Penerapan spektrometri massa tandem (HPLC-MSMS) dalam diagnostik klinis. Penerapan spektrometri massa tandem (HPLC-MSMS) dalam diagnostik klinis HPLC MS apa

Penggunaan kromatografi cair kinerja tinggi ditambah dengan spektrometri massa tandem (HPLC-MS/MS) di laboratorium klinis telah meningkat pesat selama 10 hingga 12 tahun terakhir, menurut ulasan yang diterbitkan dalam Clinical Biochemist Reviews. Para penulis mencatat bahwa spesifisitas analisis HPLC-MS/MS secara signifikan lebih unggul daripada metode imunologi dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) klasik untuk analisis molekul dengan berat molekul rendah dan memiliki hasil yang jauh lebih tinggi dibandingkan kromatografi gas-spektrometri massa (GC). -MS). Popularitas metode ini dalam analisis klinis rutin saat ini dijelaskan oleh kemampuan unik dari metode tersebut.

Keuntungan utama metode HPLC-MS/MS adalah:
• Kemungkinan analisis kuantitatif yang akurat terhadap molekul kecil;
• Analisis simultan terhadap beberapa senyawa target;
• Kekhususan yang unik;
• Analisis berkecepatan tinggi.

Dalam beberapa tahun terakhir, banyak perhatian telah diberikan pada waktu analisis dan, sebagai hasilnya, peningkatan produktivitas laboratorium. Pengurangan waktu analisis secara signifikan dimungkinkan dengan penggunaan kolom analitik pendek untuk HPLC/MS/MS, sekaligus meningkatkan spesifisitas analisis secara signifikan. Penggunaan ionisasi tekanan atmosfer (API), spektrometer massa tandem triple quadrupole dan kromatografi cair kinerja tinggi yang canggih, serta teknik preparasi sampel terkait, telah membawa HPLC-MS/MS ke garis depan metode analisis modern untuk penelitian klinis.

Bidang utama penerapan HPLC/MS/MS dalam pengobatan klinis:
• Memperoleh profil metabolisme lengkap panel steroid, purin dan pirimidin serta senyawa lainnya,
  skrining bayi baru lahir untuk mengetahui adanya kesalahan metabolisme bawaan (deteksi beberapa lusin penyakit dalam satu tes);
• Pemantauan terapeutik terhadap obat-obatan - imunosupresan, perotikonvulsan, antiretroviral, antikoagulan, dan lainnya - terlepas dari ketersediaan peralatan pabrik. Tidak perlu membeli perlengkapan mahal untuk setiap zat - Anda dapat mengembangkan metode Anda sendiri;
• Toksikologi klinis – analisis lebih dari 500 senyawa narkotika dan metabolitnya dalam satu analisis, tanpa analisis konfirmasi
  proteomik dan metabolomik.

Selain itu, HPLC-MSMS digunakan untuk skrining oligosakarida urin, sulfatida, asam lemak rantai panjang, asam empedu rantai panjang, asam metilmalonat, studi porfiria, dan skrining pasien dengan gangguan metabolisme purin dan pirimidin.

Contoh penerapan kromatografi cair
dalam kombinasi dengan spektrometri massa tandem dalam analisis klinis.

Skrining bayi baru lahir: Contoh pertama penggunaan HPLC-MS/MS secara luas dalam diagnostik klinis adalah skrining kesalahan metabolisme bawaan pada bayi baru lahir. Saat ini, di negara-negara maju, metode ini merupakan metode rutin dan mencakup lebih dari 30 penyakit berbeda, termasuk acedemia, aminoacidopathy, dan defek oksidasi asam lemak. Yang perlu diperhatikan secara khusus adalah penelitian mengenai cacat lahir yang dapat menyebabkan masalah serius jika tidak segera ditangani (misalnya, pembesaran jantung atau hati atau pembengkakan otak). Keuntungan menggunakan HPLC-MS/MS untuk skrining bayi baru lahir adalah kemampuan untuk menganalisis semua asam amino dan asilkarnitin secara bersamaan dengan cara yang cepat, murah, dan sangat spesifik.

Pemantauan obat terapeutik: Pengembangan dan pengenalan obat imunosupresif sirolimus (rapamycin) untuk mencegah penolakan organ setelah transplantasi telah menjadi salah satu pendorong utama pengenalan HPLC-MS/MS ke laboratorium klinis. Metode HPLC-MS/MS modern memungkinkan penentuan tacrolimus, sirolimus, siklosporin, everolimus, dan asam mikofenoat secara simultan.

HPLC-MS/MS juga digunakan untuk analisis sitotoksik, obat antiretroviral, antidepresan trisiklik, antikonvulsan dan obat lain yang memerlukan dosis individual.

Metode HPLC-MSMS memungkinkan pemisahan dan kuantifikasi enansiomer R dan S warfarin dalam kisaran konsentrasi 0,1-500 ng/ml.

Narkotika dan obat pereda nyeri: HPLC-MS/MS banyak digunakan untuk analisis senyawa ini karena kemudahan persiapan sampel dan waktu analisis yang singkat. Metode ini saat ini digunakan di laboratorium klinis untuk menyaring keberadaan berbagai macam obat. Spesifisitas dan sensitivitas unik dari metode ini memungkinkan analisis simultan lebih dari 500 senyawa dari berbagai kelas dalam satu sampel dengan persiapan sampel minimal. Jadi, dalam kasus analisis urin, pengenceran sampel sebanyak 50-100 kali sudah cukup. Saat menganalisis rambut, alih-alih sekumpulan 100-200 helai rambut, sehelai rambut saja sudah cukup untuk mengidentifikasi fakta penggunaan narkoba dengan andal.

Analisis endokrinologi dan steroid: HPLC-MS/MS banyak digunakan di banyak laboratorium endokrinologi untuk analisis steroid - testosteron, kortisol, aldesteron, progesteron, estriol dan banyak lainnya.

Semakin banyak laboratorium mulai menggunakan HPLC-MS/MS untuk menentukan kadar vitamin D3 dan D2 dalam darah.

I. Penentuan steroid (profil steroid).

Laboratorium rumah sakit dan klinik kini memiliki kemampuan untuk melakukan penentuan beberapa steroid secara simultan menggunakan HPLC/MS/MS. Dalam hal ini, volume sampel yang besar tidak diperlukan, yang sangat penting saat menganalisis sampel pediatrik.

Kasus di mana disarankan untuk menentukan beberapa steroid (profil):
• Hiperplasia adrenal kongenital (CAH) adalah kelainan bawaan pada biosintesis steroid. Ini adalah kelompok penyakit keturunan yang disebabkan oleh aktivitas enzim yang tidak tepat di korteks adrenal, yang menyebabkan penurunan produksi kortisol. Untuk diagnosis NAS yang andal, dianjurkan untuk mengukur kortisol, androstenedion, dan 17-hidroksiprogesteron. HPLC/MS/MS memungkinkan penghitungan akurat ketiga steroid dalam satu analisis dengan keyakinan 100%.
• Skrining rutin bayi baru lahir menggunakan immunoassay ditandai dengan tingginya tingkat hasil positif dan negatif palsu. Penentuan dengan HPLC/MS/MS tidak hanya kortisol, tetapi juga aldosteron dan 11-deoksikortisol memungkinkan untuk membedakan insufisiensi adrenal primer dan sekunder.
• HPLC/MS/MS memungkinkan penentuan steroid pada prostatitis dan sindrom nyeri panggul kronis.
• HPLC-MS/MS dapat menentukan profil steroid dan mengidentifikasi penyebab pubertas dini terkait korteks adrenal pada anak kecil. Ditemukan bahwa konsentrasi testosteron, androstenedion, dehydroepiandrosterone (DHEA) dan sulfatnya pada anak-anak ini sedikit lebih tinggi dibandingkan pada anak-anak kontrol yang lebih tua.
• Serum dari perokok aktif, perokok pasif, dan bukan perokok dianalisis keberadaan 15 hormon steroid dan hormon tiroid untuk menyelidiki hubungan antara paparan asap pasien dan konsentrasi hormon.
• HPLC/MS/MS digunakan dalam pembuatan profil beberapa hormon steroid wanita dalam urin.
• HPLC/MS/MS digunakan untuk mengevaluasi konsentrasi hormon neuroaktif untuk pencegahan neuropati diabetik.

II. Penentuan hormon tiroid

Metode rutin untuk menentukan hormon tiroid biasanya mengandalkan radioimmunoassay, yang mahal dan hanya mendeteksi T3 dan T4, yang mungkin membatasi kemampuan untuk menentukan dan mengatur fungsi tiroid sepenuhnya.

• Saat ini, menggunakan HPLC-MSMS, analisis simultan lima hormon tiroid dalam sampel serum dilakukan, termasuk tiroksin (T4), 3,3′,5-triiodothyronine (T3), 3,3′,5′- (rT3) , 3 ,3'-diiodothyronine (3,3'-T2) dan 3,5-diiodothyronine (3,5-T2) pada rentang konsentrasi 1 -500 ng/ml.
• Metode HPLC/MS/MS juga digunakan untuk menganalisis komposisi hormon pada pasien yang telah menjalani tiroidektomi. Tingkat konsentrasi tiroksin (T4), triiodothyronine (T3), T4 bebas dan hormon perangsang tiroid (TSH) setelah operasi ditentukan. HPLC/MS/MS telah ditemukan sebagai cara terbaik untuk menentukan hubungan antara konsentrasi TSH dan hormon tiroid.
• Metode HPLC/MS/MS digunakan untuk menentukan tiroksin (T4) dalam air liur dan serum manusia. Metode ini dicirikan oleh reproduktifitas tinggi, akurasi dan batas deteksi 25 pg/ml. Penelitian telah menunjukkan bahwa ada hubungan diagnostik dalam konsentrasi T4 air liur antara subjek eutiroid dan pasien dengan penyakit Graves.

Metode HPLC/MS/MS sekarang memiliki sensitivitas, spesifisitas dan akurasi yang diperlukan untuk penentuan semua steroid dalam cairan biologis secara andal dan dengan demikian meningkatkan kemampuan diagnostik, terutama dalam hal penentuan kumpulan steroid.

AKU AKU AKU. Penentuan 25-hidroksivitamin D dengan HPLC/MS/MS

25-hidroksi vitamin D (25OD) adalah bentuk utama vitamin D yang bersirkulasi dan merupakan prekursor bentuk aktifnya. (1,25-dihidroksivitamin D). Karena waktu paruhnya yang lama, penentuan 25OD penting untuk menentukan status vitamin D dalam tubuh pasien. Vitamin D ada dalam dua bentuk: vitamin D3 (kolekalsiferol) dan vitamin D2 (ergokalsiferol). Kedua bentuk tersebut dimetabolisme menjadi bentuk 25OD masing-masing. Yang sangat penting untuk diagnosis adalah ketersediaan metode analisis yang dapat menentukan kedua bentuk vitamin dengan akurasi tinggi dan memungkinkan pemantauan pasien dengan defisiensi vitamin D. Metode yang digunakan sejauh ini tidak memungkinkan penentuan vitamin D2 dan D3 secara terpisah. Selain itu, pada konsentrasi vitamin D2 yang tinggi, jumlah D3 yang terdeteksi diremehkan. Kerugian lainnya adalah penggunaan isotop radioaktif. Penggunaan metode HPLC/MS/MS memungkinkan tidak hanya menghindari penggunaan isotop radioaktif, namun juga melakukan penentuan terpisah terhadap kedua bentuk aktif vitamin tersebut.

Metode ini berlaku untuk pasien berikut:
1. Jika Anda mencurigai rendahnya tingkat vitamin D dalam tubuh;
2. Jika dicurigai adanya toksisitas yang tidak dapat dijelaskan;
3. Saat memeriksa pasien yang menjalani pengobatan untuk kadar vitamin D yang rendah;
4. Penggunaan HPLC/MS/MS memungkinkan penentuan kedua bentuk secara terpisah saat memantau pasien.

IV. Penentuan imunosupresan dengan HPLC/MS/MS

Setelah transplantasi organ, obat imunosupresif harus diminum seumur hidup untuk menghindari penolakan. Dengan rentang terapi yang sangat sempit dan toksisitas yang tinggi, imunosupresan memerlukan dosis individual untuk mencapai efek maksimal. Oleh karena itu, pemantauan obat imunosupresif utama: siklosporin A, tacrolimus, sirolimus dan everolimus sangat penting untuk menyesuaikan dosis obat untuk setiap pasien tergantung pada konsentrasi obat dalam darah.

Immunoassay masih digunakan untuk memantau obat-obatan ini, namun metode ini mahal dan memiliki spesifisitas, akurasi, dan reproduktifitas yang terbatas. Ada kasus kematian pasien akibat dosis imunosupresan yang salah berdasarkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode imunologi. Saat ini, immunoassay di laboratorium klinis digantikan oleh HPLC/MS/MS. Jadi, di Klinik Universitas Munich, sekitar 70 sampel dianalisis setiap hari untuk mengetahui kandungan sirolimus dan siklosporin A menggunakan sistem HPLC/MS/MS. Semua persiapan sampel dan pengendalian instrumen dilakukan oleh satu orang karyawan. Laboratorium juga beralih menguji tacrolimus menggunakan metode ini.

• Penggunaan HPLC/MS/MS untuk penentuan tacrolimus, sirolimus, ascomycin, demethixisirolimus, cyclosporin A dan cyclosporin G secara rutin dan simultan dalam darah telah dijelaskan. Kisaran yang ditentukan oleh konsentrasi adalah 1,0 - 80,0 ng/ml. Untuk siklosporin 25 - 2000 ng/ml. Sepanjang tahun ini, laboratorium menganalisis lebih dari 50.000 sampel.
• Karena penggunaan tacrolimus dan sirolimus secara simultan terbukti memiliki efek terapeutik yang positif, metode HPLC/MS/MS yang sederhana dan efektif dikembangkan untuk penentuan terpisah dalam darah untuk analisis klinis. Analisis satu sampel membutuhkan waktu 2,5 menit dengan akurasi berkisar antara 2,46% - 7,04% untuk tacrolimus dan 5,22% - 8,30% untuk sirolimus untuk keseluruhan kurva analitik. Batas bawah deteksi tacrolimus adalah 0,52 ng/ml, untuk sirolimus - 0,47 ng/ml.

V. Penentuan homosistein dengan HPLC/MS/MS

Homosistein tertarik pada penyakit kardiovaskular (tromboemboli, penyakit jantung, aterosklerosis) dan kondisi klinis lainnya (depresi, penyakit Alzheimer, osteoporosis, komplikasi kehamilan, dll.). Metode analisis homosistein saat ini, termasuk immunoassay, mahal. Metode HPLC/MS/MS cepat untuk analisis homosistein telah dikembangkan untuk penggunaan klinis rutin dalam analisis sampel dalam jumlah besar. Ionisasi dilakukan dengan metode electrospray. Metode ini dapat direproduksi, sangat spesifik dan akurat. Keuntungan metode ini juga rendahnya biaya reagen dan kemudahan penyiapan sampel. Dimungkinkan untuk menganalisis 500 sampel atau lebih per hari.

Kesimpulan

Perlu dicatat bahwa meskipun metode immunoassay yang ditingkatkan secara signifikan sekarang digunakan, karena keterbatasan fundamental teknis, metode ini tidak akan pernah memiliki keakuratan dan spesifisitas untuk zat target yang sebanding dengan HPLC-MSMS, terutama dengan adanya metabolit. Hal ini tidak hanya menyebabkan rendahnya akurasi metode ELISA dan tingginya persentase hasil positif palsu dan negatif palsu, tetapi juga tidak memungkinkan perbandingan hasil yang diperoleh di berbagai departemen klinis dengan menggunakan metode ELISA. Penggunaan HPLC-MS/MS menghilangkan kelemahan ini dan memungkinkan analisis yang sangat spesifik, akurat dan cepat terhadap sejumlah besar sampel dengan keandalan yang tinggi dengan adanya metabolit dan tidak adanya gangguan dari zat-zat yang menyertai dan endogen yang ditemukan dalam plasma dan darah. pasien.

Meskipun kompleks instrumen terlihat berbiaya tinggi, seperti yang ditunjukkan oleh praktik dunia, dengan pengoperasian yang benar, kompleks ini akan terbayar dalam 1-2 tahun. Hal ini terjadi, pertama-tama, karena rendahnya biaya satu analisis karena analisis simultan terhadap puluhan dan ratusan senyawa dan tidak adanya kebutuhan untuk membeli peralatan diagnostik yang mahal. Selain itu, laboratorium memiliki kesempatan untuk secara mandiri mengembangkan metode analisis yang diperlukan dan tidak bergantung pada produsen kit.

Memilih konfigurasi instrumentasi yang benar

Ada sejumlah besar metode spektrometri massa dan jenis spektrometer massa yang berbeda yang dirancang untuk memecahkan berbagai masalah - mulai dari identifikasi struktural makromolekul protein kompleks yang berbobot ratusan ribu Dalton hingga analisis kuantitatif rutin molekul kecil dengan throughput tinggi.

Agar berhasil memecahkan masalah, salah satu syarat utamanya adalah pemilihan jenis peralatan yang tepat. Tidak ada perangkat universal yang memungkinkan Anda menyelesaikan seluruh rangkaian masalah analitis. Dengan demikian, perangkat yang dirancang untuk memecahkan masalah identifikasi mikroorganisme tidak mampu melakukan analisis kuantitatif molekul kecil. Dan sebaliknya. Faktanya adalah, meskipun namanya umum, ini adalah perangkat yang sangat berbeda yang beroperasi berdasarkan prinsip fisik yang berbeda. Dalam kasus pertama, ini adalah spektrometer massa waktu penerbangan dengan sumber ionisasi laser - MALDI-TOF, dan yang kedua - triple quadrupole dengan ionisasi elektrospray - HPLC-MSMS.

Parameter terpenting kedua adalah memilih konfigurasi sistem yang benar. Ada beberapa produsen besar peralatan spektrometri massa. Setiap perangkat pabrikan tidak hanya memiliki kelebihannya sendiri, tetapi juga kelemahannya, yang biasanya mereka diamkan. Setiap pabrikan memproduksi lini perangkatnya sendiri. Biaya satu kompleks analitik berkisar antara 100.000 hingga 1.000.000 dolar atau lebih. Memilih pabrikan yang optimal dan konfigurasi peralatan yang tepat tidak hanya akan menghemat sumber daya keuangan yang signifikan, namun juga menyelesaikan tugas dengan lebih efektif. Sayangnya, banyak contoh peralatan laboratorium yang dikerjakan tanpa memperhitungkan faktor-faktor tersebut. Dampaknya peralatan menganggur dan uang terbuang percuma.

Faktor ketiga yang menentukan keberhasilan operasional suatu laboratorium adalah personel. Pengoperasian spektrometer massa memerlukan personel yang berkualifikasi tinggi. Sayangnya, tidak ada satu pun universitas di Rusia yang memiliki kursus spektrometri massa praktis modern, terutama yang berkaitan dengan aplikasi klinis, dan tugas pelatihan personel di setiap laboratorium harus diselesaikan sendiri-sendiri. Tentu saja, pelatihan pengantar selama 2-3 hari yang dilakukan oleh pabrikan setelah peralatan diluncurkan sama sekali tidak cukup untuk memahami dasar-dasar metode dan memperoleh keterampilan dalam mengoperasikan perangkat.

Faktor keempat adalah kurangnya metode analisis yang siap pakai. Setiap laboratorium memiliki tugas prioritasnya masing-masing, sehingga perlu mengembangkan metodenya sendiri. Hal ini dapat dilakukan oleh orang yang memiliki pengalaman minimal 2-3 tahun dalam mengoperasikan perangkat. Pabrikan terkadang menyediakan satu atau dua metode umum yang bersifat rekomendasi, tetapi tidak menyesuaikannya dengan tugas khusus laboratorium.

DI DALAM BioPharmExpert LLC Kami mempekerjakan spesialis dengan pengalaman bertahun-tahun mengerjakan berbagai jenis spektrometer massa, serta mengembangkan metode dan melakukan analisis throughput tinggi. Oleh karena itu kami menyediakan layanan berikut:

1. Memilih konfigurasi perangkat yang optimal untuk tugas spesifik klien.
2. Pembelian, pasokan, dan peluncuran peralatan dari produsen spektrometer massa tandem terkemuka. Pelatihan personel langkah demi langkah dalam waktu satu tahun sejak tanggal peluncuran peralatan.
3. Seperangkat metode dan database siap pakai untuk memecahkan masalah klinis dasar.
4. Pengembangan metode analisis dan pemecahan masalah spesifik klien di laboratoriumnya dengan keterlibatan stafnya.
5. Dukungan metodologis di semua tahap pekerjaan.

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah metode kromatografi kolom dimana fase gerak (MP) adalah cairan yang bergerak melalui kolom kromatografi yang diisi dengan fase diam (sorben). Kolom HPLC dicirikan oleh tekanan hidrolik yang tinggi pada saluran masuk kolom, itulah sebabnya HPLC kadang-kadang disebut "kromatografi cair tekanan tinggi".

Tergantung pada mekanisme pemisahan zat, varian HPLC berikut dibedakan: adsorpsi, partisi, pertukaran ion, pengecualian ukuran, kiral, dll.

Dalam kromatografi adsorpsi, pemisahan zat terjadi karena perbedaan kemampuannya dalam mengadsorpsi dan mendesorpsi dari permukaan adsorben dengan permukaan yang berkembang, misalnya silika gel.

Pada HPLC partisi, pemisahan terjadi karena perbedaan koefisien distribusi zat yang dipisahkan antara fase diam (biasanya dicangkokkan secara kimia ke permukaan pembawa diam) dan fase gerak.

Berdasarkan polaritasnya, HPLC PF dan NP dibagi menjadi fase normal dan fase terbalik.

Fase normal adalah varian kromatografi yang menggunakan sorben polar (misalnya silika gel atau silika gel dengan gugus NH 2 atau CN yang dicangkokkan) dan PF non-polar (misalnya heksana dengan berbagai aditif). Dalam kromatografi versi fase terbalik, sorben yang dimodifikasi secara kimia non-polar (misalnya, radikal alkil C 18 non-polar) dan fase gerak polar (misalnya, metanol, asetonitril) digunakan.

Dalam kromatografi penukar ion, molekul-molekul campuran zat, yang terdisosiasi dalam larutan menjadi kation dan anion, dipisahkan ketika bergerak melalui sorben (penukar kation atau penukar anion) karena perbedaan laju pertukarannya dengan gugus ionik sorben.

Dalam kromatografi eksklusi ukuran (saringan, permeasi gel, filtrasi gel), molekul zat dipisahkan berdasarkan ukuran karena kemampuannya yang berbeda untuk menembus pori-pori fase diam. Dalam hal ini, molekul terbesar (dengan berat molekul tertinggi) yang mampu menembus jumlah minimum pori-pori fase diam adalah yang pertama meninggalkan kolom, dan zat dengan ukuran molekul kecil adalah yang terakhir keluar.

seringkali pemisahan terjadi bukan melalui satu, tetapi melalui beberapa mekanisme secara bersamaan.

Metode HPLC dapat digunakan untuk mengontrol kualitas analit non-gas. Untuk melakukan analisis, instrumen yang sesuai digunakan - kromatografi cair.

Kromatografi cair biasanya mencakup komponen utama berikut:

– Unit persiapan PF, termasuk wadah dengan fase gerak (atau wadah dengan pelarut individual yang termasuk dalam fase gerak) dan sistem degassing PF;

– sistem pemompaan;

– mixer fase gerak (jika perlu);

– sistem pengenalan sampel (injektor);

– kolom kromatografi (dapat dipasang di termostat);

– detektor;

– sistem pengumpulan dan pengolahan data.

Sistem pemompaan

Pompa menyuplai PF ke kolom dengan kecepatan konstan tertentu. Komposisi fase gerak mungkin konstan atau bervariasi selama analisis. Dalam kasus pertama, prosesnya disebut isokratik, dan yang kedua disebut gradien. Filter dengan diameter pori 0,45 µm terkadang dipasang di depan sistem pemompaan untuk menyaring fase gerak. Sistem pemompaan kromatografi cair modern terdiri dari satu atau lebih pompa yang dikendalikan komputer. Hal ini memungkinkan Anda untuk mengubah komposisi PF sesuai dengan program tertentu selama elusi gradien. Pencampuran komponen PF dalam mixer dapat terjadi baik pada tekanan rendah (sebelum pemompaan) maupun pada tekanan tinggi (setelah pemompaan). Mixer dapat digunakan untuk menyiapkan PF dan selama elusi isokratik, namun rasio komponen yang lebih akurat dicapai dengan mencampurkan komponen PF terlebih dahulu untuk proses isokratik. Pompa untuk HPLC analitik memungkinkan untuk mempertahankan laju aliran PF yang konstan ke dalam kolom dalam kisaran 0,1 hingga 10 ml/menit pada tekanan pada saluran masuk kolom hingga 50 MPa. Namun disarankan agar nilai ini tidak melebihi 20 MPa. Pulsasi tekanan diminimalkan dengan sistem peredam khusus yang disertakan dalam desain pompa. Bagian kerja pompa terbuat dari bahan tahan korosi, yang memungkinkan penggunaan komponen agresif dalam komposisi PF.

Metode HPLC-MS/MS yang tervalidasi dikembangkan untuk mengidentifikasi dan mengukur turunan asam amino 1,3,4-thiadiazole baru LXT7-09. Sensitivitas maksimum deteksi spektrometri massa LHT7-09 dicapai dalam mode deteksi ion positif pada tegangan elektrospray 5500 V dan potensi deklustering 36 V. Transisi MRM yang teridentifikasi mengkonfirmasi struktur kimia turunan asam amino baru 1 ,3,4-tiadiazol. Untuk mengisolasi LXT7-09 secara efektif dari campuran multikomponen tiadiazolilamid, mode gradien kromatografi cair kinerja tinggi dikembangkan menggunakan campuran asetonitril dan air deionisasi dalam rasio berbeda sebagai eluen. Untuk kondisi kromatografi ini, waktu retensi senyawa LHT7-09 ditentukan 11 menit. Untuk penentuan kuantitatif senyawa LHT7-09, larutan kalibrasi dikembangkan untuk ketergantungan luas puncak kromatografi pada konsentrasi larutan.

HPLC-ms/ms

kromatografi

spektrometri massa

tiadiazol

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Studi aktivitas anti-inflamasi turunan thiadiazole baru pada edema kaki tikus yang diinduksi formalin / Yu.G. Kazaishvili, N.S. Popov // Masalah sains dan pendidikan modern. – 2013. – No.3.www..

2. Turunan thiadiazole baru dengan aktivitas antijamur / A.S. Koshevenko [et al.] // Kemajuan dalam mikologi medis. – 2015. – T.14. – Hal.348-351.

3. Sintesis dan aktivitas antitumor 1,3,4-thiadiazoles, 1,2,4-triazoles tersubstitusi furyl-2 baru, 1,2,4-triazoles / T.R. Hovsepyan [et al.] // Jurnal kimia-farmasi. – 2011. – T.45. – No.12. – Hal.3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Penilaian toksisitas akut turunan asam amino baru thiadiazole bila diberikan secara intraperitoneal pada tikus / N.S. Popov, M.A. Demidova // Jurnal Medis Volga Atas. – 2016. – T.15, terbitan. 1. – hal.9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Penilaian ulserogenisitas turunan asam amino baru thiadiazole bila diberikan secara intragastrik pada tikus / N.S. Popov, M.A. Demidova // Mahasiswa pascasarjana doktor. – 2017. – No.1(80). – hal.71-78.

6. Sintesis dan aktivitas antimikroba dari asam feniltio- dan benzilsulfoniasetat berdasarkan 2-amino-5-alkil(arylalkyl)-1,3,4-thiadiazoles / S.A. Serkov [et al.] // Jurnal kimia-farmasi. – 2014. – T.48, No.1. – Hal.24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Sintesis dan aktivitas farmakologi turunan imidazothiadiazole // Acta Poloniae Pharmaceutica, Penelitian Obat. 2016. Jil. 73.Tidak. 4.Hal.937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed. Sintesis dan Aktivitas Antikanker 1-Thia-4-azaspirodecane Baru, Turunan Thiazolopyrimidine dan 1,3,4-Thiadiazole Thioglikosida // Molekul. 2017. Tidak. 22(1). Hal.170.

9.Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Garam 5-amino-2-sulfonamide-1,3,4-thiadiazole, struktur dan analog acetazolamide, menunjukkan sifat penghambatan karbonat anhidrase yang menarik, tindakan diuretik, dan antikonvulsan // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Jil. 12.Tidak. 6.Hal.1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Sintesis dan aktivitas antijamur senyawa 1,3,4-thiadiazole-thiazolidinone berbasis asam dehydroabietic // Keanekaragaman Molekuler. 2016. Jil. 20.Tidak. 4.Hal.897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Sintesis, evaluasi biologis, dan studi pemodelan molekuler baru (1,2,4-triazol atau 1,3,4-thiadiazole)-metiltio-turunan quinazolin-4(3H)-one sebagai penghambat DHFR // Kimia Bioorganik. 2017. Jil. 72.Hal.282-292.

Kromatografi cair kinerja tinggi dengan deteksi spektrometri massa merupakan salah satu metode yang paling menjanjikan untuk identifikasi dan penentuan kuantitatif obat dalam berbagai objek biologis. Metode ini ditandai dengan spesifisitas tinggi, akurasi dan kemampuan untuk menentukan zat dalam konsentrasi minimal, yang memungkinkannya digunakan untuk penentuan kuantitatif obat selama studi farmakokinetik dan pemantauan obat, yang penting untuk diagnostik laboratorium klinis. Untuk itu perlu dikembangkan dan divalidasi metode penentuan kuantitatif berbagai bahan obat, termasuk yang inovatif, berdasarkan metode HPLC-MS/MS.

Obat asli dari golongan obat antiinflamasi nonsteroid adalah acexazolamide, merupakan turunan baru dari 1,3,4-thiadiazole amide dan asam asetamik. Keuntungan signifikan dari senyawa ini adalah toksisitasnya yang rendah dan ulserogenisitasnya yang rendah. Untuk melakukan studi farmakokinetik dan menilai bioavailabilitas obat ini melalui berbagai rute pemberian, perlu dikembangkan metode yang dapat diandalkan untuk penentuan kuantitatifnya dalam cairan biologis.

Tujuan dari penelitian ini merupakan pengembangan teknik identifikasi dan penentuan kuantitatif obat antiinflamasi nonsteroid baru dari golongan turunan tiadiazol menggunakan HPLC-MS/MS.

Bahan dan metode

Objek penelitian adalah turunan baru tiadiazol dengan kode laboratorium LHT 7-09 yang disintesis di OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) oleh Prof. S.Ya. Skachilova (Gbr. 1).

Asam 2-(5-etil-1,3,4-thiadiazolyl)amida 2-asetilaminoheksanoat

Beras. 1. Struktur kimia LHT 7-09 (rumus kotor: C 12 H 20N 4 HAI 2S; massa molar 284,4gram/mol)

Senyawa LHT 7-09 penampakannya berupa bubuk berwarna putih, praktis tidak larut dalam air, larut dalam alkohol, dan mudah larut dalam asetonitril.

Kromatografi cair kinerja tinggi yang divalidasi dengan metode deteksi spektrometri massa (HPLC-MS/MS) digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur LCT 7-09.

Kromatografi dilakukan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Jerman). Kolom analitik Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm digunakan dalam penelitian ini. Untuk mengisolasi senyawa yang diteliti, kami mengembangkan mode kromatografi gradien. Asetonitril, air deionisasi dan amonium asetat dalam berbagai perbandingan digunakan sebagai eluen.

Untuk spektrometri massa, digunakan spektrometer massa triple quadrupole ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapura) dengan sumber ion electrospray (TurboV dengan probe TurboIonSpray). Spektrometer massa dikalibrasi menggunakan larutan uji reserpin dengan konsentrasi 6,1×10 -2 mg/l.

Analisis spektrometri massa sampel yang diteliti dilakukan dalam mode elektrospray dengan injeksi langsung sampel dan eluat yang disuplai oleh kromatografi. Injeksi langsung sampel uji ke dalam kromatografi massa dilakukan menggunakan pompa suntik berdiameter 4,61 mm dengan kecepatan 10 μl/menit.

Saat mengembangkan metode untuk mengidentifikasi dan mengukur turunan tiadiazol baru, kondisi optimal untuk kromatografi cair kinerja tinggi dan deteksi massa dipilih. Waktu pelepasan zat dari kolom kromatografi dan transisi MRM diperhitungkan (pendaftaran dilakukan M/z ion prekursor pada kuadrupol analitik pertama Q1 dan M/z ion produk pada kuadrupol analitik kedua Q3). Untuk mengukur LCT 7-09, grafik kalibrasi dibuat dalam rentang konsentrasi dari 0,397 hingga 397 ng/ml.

AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) digunakan sebagai perangkat lunak.

hasil dan Diskusi

Pada studi eksperimental tahap pertama, deteksi massa sampel uji dilakukan dengan cara langsung memasukkannya ke dalam detektor massa menggunakan pompa jarum suntik. Pada tahap preparasi sampel, dibuat larutan LHT 7-09 (500 ng/ml) dalam campuran asetonitril dan air terionisasi dengan perbandingan 2:1 dengan penambahan amonium asetat (0,1%).

Percobaan awal menunjukkan bahwa pada mode registrasi ion positif, sensitivitas penentuan LHT 7-09 lebih tinggi, dan spektrum massa lebih intens dan informatif dibandingkan dengan mode registrasi ion negatif. Dalam hal ini, dalam penelitian lebih lanjut, hanya mode ionisasi positif yang digunakan.

Untuk mendapatkan puncak yang intens, kondisi deteksi massa berikut dipilih: : polarisasi positif, tegangan electrospray 5500,0 V, potensial deklustering dan potensial injeksi - masing-masing 36,0 dan 6,5 V, dengan tekanan gas tirai 20,0 psi dan tekanan gas atomisasi 40,0 psi, kecepatan 10 μl/mnt. Kisaran pemindaian adalah 270-300 Da.

Analisis spektrum massa yang diperoleh dari kuadrupol analitik pertama Q1 menunjukkan bahwa dalam kondisi ini, karena penambahan proton hidrogen, molekul terprotonasi dari senyawa yang diteliti + terbentuk dengan nilai M/ z 285.2 Ya (Gbr. 2).

Beras. 2. Spektrum massa molekul terprotonasi LHT 7-09 (dalam mode ion positif + pemindaian)

Pada kuadrupol analitik kedua Q3, ion produk dicatat untuk ion prekursor dengan nilainya m/z 285.2 Ya. Analisis spektrum massa orde 2 menunjukkan adanya banyak puncak, dimana 3 di antaranya paling intens - m/z 114.2 Hari, m/z 130.2 Hari dan m/z 75.1 Hari (Gbr. 3).

Beras. 3. Spektrum massa ion produk (dalam mode pemindaian ion positif, ion prekursorM/ z285.2 Ya)

Untuk mendapatkan sinyal ion intensitas tinggi, nilai energi optimal dalam sel tumbukan Q2 dipilih (kisaran energi dipertimbangkan dari 0 hingga 400 V). Untuk ion produk dengan nilai M/ z 114,2 Da, 130,2 Da dan 75,1 Da. Energi optimal dalam sel tumbukan masing-masing adalah 27 V; 23V dan 49V.

Diasumsikan bahwa produk ion bernilai M/ z 114.2 Da adalah fragmen dari 5-amino-2-etil-1,3,4-thiadiazole, karena fragmentasi turunan 1,3,4-thiadiazole lainnya juga menunjukkan ion produk dengan nilai yang sama M/ z. Ion produk dengan makna M/ z 130.2 Da mungkin merupakan bagian asam asetamat yang terprotonasi. Dengan demikian, hasil deteksi massal sampel yang diteliti mengkonfirmasi struktur kimia turunan 1,3,4-thiadiazole yang baru.

Pada studi eksperimental tahap selanjutnya, senyawa uji dianalisis dengan spektrometri massa HPLC.

Dalam mode HPLC-MS/MS, kondisi ionisasi berikut digunakan: tegangan semprotan listrik 5500,0 V, laju aliran fase gerak 400 μL/menit, suhu nitrogen 400 °C, gas tirai dan tekanan aliran semprotan masing-masing 20,0 dan 50,0 psi. Kecepatan perekaman spektrum massa tunggal adalah 100 spektrum per detik. Untuk memperoleh spektrum massa yang diringkas, periode waktu 10,5-11,5 menit dipilih pada kromatogram; Berdasarkan intensitas sinyal ion produk, kurva ketergantungan waktu arus ion dan luas puncak sinyal individu yang sesuai dengan senyawa yang diteliti dibangun. Volume sampel yang dimasukkan ke dalam kolom analitik adalah 10 μl.

Untuk mengisolasi senyawa yang diteliti, mode gradien kromatografi cair kinerja tinggi digunakan, yang dicapai dengan mengubah komposisi eluen pada saluran masuk ke kolom analitik. Asetonitril, air deionisasi dan amonium asetat dalam berbagai perbandingan digunakan sebagai eluen. Pemilihan mode kromatografi gradien disebabkan oleh kenyataan bahwa dalam kondisi mode elusi isokratik (termasuk ketika menggunakan konsentrasi asetonitril yang berbeda), tidak mungkin memperoleh puncak zat uji berbentuk simetris dengan waktu retensi. cocok untuk analisis. Menurut penelitian, mode suplai eluen yang optimal adalah: dari 0 hingga 4 menit, konsentrasi asetonitril adalah 1%; dari 4 hingga 8 menit, peningkatan linier pada konsentrasi asetonitril hingga 99%; dari 8 hingga 12 menit - bagian isokratik (1% asetonitril). Setelah penelitian selesai, kolom kromatografi dicuci dengan larutan asetonitril 30% selama 5 menit.

Saat menggunakan mode kromatografi yang dijelaskan, puncak simetris dengan intensitas yang cukup diperoleh untuk senyawa yang diteliti (Gbr. 4).

Beras. 4. Kromatogram LHT 7-09 (kolom analitiktangkasPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; mode kromatografi gradien)

Analisis kromatogram yang diperoleh untuk larutan LCT 7-09 dengan konsentrasi berbeda menunjukkan bahwa waktu retensi (tR) pada kondisi elusi tersebut adalah 11 menit dan tidak bergantung pada konsentrasi zat yang diteliti. Berkaitan dengan hal tersebut, nilai waktu retensi dapat digunakan sebagai kriteria tambahan untuk memastikan keaslian LHT 7-09 pada campuran multikomponen. Yang perlu diperhatikan adalah fakta bahwa parameter kromatografi ini dapat digunakan untuk mengidentifikasi LHT 7-09 tidak hanya menggunakan detektor massa, tetapi juga detektor lain, termasuk fotometrik.

Untuk mengukur turunan thiadiazole baru, grafik kalibrasi dibuat dalam rentang konsentrasi dari 0,397 ng/ml hingga 397 ng/ml (Gbr. 5).

Beras. 5. Grafik kalibrasi penentuan konsentrasi LCT 7-09 (sepanjang sumbu absis adalah konsentrasi LCT 7-09 dalam ng/ml, sepanjang sumbu ordinat adalah luas puncak dalam pulsa)

Untuk mengembangkan larutan kalibrasi digunakan larutan LHT 7-09 pada konsentrasi 0,397; 1.980; 3.970; 19.8; 39,7; 198.0; 397,0 ng/ml. Ketergantungan luas puncak terhadap konsentrasi senyawa yang diteliti dijelaskan dengan persamaan regresi berikut:

y= 8.9e 5 ·x 0.499, nilai koefisien regresi r=0.9936.

Perlu dicatat bahwa solusi kalibrasi yang dikembangkan memungkinkan penentuan kuantitatif presisi tinggi dari senyawa yang diteliti dalam berbagai konsentrasi, yang memungkinkan penggunaan metode ini untuk menilai kualitas bahan obat dan untuk melakukan studi farmakokinetik.

Dengan demikian, hasil penelitian tersebut adalah pengembangan metode identifikasi dan kuantifikasi turunan asam amino baru tiadiazol menggunakan HPLC-MS/MS.

kesimpulan

1. HPLC-MS/MS memungkinkan identifikasi dan kuantifikasi turunan asam amino baru thiadiazole dengan akurasi tinggi.
2. Deteksi massal turunan thiadiazole baru LHT 7-09 harus dilakukan dalam mode pemindaian ion positif (transisi MRM - ion prekursor Q1 M/ z 285.2 Ya; ion produk Q3 M/ z 114.2 Hari, M/ z 130.2 Hari dan M/ z 75.1 Hari).
3. Untuk mengisolasi LCT 7-09 dari campuran multikomponen, teknik kromatografi cair kinerja tinggi telah dikembangkan (kolom analitik Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; eluen asetonitril: air deionisasi: amonium asetat; mode gradien).

Tautan bibliografi