokratikusnak, a másodikban pedig gradiensnek nevezik. A szivattyúrendszer elé esetenként 0,45 mikron pórusátmérőjű szűrőket szerelnek fel a mozgófázis szűrésére. A modern folyadékkromatográfos szivattyúrendszer egy vagy több számítógéppel vezérelt szivattyúból áll. Ez lehetővé teszi a PF összetételének megváltoztatását egy adott program szerint a gradiens elúció során. A PF komponensek keverőben való keverése történhet alacsony nyomáson (a szivattyúk előtt) és nagy nyomáson (a szivattyúk után). A keverő használható a PF előkészítésére és az izokratikus elúció során, azonban pontosabb komponensarány érhető el a PF komponensek előkeverésével az izokratikus folyamathoz. Az analitikai HPLC-hez használt szivattyúk lehetővé teszik a PF állandó áramlási sebességének fenntartását az oszlopba 0,1-10 ml/perc tartományban, az oszlop bemeneti nyílásánál 50 MPa-ig terjedő nyomáson. Célszerű azonban, hogy ez az érték ne haladja meg a 20 MPa-t. A nyomás lüktetését a szivattyúk kialakításában szereplő speciális csillapítórendszerek minimalizálják. A szivattyúk munkarészei korrózióálló anyagokból készülnek, ami lehetővé teszi agresszív komponensek használatát a PF összetételében.

Validált HPLC-MS/MS módszert fejlesztettek ki az LXT7-09 új 1,3,4-tiadiazol aminosav-származék azonosítására és mennyiségi meghatározására. Az LHT7-09 tömegspektrometriás detektálásának maximális érzékenységét pozitív ion detektálási módban érték el 5500 V elektrospray feszültség és 36 V deklaszterezési potenciál mellett. Az azonosított MRM átmenetek megerősítették az új aminosav származék kémiai szerkezetét. ,3,4-tiadiazol. Az LXT7-09 hatékony izolálása érdekében a tiadiazolil-amidok többkomponensű keverékeiből nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás gradiens módot fejlesztettek ki, acetonitril és ionmentesített víz különböző arányú keverékét használva eluensként. Ezen kromatográfiás körülmények között az LHT7-09 vegyület retenciós idejét 11 percben határoztuk meg. Az LHT7-09 vegyület kvantitatív meghatározásához kalibrációs oldatot dolgoztunk ki a kromatográfiás csúcsterületnek az oldatkoncentrációtól való függésére.

HPLC-ms/ms

kromatográfia

tömegspektrometria

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Új tiadiazol-származékok gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata formalin által kiváltott mancsödémában patkányokban / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // A tudomány és az oktatás modern problémái. – 2013. – 3. szám www..

2. Új gombaellenes hatású tiadiazol származékok / A.S. Koshevenko [et al.] // Haladás az orvosi mikológiában. – 2015. – T. 14. – P. 348-351.

3. Új furil-2-szubsztituált 1,3,4-tiadiazolok, 1,2,4-triazolok szintézise és daganatellenes hatása / T.R. Hovsepyan [et al.] // Kémiai-gyógyszerészeti folyóirat. – 2011. – T. 45. – 12. sz. – P. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. A tiadiazol új aminosav-származékának akut toxicitásának értékelése egereknek intraperitoneálisan adagolva / N.S. Popov, M.A. Demidova // Felső-Volga Orvosi Lapja. – 2016. – T. 15. szám. 1. – 9-12.o.

5. Popov N.S., Demidova M.A. A tiadiazol új aminosav-származékának ulcerogenitásának értékelése patkányoknak intragasztrikusan beadva / N.S. Popov, M.A. Demidova // Doktori végzettségű hallgató. – 2017. – 1(80) sz. – 71-78.

6. 2-amino-5-alkil(aril-alkil)-1,3,4-tiadiazolok fenil-tio- és benzil-szulfonil-ecetsav-amidjainak szintézise és antimikrobiális aktivitása / S.A. Serkov [et al.] // Kémiai-gyógyszerészeti folyóirat. – 2014. – T. 48., 1. sz. – P. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Imidazotiadiazol-származékok szintézise és farmakológiai aktivitása // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. évf. 73.Nem. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Az új 1-tia-4-azaspirodekán szintézise és rákellenes hatása, származtatott tiazolopirimidin és 1,3,4-tiadiazol tioglikozidok // Molecules. 2017. sz. 22. (1) bekezdése alapján. 170. o.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Az 5-amino-2-szulfonamid-1,3,4-tiadiazol, az acetazolamid szerkezeti és analóg sói érdekes karboanhidráz-gátló tulajdonságokat, vizelethajtót és görcsoldó hatást mutatnak // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. évf. 12.Nem. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Dehidroabietinsav-alapú 1,3,4-tiadiazol-tiazolidinon vegyületek szintézise és gombaellenes hatása // Molecular Diversity. 2016. évf. 20.Nem. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. A quinazolin-4(3H)-on új (1,2,4-triazol vagy 1,3,4-tiadiazol)-metil-tio-származékainak szintézise, ​​biológiai értékelése és molekuláris modellezése, mint DHFR-gátlók // Bioorganic Chemistry. 2017. évf. 72. P. 282-292.

A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia tömegspektrometriás detektálással az egyik legígéretesebb módszer a gyógyszerek azonosítására és mennyiségi meghatározására különféle biológiai objektumokban. A módszert nagy specificitás, pontosság és minimális koncentrációjú anyagok meghatározásának képessége jellemzi, ami lehetővé teszi a gyógyszerek kvantitatív meghatározására való alkalmazását farmakokinetikai vizsgálatok és gyógyszermonitoring során, ami a klinikai laboratóriumi diagnosztika szempontjából jelentős. Ennek érdekében szükséges a különböző gyógyászati ​​anyagok – köztük az innovatív – mennyiségi meghatározására szolgáló módszerek kidolgozása és validálása a HPLC-MS/MS módszer alapján.

A nem szteroid gyulladáscsökkentők csoportjába tartozó eredeti gyógyszer az acexazolamid, az 1,3,4-tiadiazolamid és az acexámsav új származéka. Ennek a vegyületnek egy jelentős előnye az alacsony toxicitás és alacsony fekélyképződés. A farmakokinetikai vizsgálatok elvégzéséhez és a gyógyszer biológiai hozzáférhetőségének értékeléséhez különféle beadási módokon keresztül megbízható módszert kell kidolgozni a biológiai folyadékokban történő mennyiségi meghatározására.

A tanulmány célja egy új, nem szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszer azonosítására és mennyiségi meghatározására szolgáló technika kidolgozása volt a tiadiazol származékok csoportjából HPLC-MS/MS segítségével.

Anyagok és metódusok

A vizsgálat tárgya a tiadiazol LHT 7-09 laboratóriumi kódú új származéka volt, amelyet az OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) állított elő prof. S.Ya. Skachilova (1. ábra).

2-(5-etil-1,3,4-tiadiazolil)amid 2-acetil-amino-hexánsav

Rizs. 1. Az LHT 7-09 kémiai szerkezete (bruttó képlet: C 12 H 20N 4 O 2S; moláris tömege 284,4g/mol)

Az LHT 7-09 vegyület megjelenésében fehér por, amely gyakorlatilag vízben oldhatatlan, alkoholban oldódik és acetonitrilben könnyen oldódik.

Az LCT 7-09 azonosítására és mennyiségi meghatározására validált nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát használtak tömegspektrometriás detektálással (HPLC-MS/MS).

A kromatográfiát Agilent 1260 InfinityII nagy teljesítményű folyadékkromatográf segítségével (Agilent Technologies, Németország) végeztük. A vizsgálatban használt analitikai oszlop Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 × 10 mm volt. A vizsgált vegyület izolálásához gradiens kromatográfiás módot fejlesztettünk ki. Eluálószerként acetonitrilt, ionmentes vizet és ammónium-acetátot használtunk különböző arányban.

A tömegspektrometriához ABSciexQTrap 3200 MD tripla kvadrupól tömegspektrométert (ABSciex, Singapore) használtunk elektrospray ionforrással (TurboV with TurboIonSpray probe). A tömegspektrométert 6,1×10-2 mg/l koncentrációjú rezerpin tesztoldattal kalibráltuk.

A vizsgált minták tömegspektrometriás analízisét elektrospray módban, a minta és az eluátum kromatográf által biztosított közvetlen injektálásával végeztük. A vizsgálati minták tömegkromatográfba történő közvetlen befecskendezése 4,61 mm átmérőjű fecskendős pumpával történt, 10 μl/perc sebességgel.

Egy új tiadiazol-származék azonosítására és mennyiségi meghatározására szolgáló módszer kidolgozásakor a nagy teljesítményű folyadékkromatográfia és a tömegdetektálás optimális feltételeit választották ki. Figyelembe vették az anyag kromatográfiás oszlopról való felszabadulási idejét és az MRM átmenetet (regisztráció megtörtént m/z prekurzor ion az első analitikai kvadrupólon Q1 és m/z termékionok a második analitikai kvadrupólon Q3). Az LCT 7-09 mennyiségi meghatározásához kalibrációs grafikont állítottunk össze a 0,397 és 397 ng/ml közötti koncentrációtartományban.

Szoftverként az AnalystMD 1.6.2. szoftvert (ABSciex) használtuk.

Eredmények és vita

A kísérleti vizsgálat első szakaszában a vizsgált minta tömegérzékelését végeztük úgy, hogy azt fecskendős pumpával közvetlenül a tömegdetektorba vezettük. A minta-előkészítési szakaszban acetonitril és ionizált víz 2:1 arányú elegyében LHT 7-09 (500 ng/ml) oldatot készítettünk ammónium-acetát (0,1%) hozzáadásával.

Az előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a pozitív ionok regisztrálásának módjában az LHT 7-09 meghatározásának érzékenysége nagyobb, a tömegspektrum intenzívebb és informatívabb, mint a negatív ionok regisztrálásának módja esetén. E tekintetben a további vizsgálatok során csak a pozitív ionizációs módot alkalmazták.

Az intenzív csúcs eléréséhez a következő tömegérzékelési feltételeket választottuk: : pozitív polarizáció, elektrospray feszültség 5500,0 V, deklaszterezési potenciál és befecskendezési potenciál - 36,0 és 6,5 V, 20,0 psi függönygáznyomás és 40,0 psi porlasztógáz nyomás mellett, sebesség 10 μl/perc. A szkennelési tartomány 270-300 Da volt.

A Q1 első analitikai kvadrupólus kapott tömegspektrumának elemzése azt mutatta, hogy ilyen körülmények között egy hidrogén proton hozzáadása következtében a vizsgált vegyület + protonált molekulája keletkezik, melynek értéke m/ z 285,2 Igen (2. ábra).

Rizs. 2. Az LHT 7-09 protonált molekula tömegspektruma (pozitív ion + pásztázó módban)

A második Q3 analitikai kvadrupólon a prekurzor ion termékionjait a következő értékkel rögzítettük m/z 285,2 Igen. A 2. rendű tömegspektrum elemzése sok csúcs jelenlétét mutatta ki, amelyek közül 3 volt a legintenzívebb. m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da és m/z 75,1 Da (3. ábra).

Rizs. 3. Termékionok tömegspektruma (pozitív ion pásztázó módban, prekurzor ionm/ z285,2 Igen)

A nagy intenzitású ionjel eléréséhez a Q2 ütközési cellában az optimális energiaértékeket választottuk ki (0 és 400 V közötti energiatartományt vettünk figyelembe). Értékekkel rendelkező termékionokhoz m/ z 114,2 Da, 130,2 Da és 75,1 Da Az ütközőcellában az optimális energia 27 V volt. 23 V és 49 V.

Feltételezzük, hogy a termék ion értékkel m/ z A 114,2 Da az 5-amino-2-etil-1,3,4-tiadiazol töredéke, mivel más 1,3,4-tiadiazol-származékok fragmentációja szintén azonos értékű termékiont eredményez. m/ z. Termékion jelentéssel m/ z A 130,2 Da valószínűleg az acexámsav protonált része. Így a vizsgált minta tömeges kimutatásának eredményei megerősítették az új 1,3,4-tiadiazol származék kémiai szerkezetét.

A kísérleti vizsgálat következő szakaszában a tesztvegyületet HPLC-tömegspektrometriával elemeztük.

HPLC-MS/MS módban a következő ionizációs feltételeket alkalmaztuk: elektrospray feszültség 5500,0 V, mozgófázis áramlási sebessége 400 μL/perc, nitrogén hőmérséklet 400 °C, függönygáz és permetezési áramlási nyomás 20,0 és 50,0 psi. Az egyes tömegspektrumok felvételi sebessége 100 spektrum volt másodpercenként. Az összesített tömegspektrum eléréséhez a kromatogramon 10,5-11,5 perces időtartamot választottunk; A termékionok jelének intenzitása alapján a vizsgált vegyületnek megfelelő ionáram időfüggésének és az egyes jelek csúcsterületének görbéit szerkesztették. Az analitikai oszlopba bevitt minta térfogata 10 μl volt.

A vizsgált vegyület izolálásához nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás gradiens módot alkalmaztunk, amelyet az analitikai oszlop bejáratánál az eluens összetételének megváltoztatásával biztosítottunk. Eluálószerként acetonitrilt, ionmentes vizet és ammónium-acetátot használtunk különböző arányban. A gradiens kromatográfiás mód választása annak a ténynek köszönhető, hogy izokratikus elúciós mód körülményei között (beleértve az acetonitril különböző koncentrációit is) nem lehetett szimmetrikus alakú, retenciós idővel rendelkező tesztanyag csúcsot elérni. elemzésre alkalmas. A tanulmány szerint az optimális eluens-ellátási mód: 0-4 perc, az acetonitril koncentrációja 1% volt; 4-8 perc, az acetonitril koncentrációjának lineáris növekedése 99%-ra; 8-12 perc - izokratikus metszet (1% acetonitril). A vizsgálat befejezése után a kromatográfiás oszlopot 30%-os acetonitril oldattal mostuk 5 percig.

A leírt kromatográfiás módot alkalmazva megfelelő intenzitású szimmetrikus csúcsot kaptunk a vizsgált vegyületre (4. ábra).

Rizs. 4. LHT 7-09 kromatogram (analitikai oszlopAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; gradiens kromatográfiás mód)

A különböző koncentrációjú LCT 7-09 oldatok kapott kromatogramjainak elemzése azt mutatta, hogy a retenciós idő (tR) ezen elúciós körülmények között 11 perc volt, és nem függ a vizsgált anyag koncentrációjától. Ebben a tekintetben a retenciós idő értéke további kritériumként használható az LHT 7-09 hitelességének igazolására többkomponensű keverékekben. Figyelemre méltó az a tény, hogy ezekkel a kromatográfiás paraméterekkel nemcsak tömegdetektorral, hanem más detektorokkal is lehet azonosítani az LHT 7-09-et, beleértve a fotometriát is.

Az új tiadiazol-származék mennyiségi meghatározásához kalibrációs grafikont állítottunk össze a 0,397 ng/ml és 397 ng/ml közötti koncentrációtartományban (5. ábra).

Rizs. 5. Kalibrációs grafikon az LCT 7-09 koncentrációjának meghatározásához (az abszcissza tengely mentén az LCT 7-09 koncentrációja ng/ml-ben, az ordináta tengely mentén a csúcsterület impulzusokban)

A kalibrációs oldat kifejlesztéséhez LHT 7-09 oldatokat használtunk 0,397 koncentrációban; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. A csúcsterület függését a vizsgált vegyület koncentrációjától a következő regressziós egyenlettel írtuk le:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, a regressziós együttható értéke r=0,9936 volt.

Megjegyzendő, hogy a kifejlesztett kalibrációs megoldás a vizsgált vegyület nagy pontosságú kvantitatív meghatározását teszi lehetővé széles koncentráció-tartományban, ami lehetővé teszi ennek a módszernek a felhasználását egy gyógyászati ​​anyag minőségének értékelésére, illetve farmakokinetikai vizsgálatok elvégzésére.

A vizsgálat eredménye tehát a tiadiazol új aminosavszármazékának HPLC-MS/MS segítségével történő azonosítására és mennyiségi meghatározására szolgáló módszer kidolgozása volt.

következtetéseket

1. A HPLC-MS/MS lehetővé teszi a tiadiazol új aminosav-származékának nagy pontosságú azonosítását és mennyiségi meghatározását.
2. Az új LHT 7-09 tiadiazol származék tömeges kimutatását pozitív ion pásztázó módban (MRM átmeneti - prekurzor ion Q1) kell elvégezni m/ z 285,2 Igen; termékionok Q3 m/ z 114,2 Da, m/ z 130,2 Da és m/ z 75,1 Da).
3. Az LCT 7-09 többkomponensű keverékekből történő izolálására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás technikát fejlesztettek ki (analitikai oszlop Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; eluálószer acetonitril: ionmentesített víz: ammónium módú acetát; gradiens módú acetát).

Bibliográfiai link