Εφαρμογή της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (HPLC-MSMS) στην κλινική διάγνωση. Εφαρμογή της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (HPLC-MSMS) στην κλινική διαγνωστική HPLC MS τι

Η χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης σε συνδυασμό με διαδοχική φασματομετρία μάζας (HPLC-MS/MS) στα κλινικά εργαστήρια έχει αυξηθεί τρομερά τα τελευταία 10 έως 12 χρόνια, σύμφωνα με μια ανασκόπηση που δημοσιεύτηκε στο Clinical Biochemist Reviews. Οι συγγραφείς σημειώνουν ότι η ειδικότητα της ανάλυσης HPLC-MS/MS είναι σημαντικά ανώτερη από τις ανοσολογικές μεθόδους και την κλασική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) για την ανάλυση μορίων χαμηλού μοριακού βάρους και έχει σημαντικά υψηλότερη απόδοση από την αέρια χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (GC -ΚΥΡΙΑ). Η δημοτικότητα αυτής της μεθόδου σε κλινικές αναλύσεις ρουτίνας εξηγείται επί του παρόντος από τις μοναδικές δυνατότητες της μεθόδου.

Τα κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου HPLC-MS/MS είναι:
• Δυνατότητα ακριβούς ποσοτικής ανάλυσης μικρών μορίων.
• Ταυτόχρονη ανάλυση πολλαπλών ενώσεων-στόχων.
• Μοναδική ιδιαιτερότητα.
• Υψηλή ταχύτητα ανάλυσης.

Τα τελευταία χρόνια, έχει δοθεί μεγάλη προσοχή στον χρόνο ανάλυσης και, ως εκ τούτου, στην αύξηση της παραγωγικότητας του εργαστηρίου. Σημαντικές μειώσεις στο χρόνο ανάλυσης καθίστανται δυνατές με τη χρήση σύντομων αναλυτικών στηλών για HPLC/MS/MS, ενώ αυξάνει δραματικά την ειδικότητα της ανάλυσης. Η χρήση του ιονισμού ατμοσφαιρικής πίεσης (API), του διαδοχικού τριπλού τετραπολικού φασματόμετρου μάζας και της προηγμένης υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, καθώς και των σχετικών τεχνικών προετοιμασίας δειγμάτων, έχουν φέρει το HPLC-MS/MS στην πρώτη γραμμή των σύγχρονων αναλυτικών μεθόδων για κλινική έρευνα.

Κύριοι τομείς εφαρμογής της HPLC/MS/MS στην κλινική ιατρική:
• Απόκτηση πλήρους μεταβολικού προφίλ πάνελ στεροειδών, πουρινών και πυριμιδινών και άλλων ενώσεων,
  έλεγχος νεογνών για εγγενή σφάλματα μεταβολισμού (ανίχνευση πολλών δεκάδων ασθενειών σε μία εξέταση).
• Θεραπευτική παρακολούθηση φαρμάκων - ανοσοκατασταλτικά, υπερσπασμωδικά, αντιρετροϊκά, αντιπηκτικά και άλλα - ανεξάρτητα από τη διαθεσιμότητα των κιτ του κατασκευαστή. Δεν χρειάζεται να αγοράσετε ακριβά κιτ για κάθε ουσία - μπορείτε να αναπτύξετε τις δικές σας μεθόδους.
• Κλινική τοξικολογία – ανάλυση περισσότερων από 500 ναρκωτικών ενώσεων και των μεταβολιτών τους σε μία ανάλυση, χωρίς επιβεβαιωτική ανάλυση
  πρωτεομική και μεταβολομική.

Επιπλέον, το HPLC-MSMS χρησιμοποιείται για τη διαλογή ολιγοσακχαριτών ούρων, σουλφατιδίων, λιπαρών οξέων μακράς αλυσίδας, χολικών οξέων μακράς αλυσίδας, μεθυλομηλονικού οξέος, μελέτες πορφυρίας και διαλογής ασθενών με διαταραχές του μεταβολισμού πουρίνης και πυριμιδίνης.

Παραδείγματα εφαρμογής υγρής χρωματογραφίας
σε συνδυασμό με τη διαδοχική φασματομετρία μάζας σε κλινικές αναλύσεις.

Έλεγχος νεογνών:Το πρώτο παράδειγμα ευρείας χρήσης του HPLC-MS/MS στην κλινική διάγνωση ήταν ο έλεγχος εγγενών σφαλμάτων μεταβολισμού στα νεογνά. Επί του παρόντος, στις ανεπτυγμένες χώρες, αυτή είναι μια μέθοδος ρουτίνας και καλύπτει περισσότερες από 30 διαφορετικές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της ακεδαιμίας, της αμινοξεοπάθειας και των ελαττωμάτων της οξείδωσης των λιπαρών οξέων. Ιδιαίτερα αξιοσημείωτες είναι οι μελέτες για γενετικές ανωμαλίες που μπορεί να οδηγήσουν σε σοβαρά προβλήματα εάν δεν αντιμετωπιστούν έγκαιρα (για παράδειγμα, μεγέθυνση της καρδιάς ή του ήπατος ή διόγκωση του εγκεφάλου). Το πλεονέκτημα της χρήσης HPLC-MS/MS για προσυμπτωματικό έλεγχο νεογνών είναι η δυνατότητα ταυτόχρονης ανάλυσης όλων των αμινοξέων και των ακυλκαρνιτινών με γρήγορο, φθηνό και εξαιρετικά ειδικό τρόπο.

Παρακολούθηση θεραπευτικών φαρμάκων:Η ανάπτυξη και η εισαγωγή του ανοσοκατασταλτικού φαρμάκου sirolimus (ραπαμυκίνη) για την πρόληψη της απόρριψης οργάνων μετά τη μεταμόσχευση υπήρξε ένας από τους κύριους μοχλούς για την εισαγωγή του HPLC-MS/MS στα κλινικά εργαστήρια. Η σύγχρονη μέθοδος HPLC-MS/MS επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό tacrolimus, sirolimus, cyclosporine, everolimus και mycofenoic acid.

Το HPLC-MS/MS χρησιμοποιείται επίσης για την ανάλυση κυτταροτοξικών, αντιρετροϊκών φαρμάκων, τρικυκλικών αντικαταθλιπτικών, αντισπασμωδικών και άλλων φαρμάκων που απαιτούν ατομική δόση.

Η μέθοδος HPLC-MSMS επιτρέπει τον διαχωρισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό των R- και S-εναντιομερών της βαρφαρίνης στο εύρος συγκέντρωσης 0,1-500 ng/ml.

Ναρκωτικά και παυσίπονα:Το HPLC-MS/MS χρησιμοποιείται ευρέως για την ανάλυση αυτών των ενώσεων λόγω της ευκολίας προετοιμασίας του δείγματος και του μικρού χρόνου ανάλυσης. Η μέθοδος χρησιμοποιείται επί του παρόντος σε κλινικά εργαστήρια για τον έλεγχο της παρουσίας ενός ευρέος φάσματος φαρμάκων. Η μοναδική ειδικότητα και ευαισθησία της μεθόδου καθιστά δυνατή την ταυτόχρονη ανάλυση περισσότερων από 500 ενώσεων διαφόρων κατηγοριών σε ένα δείγμα με ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Άρα, στην περίπτωση ανάλυσης ούρων, αρκεί μια απλή αραίωση του δείγματος κατά 50-100 φορές. Κατά την ανάλυση των μαλλιών, αντί για ένα μάτσο 100-200 τρίχες, αρκεί μια μόνο τρίχα για να εντοπιστούν με αξιοπιστία τα γεγονότα χρήσης ναρκωτικών.

Ενδοκρινολογία και ανάλυση στεροειδών:Το HPLC-MS/MS χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλά ενδοκρινολογικά εργαστήρια για την ανάλυση στεροειδών - τεστοστερόνης, κορτιζόλης, αλδεστερόνης, προγεστερόνης, οιστριόλης και πολλών άλλων.

Όλο και περισσότερα εργαστήρια αρχίζουν να χρησιμοποιούν HPLC-MS/MS για τον προσδιορισμό των επιπέδων της βιταμίνης D3 και D2 στο αίμα.

I. Προσδιορισμός στεροειδών (στεροειδές προφίλ).

Τα εργαστήρια νοσοκομείων και κλινικών έχουν πλέον τη δυνατότητα να πραγματοποιούν ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλαπλών στεροειδών χρησιμοποιώντας HPLC/MS/MS. Σε αυτή την περίπτωση, δεν υπάρχει ανάγκη για μεγάλο όγκο δείγματος, κάτι που είναι ιδιαίτερα σημαντικό κατά την ανάλυση παιδιατρικών δειγμάτων.

Περιπτώσεις στις οποίες είναι σκόπιμο να προσδιοριστούν πολλά (προφίλ) στεροειδή:
• Η συγγενής υπερπλασία των επινεφριδίων (CAH) είναι ένα συγγενές ελάττωμα στη βιοσύνθεση στεροειδών. Αυτή είναι μια κληρονομική ομάδα ασθενειών που προκαλούνται από ακατάλληλη δραστηριότητα των ενζύμων στον φλοιό των επινεφριδίων, η οποία οδηγεί σε μειωμένη παραγωγή κορτιζόλης. Για μια αξιόπιστη διάγνωση του NAS, συνιστάται η μέτρηση της κορτιζόλης, της ανδροστενεδιόνης και της 17-υδροξυπρογεστερόνης. Το HPLC/MS/MS επιτρέπει την ακριβή ποσοτικοποίηση και των τριών στεροειδών σε μία μόνο ανάλυση με 100% εμπιστοσύνη.
• Ο συνήθης προσυμπτωματικός έλεγχος νεογνών με τη χρήση ανοσοπροσδιορισμών χαρακτηρίζεται από υψηλό ποσοστό θετικών και ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Ο προσδιορισμός με HPLC/MS/MS όχι μόνο της κορτιζόλης, αλλά και της αλδοστερόνης και της 11-δεοξυκορτιζόλης καθιστά δυνατή τη διάκριση της πρωτοπαθούς από τη δευτεροπαθή επινεφριδιακή ανεπάρκεια.
• Το HPLC/MS/MS επιτρέπει τον προσδιορισμό των στεροειδών σε προστατίτιδα και σύνδρομο χρόνιου πυελικού πόνου.
• Το HPLC-MS/MS μπορεί να προσδιορίσει τα προφίλ στεροειδών και να εντοπίσει τις αιτίες της πρώιμης εφηβείας που σχετίζεται με τον φλοιό των επινεφριδίων σε μικρά παιδιά. Διαπιστώθηκε ότι οι συγκεντρώσεις τεστοστερόνης, ανδροστενεδιόνης, δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA) και των θειικών της σε αυτά τα παιδιά ήταν ελαφρώς υψηλότερες από ό,τι στα μεγαλύτερα παιδιά ελέγχου.
• Ο ορός από ενεργούς καπνιστές, παθητικούς καπνιστές και μη καπνιστές αναλύεται για την παρουσία 15 στεροειδών ορμονών και θυρεοειδικών ορμονών για να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ της έκθεσης στον καπνό των ασθενών και των συγκεντρώσεων ορμονών.
• Το HPLC/MS/MS χρησιμοποιείται για τη δημιουργία προφίλ ορισμένων γυναικείων στεροειδών ορμονών στα ούρα.
• Χρησιμοποιήθηκε HPLC/MS/MS για την αξιολόγηση των συγκεντρώσεων νευροδραστικών ορμονών για την πρόληψη της διαβητικής νευροπάθειας.

II. Προσδιορισμός θυρεοειδικών ορμονών

Οι συνήθεις μέθοδοι για τον προσδιορισμό των θυρεοειδικών ορμονών συνήθως βασίζονται σε ραδιοανοσοδοκιμασίες, οι οποίες είναι ακριβές και ανιχνεύουν μόνο τις Τ3 και Τ4, οι οποίες μπορεί να περιορίσουν την ικανότητα προσδιορισμού και πλήρους ρύθμισης της λειτουργίας του θυρεοειδούς.

• Επί του παρόντος, με τη χρήση HPLC-MSMS, πραγματοποιείται η ταυτόχρονη ανάλυση πέντε θυρεοειδικών ορμονών σε δείγματα ορού, συμπεριλαμβανομένων της θυροξίνης (Τ4), 3,3',5-τριιωδοθυρονίνης (Τ3), 3,3',5'- (rT3) , 3,3'-διιωδοθυρονίνη (3,3'-Τ2) και 3,5-διιωδοθυρονίνη (3,5-Τ2) στην περιοχή συγκέντρωσης 1 -500 ng/ml.
• Η μέθοδος HPLC/MS/MS χρησιμοποιείται επίσης για την ανάλυση της σύνθεσης των ορμονών σε ασθενείς που έχουν υποβληθεί σε θυρεοειδεκτομή. Προσδιορίζονται τα επίπεδα συγκέντρωσης θυροξίνης (Τ4), τριιωδοθυρονίνης (Τ3), ελεύθερης Τ4 και θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (TSH) μετά την επέμβαση. Η HPLC/MS/MS έχει βρεθεί ότι είναι ένας εξαιρετικός τρόπος για να διαπιστωθεί η σχέση μεταξύ των συγκεντρώσεων της TSH και της θυρεοειδικής ορμόνης.
• Η μέθοδος HPLC/MS/MS χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της θυροξίνης (Τ4) στο ανθρώπινο σάλιο και στον ορό. Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή αναπαραγωγιμότητα, ακρίβεια και όριο ανίχνευσης 25 pg/ml. Μελέτες έχουν δείξει ότι υπάρχει διαγνωστική σχέση στις συγκεντρώσεις της Τ4 στο σάλιο μεταξύ των ατόμων με ευθυρεοειδή και των ασθενών με νόσο του Graves.

Η μέθοδος HPLC/MS/MS έχει πλέον την ευαισθησία, την ειδικότητα και την ακρίβεια που απαιτούνται για τον αξιόπιστο προσδιορισμό όλων των στεροειδών σε βιολογικά υγρά και έτσι βελτιώνει τις διαγνωστικές δυνατότητες, ειδικά στην περίπτωση προσδιορισμού συνόλων στεροειδών.

III. Προσδιορισμός 25-υδροξυβιταμίνης D με HPLC/MS/MS

Η 25-υδροξυ βιταμίνη D (25OD) είναι η κύρια κυκλοφορούσα μορφή της βιταμίνης D και ο πρόδρομος της δραστικής της μορφής. (1,25-διυδροξυβιταμίνη D). Λόγω του μεγάλου χρόνου ημιζωής του, ο προσδιορισμός της 25OD είναι σημαντικός για τον προσδιορισμό της κατάστασης της βιταμίνης D στο σώμα του ασθενούς. Η βιταμίνη D υπάρχει σε δύο μορφές: βιταμίνη D3 (χοληκαλσιφερόλη) και βιταμίνη D2 (εργοκαλσιφερόλη). Και οι δύο μορφές μεταβολίζονται στις αντίστοιχες μορφές τους 25OD. Μεγάλη σημασία για τη διάγνωση είναι η διαθεσιμότητα αναλυτικών μεθόδων που μπορούν να προσδιορίσουν και τις δύο μορφές της βιταμίνης με υψηλή ακρίβεια και να επιτρέπουν την παρακολούθηση ασθενών με ανεπάρκεια βιταμίνης D Οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν μέχρι τώρα δεν επέτρεψαν τον ξεχωριστό προσδιορισμό της βιταμίνης D2 και D3. Επιπλέον, σε υψηλές συγκεντρώσεις βιταμίνης D2, η ανιχνεύσιμη ποσότητα της D3 υποτιμάται. Ένα άλλο μειονέκτημα είναι η χρήση ραδιενεργών ισοτόπων. Η χρήση της μεθόδου HPLC/MS/MS κατέστησε δυνατή όχι μόνο την αποφυγή της χρήσης ραδιενεργών ισοτόπων, αλλά και τη διεξαγωγή χωριστού προσδιορισμού και των δύο ενεργών μορφών της βιταμίνης.

Η μέθοδος ισχύει για τους παρακάτω ασθενείς:
1. Εάν υποψιάζεστε ένα χαμηλό επίπεδο βιταμίνης D στο σώμα.
2. Εάν υπάρχει υποψία ανεξήγητης τοξικότητας.
3. Κατά την εξέταση ασθενών που υποβάλλονται σε θεραπεία για χαμηλά επίπεδα βιταμίνης D.
4. Η χρήση HPLC/MS/MS επέτρεψε τον ξεχωριστό προσδιορισμό και των δύο μορφών κατά την παρακολούθηση ασθενών.

IV. Προσδιορισμός ανοσοκατασταλτικών με HPLC/MS/MS

Μετά τη μεταμόσχευση οργάνων, τα ανοσοκατασταλτικά φάρμακα πρέπει να λαμβάνονται εφ' όρου ζωής για να αποφευχθεί η απόρριψη. Με πολύ στενό θεραπευτικό εύρος και υψηλή τοξικότητα, τα ανοσοκατασταλτικά απαιτούν ατομική δόση για να επιτευχθεί το μέγιστο αποτέλεσμα. Επομένως, η παρακολούθηση των κύριων ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων: κυκλοσπορίνη Α, τακρόλιμους, σιρόλιμους και εβερόλιμους είναι ζωτικής σημασίας για την προσαρμογή της δόσης των φαρμάκων για κάθε ασθενή ξεχωριστά ανάλογα με τη συγκέντρωση του φαρμάκου στο αίμα.

Οι ανοσοδοκιμασίες εξακολουθούν να χρησιμοποιούνται για την παρακολούθηση αυτών των φαρμάκων, αλλά αυτές οι μέθοδοι είναι ακριβές και έχουν περιορισμένη ειδικότητα, ακρίβεια και αναπαραγωγιμότητα. Υπάρχουν περιπτώσεις θανάτου ασθενών από λανθασμένη δοσολογία ανοσοκατασταλτικών με βάση τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με τη χρήση ανοσολογικών μεθόδων. Επί του παρόντος, οι ανοσοδοκιμασίες αντικαθίστανται στα κλινικά εργαστήρια με HPLC/MS/MS. Έτσι, στην Πανεπιστημιακή Κλινική του Μονάχου αναλύονται καθημερινά περίπου 70 δείγματα για την περιεκτικότητα σε σιρόλιμους και κυκλοσπορίνη Α χρησιμοποιώντας σύστημα HPLC/MS/MS. Όλη η προετοιμασία του δείγματος και ο έλεγχος των οργάνων πραγματοποιείται από έναν υπάλληλο. Το εργαστήριο αλλάζει επίσης σε δοκιμές tacrolimus χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο.

• Περιγράφεται η χρήση HPLC/MS/MS για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό ρουτίνας τακρόλιμους, σιρόλιμους, ασκομυκίνης, δεμεθιξισιρόλιμους, κυκλοσπορίνης Α και κυκλοσπορίνης G στο αίμα. Το εύρος που προσδιορίζεται από τη συγκέντρωση είναι 1,0 - 80,0 ng/ml. Για κυκλοσπορίνη 25 - 2000 ng/ml. Κατά τη διάρκεια του έτους, το εργαστήριο ανέλυσε περισσότερα από 50.000 δείγματα.
• Δεδομένου ότι η ταυτόχρονη χρήση τακρόλιμους και σιρόλιμους βρέθηκε να έχει θετικό θεραπευτικό αποτέλεσμα, αναπτύχθηκε μια απλή και αποτελεσματική μέθοδος HPLC/MS/MS για τον ξεχωριστό προσδιορισμό τους στο αίμα για κλινική ανάλυση. Η ανάλυση ενός δείγματος διαρκεί 2,5 λεπτά με ακρίβεια που κυμαίνεται από 2,46% - 7,04% για την τακρόλιμους και 5,22% - 8,30% για το σιρόλιμους για ολόκληρη την αναλυτική καμπύλη. Το κατώτερο όριο ανίχνευσης για την τακρόλιμους είναι 0,52 ng/ml, για το σιρόλιμους - 0,47 ng/ml.

V. Προσδιορισμός ομοκυστεΐνης με HPLC/MS/MS

Η ομοκυστεΐνη παρουσιάζει ενδιαφέρον για καρδιαγγειακές παθήσεις (θρομβοεμβολή, καρδιακές παθήσεις, αθηροσκλήρωση) και άλλες κλινικές καταστάσεις (κατάθλιψη, νόσος Alzheimer, οστεοπόρωση, επιπλοκές εγκυμοσύνης κ.λπ.). Οι τρέχουσες μέθοδοι για την ανάλυση της ομοκυστεΐνης, συμπεριλαμβανομένων των ανοσοπροσδιορισμών, είναι ακριβές. Μια ταχεία μέθοδος HPLC/MS/MS για την ανάλυση της ομοκυστεΐνης έχει αναπτυχθεί για κλινική χρήση ρουτίνας στην ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Ο ιονισμός πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροψεκασμού. Η μέθοδος είναι αναπαραγώγιμη, εξαιρετικά συγκεκριμένη και ακριβής. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου είναι επίσης το χαμηλό κόστος των αντιδραστηρίων και η ευκολία προετοιμασίας του δείγματος. Είναι δυνατή η ανάλυση 500 ή περισσότερων δειγμάτων την ημέρα.

συμπέρασμα

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι παρόλο που χρησιμοποιούνται τώρα σημαντικά βελτιωμένες μέθοδοι ανοσοδοκιμασίας, λόγω τεχνικών θεμελιωδών περιορισμών, αυτή η μέθοδος δεν θα έχει ποτέ την ακρίβεια και την ειδικότητα για την ουσία στόχο συγκρίσιμη με το HPLC-MSMS, ειδικά παρουσία μεταβολιτών. Αυτό όχι μόνο οδηγεί σε χαμηλή ακρίβεια της μεθόδου ELISA και σε υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών και ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων, αλλά επίσης δεν επιτρέπει τη σύγκριση των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται σε διαφορετικά κλινικά τμήματα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ELISA. Η χρήση HPLC-MS/MS εξαλείφει αυτό το μειονέκτημα και επιτρέπει την εξαιρετικά ειδική, ακριβή και ταχεία ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων με υψηλή αξιοπιστία παρουσία μεταβολιτών και απουσία παρεμβολής από ταυτόχρονες και ενδογενείς ουσίες που βρίσκονται στο πλάσμα και το αίμα των ασθενών.

Παρά το φαινομενικό υψηλό κόστος του συγκροτήματος οργάνων, όπως δείχνει η παγκόσμια πρακτική, με σωστή λειτουργία, αυτό το συγκρότημα πληρώνει για τον εαυτό του σε 1-2 χρόνια. Αυτό συμβαίνει, πρώτα απ 'όλα, λόγω του χαμηλού κόστους μιας ανάλυσης λόγω της ταυτόχρονης ανάλυσης δεκάδων και εκατοντάδων ενώσεων και της απουσίας της ανάγκης αγοράς ακριβών διαγνωστικών κιτ. Επιπλέον, το εργαστήριο έχει την ευκαιρία να αναπτύξει ανεξάρτητα τις απαραίτητες μεθόδους ανάλυσης και να μην εξαρτάται από τον κατασκευαστή του κιτ.

Επιλογή της σωστής διαμόρφωσης οργάνων

Υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών μεθόδων φασματομετρίας μάζας και τύπων φασματόμετρων μάζας που έχουν σχεδιαστεί για να επιλύουν μια μεγάλη ποικιλία προβλημάτων - από τη δομική ταυτοποίηση σύνθετων πρωτεϊνικών μακρομορίων που ζυγίζουν εκατοντάδες χιλιάδες Dalton έως τη συνήθη ποσοτική ανάλυση μικρών μορίων υψηλής απόδοσης.

Για την επιτυχή επίλυση του προβλήματος, μία από τις κύριες προϋποθέσεις είναι η επιλογή του σωστού τύπου εξοπλισμού. Δεν υπάρχει καθολική συσκευή που να σας επιτρέπει να λύσετε ολόκληρο το φάσμα των αναλυτικών προβλημάτων. Έτσι, μια συσκευή που έχει σχεδιαστεί για να λύνει το πρόβλημα της αναγνώρισης μικροοργανισμών δεν είναι ικανή να διεξάγει ποσοτική ανάλυση μικρών μορίων. Και αντίστροφα. Το γεγονός είναι ότι, παρά το κοινό όνομα, πρόκειται για εντελώς διαφορετικές συσκευές που λειτουργούν με διαφορετικές φυσικές αρχές. Στην πρώτη περίπτωση, πρόκειται για φασματόμετρο μάζας χρόνου πτήσης με πηγή ιονισμού λέιζερ - MALDI-TOF, και στη δεύτερη - τριπλό τετράπολο με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού - HPLC-MSMS.

Η δεύτερη πιο σημαντική παράμετρος είναι η επιλογή της σωστής διαμόρφωσης συστήματος. Υπάρχουν αρκετοί μεγάλοι κατασκευαστές εξοπλισμού φασματομετρίας μάζας. Οι συσκευές κάθε κατασκευαστή δεν έχουν μόνο τα δικά τους δυνατά σημεία, αλλά και αδυναμίες, για τις οποίες συνήθως προτιμούν να σιωπούν. Κάθε κατασκευαστής παράγει τη δική του σειρά συσκευών. Το κόστος ενός αναλυτικού συγκροτήματος κυμαίνεται από 100.000 έως 1.000.000 ή περισσότερα δολάρια. Η επιλογή του βέλτιστου κατασκευαστή και της σωστής διαμόρφωσης εξοπλισμού όχι μόνο θα εξοικονομήσει σημαντικούς οικονομικούς πόρους, αλλά θα λύσει και την εργασία πιο αποτελεσματικά. Δυστυχώς, υπάρχουν πολλά παραδείγματα όπου ο εργαστηριακός εξοπλισμός πραγματοποιήθηκε χωρίς να ληφθούν υπόψη αυτοί οι παράγοντες. Το αποτέλεσμα είναι αδρανής εξοπλισμός και πεταμένα χρήματα.

Ο τρίτος παράγοντας που καθορίζει την επιτυχή λειτουργία ενός εργαστηρίου είναι το προσωπικό. Η λειτουργία των φασματόμετρων μάζας απαιτεί υψηλά καταρτισμένο προσωπικό. Δυστυχώς, κανένα πανεπιστήμιο στη Ρωσία δεν έχει μαθήματα σύγχρονης πρακτικής φασματομετρίας μάζας, ειδικά σε σχέση με κλινικές εφαρμογές, και τα καθήκοντα της εκπαίδευσης του προσωπικού σε κάθε εργαστήριο πρέπει να επιλυθούν από μόνα τους. Φυσικά, 2-3 ημέρες εισαγωγικής εκπαίδευσης που διεξάγεται από τον κατασκευαστή μετά την κυκλοφορία του εξοπλισμού δεν είναι απολύτως αρκετές για να κατανοήσετε τα βασικά της μεθόδου και να αποκτήσετε δεξιότητες χειρισμού της συσκευής.

Ο τέταρτος παράγοντας είναι η έλλειψη έτοιμων μεθόδων ανάλυσης. Κάθε εργαστήριο έχει τις δικές του εργασίες προτεραιότητας, για τις οποίες είναι απαραίτητο να αναπτύξει τις δικές του μεθόδους. Αυτό μπορεί να γίνει από άτομο που έχει τουλάχιστον 2-3 χρόνια εμπειρία στο χειρισμό της συσκευής. Οι κατασκευαστές παρέχουν μερικές φορές μία ή δύο γενικές μεθόδους συστατικού χαρακτήρα, αλλά δεν τις προσαρμόζουν στις συγκεκριμένες εργασίες του εργαστηρίου.

ΣΕ BioPharmExpert LLCΑπασχολούμε ειδικούς με πολυετή εμπειρία που εργάζονται σε διάφορους τύπους φασματόμετρων μάζας, καθώς και αναπτύσσουν μεθόδους και εκτελούν αναλύσεις υψηλής απόδοσης. Ως εκ τούτου παρέχουμε τις ακόλουθες υπηρεσίες:

1. Επιλογή της βέλτιστης διαμόρφωσης συσκευής για τις συγκεκριμένες εργασίες του πελάτη.
2. Αγορά, προμήθεια και λανσάρισμα εξοπλισμού από κορυφαίους κατασκευαστές φασματόμετρων μάζας, βήμα προς βήμα εκπαίδευση του προσωπικού εντός ενός έτους από την ημερομηνία κυκλοφορίας του εξοπλισμού.
3. Ένα σύνολο έτοιμων τεχνικών και βάσεων δεδομένων για την επίλυση βασικών κλινικών προβλημάτων.
4. Ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης και επίλυση συγκεκριμένων προβλημάτων του πελάτη στο εργαστήριό του με τη συμμετοχή του προσωπικού του.
5. Μεθοδολογική υποστήριξη σε όλα τα στάδια της εργασίας.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι μια μέθοδος χρωματογραφίας στήλης στην οποία η κινητή φάση (MP) είναι ένα υγρό που κινείται μέσα από μια στήλη χρωματογραφίας γεμάτη με μια στατική φάση (ροφητικό). Οι στήλες HPLC χαρακτηρίζονται από υψηλή υδραυλική πίεση στην είσοδο της στήλης, γι' αυτό και η HPLC ονομάζεται μερικές φορές «υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης».

Ανάλογα με τον μηχανισμό διαχωρισμού των ουσιών, διακρίνονται οι ακόλουθες επιλογές HPLC: προσρόφηση, κατανομή, ανταλλαγή ιόντων, αποκλεισμός μεγέθους, χειρόμορφη κ.λπ.

Στη χρωματογραφία προσρόφησης, ο διαχωρισμός των ουσιών συμβαίνει λόγω των διαφορετικών ικανοτήτων τους να προσροφούν και να εκροφούν από την επιφάνεια ενός προσροφητικού με ανεπτυγμένη επιφάνεια, για παράδειγμα, πυριτική γέλη.

Στην HPLC καταμερισμού, ο διαχωρισμός συμβαίνει λόγω της διαφοράς στους συντελεστές κατανομής των ουσιών που διαχωρίζονται μεταξύ της στατικής φάσης (συνήθως εμβολιάζονται χημικά στην επιφάνεια ενός στατικού φορέα) και της κινητής φάσης.

Με βάση την πολικότητα, το PF και το NP HPLC χωρίζονται σε κανονικής φάσης και αντίστροφης φάσης.

Η κανονική φάση είναι μια παραλλαγή της χρωματογραφίας που χρησιμοποιεί έναν πολικό ροφητή (για παράδειγμα, σιλικαζέλ ή πυριτική γέλη με εμβολιασμένες ομάδες NH 2 ή CN) και ένα μη πολικό PF (για παράδειγμα, εξάνιο με διάφορα πρόσθετα). Στην έκδοση αντίστροφης φάσης της χρωματογραφίας, χρησιμοποιούνται μη πολικά χημικά τροποποιημένα ροφητικά (για παράδειγμα, μη πολική αλκυλική ρίζα C 18) και πολικές κινητές φάσεις (για παράδειγμα, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο).

Στη χρωματογραφία ανταλλαγής ιόντων, τα μόρια ενός μίγματος ουσιών, που διασπώνται σε διάλυμα σε κατιόντα και ανιόντα, διαχωρίζονται όταν κινούνται μέσω ενός ροφητή (κατιονανταλλάκτη ή ανιονανταλλάκτη) λόγω των διαφορετικών ρυθμών ανταλλαγής τους με τις ιοντικές ομάδες του ροφητή.

Στη χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους (κόσκινο, διείσδυση γέλης, διήθηση γέλης), τα μόρια των ουσιών διαχωρίζονται κατά μέγεθος λόγω της διαφορετικής ικανότητάς τους να διεισδύουν στους πόρους της στατικής φάσης. Σε αυτήν την περίπτωση, τα μεγαλύτερα μόρια (με το υψηλότερο μοριακό βάρος) που μπορούν να διεισδύσουν στον ελάχιστο αριθμό πόρων της στατικής φάσης είναι τα πρώτα που εγκαταλείπουν τη στήλη και οι ουσίες με μικρά μοριακά μεγέθη είναι οι τελευταίες που φεύγουν.

Συχνά ο διαχωρισμός δεν συμβαίνει μέσω ενός, αλλά μέσω πολλών μηχανισμών ταυτόχρονα.

Η μέθοδος HPLC μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της ποιότητας οποιουδήποτε μη αέριου αναλύτη. Για τη διεξαγωγή της ανάλυσης χρησιμοποιούνται κατάλληλα όργανα - υγροί χρωματογράφοι.

Ένας υγρός χρωματογράφος συνήθως περιλαμβάνει τα ακόλουθα κύρια συστατικά:

– Μονάδα προετοιμασίας PF, που περιλαμβάνει δοχείο με την κινητή φάση (ή δοχεία με μεμονωμένους διαλύτες που περιλαμβάνονται στην κινητή φάση) και σύστημα απαέρωσης PF.

– σύστημα άντλησης·

– κινητός μείκτης φάσης (εάν είναι απαραίτητο).

– σύστημα εισαγωγής δειγμάτων (injector).

– χρωματογραφική στήλη (μπορεί να εγκατασταθεί σε θερμοστάτη).

– ανιχνευτής

– σύστημα συλλογής και επεξεργασίας δεδομένων.

Σύστημα άντλησης

Οι αντλίες παρέχουν PF στη στήλη με δεδομένη σταθερή ταχύτητα. Η σύνθεση της κινητής φάσης μπορεί να είναι σταθερή ή να ποικίλλει κατά την ανάλυση. Στην πρώτη περίπτωση, η διαδικασία ονομάζεται ισοκρατική και στη δεύτερη - κλίση. Φίλτρα με διάμετρο πόρων 0,45 μm εγκαθίστανται μερικές φορές μπροστά από το σύστημα άντλησης για να φιλτράρουν την κινητή φάση. Ένα σύγχρονο σύστημα άντλησης υγρού χρωματογράφου αποτελείται από μία ή περισσότερες αντλίες ελεγχόμενες από υπολογιστή. Αυτό σας επιτρέπει να αλλάξετε τη σύνθεση του PF σύμφωνα με ένα συγκεκριμένο πρόγραμμα κατά τη διάρκεια της έκλουσης βαθμίδωσης. Η ανάμιξη των συστατικών PF σε ένα μίξερ μπορεί να συμβεί τόσο σε χαμηλή πίεση (πριν από τις αντλίες) όσο και σε υψηλή πίεση (μετά τις αντλίες). Ο αναμικτήρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρασκευή του PF και κατά την ισοκρατική έκλουση, ωστόσο, επιτυγχάνεται πιο ακριβής αναλογία συστατικών με την προ-ανάμιξη των συστατικών PF για την ισοκρατική διαδικασία. Οι αντλίες για αναλυτική HPLC καθιστούν δυνατή τη διατήρηση σταθερού ρυθμού ροής PF στη στήλη στην περιοχή από 0,1 έως 10 ml/min σε πίεση στην είσοδο της στήλης έως και 50 MPa. Συνιστάται, ωστόσο, αυτή η τιμή να μην υπερβαίνει τα 20 MPa. Οι παλμοί της πίεσης ελαχιστοποιούνται με ειδικά συστήματα αποσβεστήρα που περιλαμβάνονται στο σχεδιασμό των αντλιών. Τα μέρη εργασίας των αντλιών είναι κατασκευασμένα από ανθεκτικά στη διάβρωση υλικά, γεγονός που επιτρέπει τη χρήση επιθετικών συστατικών στη σύνθεση PF.

Μια επικυρωμένη μέθοδος HPLC-MS/MS αναπτύχθηκε για να ταυτοποιήσει και να ποσοτικοποιήσει το νέο παράγωγο αμινοξέος 1,3,4-θειαδιαζόλης LXT7-09. Η μέγιστη ευαισθησία της φασματομετρικής ανίχνευσης μάζας του LHT7-09 επιτεύχθηκε στη λειτουργία ανίχνευσης θετικών ιόντων σε τάση ηλεκτροψεκασμού 5500 V και δυναμικό αποσύνθεσης 36 V. Οι ταυτοποιημένες μεταβάσεις MRM επιβεβαίωσαν τη χημική δομή του νέου παραγώγου αμινοξέος του 1 ,3,4-θειαδιαζόλη. Για την αποτελεσματική απομόνωση του LXT7-09 από μείγματα πολλαπλών συστατικών θειαδιαζολυλαμιδίων, αναπτύχθηκε ένας τρόπος διαβάθμισης υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης χρησιμοποιώντας ένα μείγμα ακετονιτριλίου και απιονισμένου νερού σε διαφορετικές αναλογίες ως μέσο έκλουσης. Για αυτές τις χρωματογραφικές συνθήκες, ο χρόνος κατακράτησης της ένωσης LHT7-09 προσδιορίστηκε να είναι 11 λεπτά. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ένωσης LHT7-09, αναπτύχθηκε ένα διάλυμα βαθμονόμησης για την εξάρτηση της χρωματογραφικής περιοχής κορυφής από τη συγκέντρωση του διαλύματος.

HPLC-ms/ms

χρωματογραφία

φασματομετρία μάζας

θειαδιαζόλη

1. Kazaishvili Yu.G., Popov N.S. Μελέτη της αντιφλεγμονώδους δράσης νέων παραγώγων θειαδιαζόλης σε οίδημα ποδιού που προκαλείται από φορμαλίνη σε αρουραίους / Yu.G. Καζαϊσβίλι, Ν.Σ. Popov // Σύγχρονα προβλήματα επιστήμης και εκπαίδευσης. – 2013. – Αρ. 3. www..

2. Νέα παράγωγα θειαδιαζόλης με αντιμυκητιακή δράση / A.S. Koshevenko [et al.] // Πρόοδοι στην ιατρική μυκολογία. – 2015. – Τ. 14. – Σ. 348-351.

3. Σύνθεση και αντινεοπλασματική δράση νέων 1,3,4-θειαδιαζολών, 1,2,4-τριαζολών με φουρυλ-2-υποκατεστημένη / T.R. Hovsepyan [et al.] // Chemical-pharmaceutical journal. – 2011. – Τ. 45. – Αρ. 12. – Σ. 3-7.

4. Popov N.S., Demidova M.A. Εκτίμηση της οξείας τοξικότητας ενός νέου παραγώγου αμινοξέος της θειαδιαζόλης όταν χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς / N.S. Popov, M.A. Demidova // Upper Volga Medical Journal. – 2016. – Τ. 15, τεύχος. 1. – σσ. 9-12.

5. Popov N.S., Demidova M.A. Εκτίμηση της ελκογόνου δράσης ενός νέου παραγώγου αμινοξέος της θειαδιαζόλης όταν χορηγείται ενδογαστρικά σε αρουραίους / N.S. Popov, M.A. Demidova // Γιατρός-πτυχιούχος φοιτητής. – 2017. – Νο 1(80). – σελ. 71-78.

6. Σύνθεση και αντιμικροβιακή δράση αμιδίων φαινυλθειο- και βενζυλοσουλφονυλοξικών οξέων με βάση 2-αμινο-5-αλκυλ(αρυλαλκυλ)-1,3,4-θειαδιαζόλες / S.A. Serkov [et al.] // Chemical-pharmaceutical journal. – 2014. – Τ. 48, Νο. 1. – Σελ. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Σύνθεση και φαρμακολογική δραστηριότητα παραγώγων ιμιδαζοθειαδιαζόλης // Acta Poloniae Pharmaceutica, Έρευνα φαρμάκων. 2016. Τόμ. 73.Αριθ. 4. Σ. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Anticancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, Their Derved Thiazolopyrimidine and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. Αρ. 22(1). Σελ. 170.

9. Χόρχε Ρ.Α. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Τα άλατα της 5-αμινο-2-σουλφοναμίδης-1,3,4-θειαδιαζόλης, ενός δομικού και αναλόγου της ακεταζολαμίδης, δείχνουν ενδιαφέρουσες ανασταλτικές ιδιότητες της καρβονικής ανυδράσης, διουρητική και αντισπασμωδική δράση // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Τόμ. 12.Αριθ. 6. Σ. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Σύνθεση και αντιμυκητιακή δράση ενώσεων 1,3,4-θειαδιαζόλης-θειαζολιδινόνης με βάση το αφυδροαβιετικό οξύ // Μοριακή ποικιλομορφία. 2016. Τόμ. 20.Αριθ. 4. Σ. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Σύνθεση, βιολογική αξιολόγηση και μελέτη μοριακής μοντελοποίησης νέων (1,2,4-τριαζόλη ή 1,3,4-θειοδιαζόλη)-μεθυλθειο-παραγώγων της κιναζολίνης-4(3Η)-όνης ως αναστολέων DHFR // Βιοοργανική Χημεία. 2017. Τόμ. 72. Σ. 282-292.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης με φασματομετρική ανίχνευση μάζας είναι μια από τις πιο υποσχόμενες μεθόδους για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό φαρμάκων σε διάφορα βιολογικά αντικείμενα. Η μέθοδος χαρακτηρίζεται από υψηλή ειδικότητα, ακρίβεια και ικανότητα προσδιορισμού ουσιών σε ελάχιστες συγκεντρώσεις, γεγονός που της επιτρέπει να χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό φαρμάκων κατά τη διάρκεια φαρμακοκινητικών μελετών και παρακολούθησης φαρμάκων, κάτι που είναι σημαντικό για την κλινική εργαστηριακή διάγνωση. Για το σκοπό αυτό, είναι απαραίτητο να αναπτυχθούν και να επικυρωθούν μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό διαφόρων φαρμακευτικών ουσιών, συμπεριλαμβανομένων καινοτόμων, με βάση τη μέθοδο HPLC-MS/MS.

Το αρχικό φάρμακο από την ομάδα των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων είναι το acexazolamide, ένα νέο παράγωγο του 1,3,4-thiadiazole amide και του acexamic acid. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα αυτής της ένωσης είναι η χαμηλή τοξικότητα και η χαμηλή ελκογόνος δράση. Για τη διεξαγωγή φαρμακοκινητικών μελετών και την αξιολόγηση της βιοδιαθεσιμότητας αυτού του φαρμάκου μέσω διαφόρων οδών χορήγησης, είναι απαραίτητο να αναπτυχθεί μια αξιόπιστη μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό του σε βιολογικά υγρά.

Ο σκοπός αυτής της μελέτηςήταν η ανάπτυξη μιας τεχνικής για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός νέου μη στεροειδούς αντιφλεγμονώδους φαρμάκου από την ομάδα των παραγώγων θειαδιαζόλης χρησιμοποιώντας HPLC-MS/MS.

Υλικά και μέθοδοι

Αντικείμενο της μελέτης ήταν ένα νέο παράγωγο της θειαδιαζόλης με τον εργαστηριακό κωδικό LHT 7-09, που συντέθηκε στο OJSC "VNTs BAV" (Staraya Kupavna) από τον καθηγητή. S.Ya. Skachilova (Εικ. 1).

2-(5-αιθυλ-1,3,4-θειαδιαζολυλ)αμίδιο 2-ακετυλαμινοεξανοϊκό οξύ

Ρύζι. 1. Χημική δομή του LHT 7-09 (ακαθάριστος τύπος: C 12 H 20Ν 4 Ο 2μικρό; μοριακή μάζα 284,4g/mol)

Η ένωση LHT 7-09 στην εμφάνιση είναι μια λευκή σκόνη, η οποία είναι πρακτικά αδιάλυτη στο νερό, διαλυτή σε αλκοόλη και εύκολα διαλυτή στο ακετονιτρίλιο.

Μια επικυρωμένη υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης με μέθοδο φασματομετρικής ανίχνευσης μάζας (HPLC-MS/MS) χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του LCT 7-09.

Η χρωματογραφία πραγματοποιήθηκε με τη χρήση υγρού χρωματογράφου υψηλής απόδοσης Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Γερμανία). Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκε αναλυτική στήλη Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1 x 10 mm. Για την απομόνωση της υπό μελέτη ένωσης, αναπτύξαμε έναν τρόπο χρωματογραφίας βαθμίδωσης. Ως διαλύματα έκλουσης χρησιμοποιήθηκαν ακετονιτρίλιο, απιονισμένο νερό και οξικό αμμώνιο σε διάφορες αναλογίες.

Για φασματομετρία μάζας, χρησιμοποιήθηκε ένα τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Σιγκαπούρη) με πηγή ιόντων ηλεκτροψεκασμού (TurboV με ανιχνευτή TurboIonSpray). Το φασματόμετρο μάζας βαθμονομήθηκε χρησιμοποιώντας ένα δοκιμαστικό διάλυμα ρεζερπίνης σε συγκέντρωση 6,1x10-2 mg/l.

Η φασματομετρική ανάλυση μάζας των δειγμάτων που μελετήθηκαν διεξήχθη σε τρόπο ηλεκτροψεκασμού με άμεση έγχυση του δείγματος και του εκλούσματος που παρέχεται από τον χρωματογράφο. Η απευθείας έγχυση των δειγμάτων δοκιμής στον χρωματογράφο μάζας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντλία σύριγγας με διάμετρο 4,61 mm με ταχύτητα 10 μL/min.

Κατά την ανάπτυξη μιας μεθόδου για την αναγνώριση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός νέου παραγώγου θειαδιαζόλης, επιλέχθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και ανίχνευση μάζας. Ο χρόνος απελευθέρωσης της ουσίας από τη χρωματογραφική στήλη και η μετάβαση MRM ελήφθησαν υπόψη (πραγματοποιήθηκε η καταχώριση Μ/zπρόδρομο ιόν στον πρώτο αναλυτικό τετραπόλο Q1 και Μ/zιόντα προϊόντος στο δεύτερο αναλυτικό τετραπόλο Q3). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του LCT 7-09, κατασκευάστηκε ένα γράφημα βαθμονόμησης στην περιοχή συγκέντρωσης από 0,397 έως 397 ng/ml.

Ως λογισμικό χρησιμοποιήθηκε το AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Αποτελέσματα και συζήτηση

Στο πρώτο στάδιο της πειραματικής μελέτης, η ανίχνευση μάζας του δείγματος δοκιμής πραγματοποιήθηκε με την απευθείας εισαγωγή του στον ανιχνευτή μάζας χρησιμοποιώντας μια αντλία σύριγγας. Στο στάδιο της προετοιμασίας του δείγματος, ένα διάλυμα LHT 7-09 (500 ng/ml) παρασκευάστηκε σε ένα μίγμα ακετονιτριλίου και ιονισμένου νερού σε αναλογία 2:1 με την προσθήκη οξικού αμμωνίου (0,1%).

Τα προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι στον τρόπο καταχώρησης θετικών ιόντων, η ευαισθησία του προσδιορισμού του LHT 7-09 ήταν υψηλότερη και το φάσμα μάζας ήταν πιο έντονο και πιο ενημερωτικό από ό,τι στον τρόπο καταχώρησης αρνητικών ιόντων. Από την άποψη αυτή, σε περαιτέρω μελέτες, χρησιμοποιήθηκε μόνο ο τρόπος θετικού ιονισμού.

Για να ληφθεί μια έντονη κορυφή, επιλέχθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες ανίχνευσης μάζας: : θετική πόλωση, τάση ηλεκτροψεκασμού 5500,0 V, δυναμικό αποσύνθεσης και δυναμικό έγχυσης - 36,0 και 6,5 V, αντίστοιχα, με πίεση αερίου κουρτίνας 20,0 psi και πίεση αερίου ψεκασμού 40,0 psi, ταχύτητα 10 μl/min. Το εύρος σάρωσης ήταν 270-300 Da.

Η ανάλυση του ληφθέντος φάσματος μάζας του πρώτου αναλυτικού τετραπόλου Q1 έδειξε ότι υπό αυτές τις συνθήκες, λόγω της προσθήκης πρωτονίου υδρογόνου, σχηματίζεται ένα πρωτονιωμένο μόριο της υπό μελέτη ένωσης + με την τιμή Μ/ z 285.2 Ναι (Εικ. 2).

Ρύζι. 2. Φάσμα μάζας του πρωτονιωμένου μορίου LHT 7-09 (σε λειτουργία θετικού ιόντος + σάρωσης)

Στο δεύτερο αναλυτικό τετραπολικό Q3, καταγράφηκαν ιόντα προϊόντος για το πρόδρομο ιόν με την τιμή m/z 285,2 Ναι. Η ανάλυση του φάσματος μάζας 2ης τάξης έδειξε την παρουσία πολλών κορυφών, από τις οποίες οι 3 ήταν οι πιο έντονες - m/z 114,2 Da, m/z 130,2 Da και m/z 75.1 Da (Εικ. 3).

Ρύζι. 3. Φάσμα μάζας ιόντων προϊόντων (σε λειτουργία σάρωσης θετικών ιόντων, πρόδρομο ιόνΜ/ z285,2 Ναι)

Για να ληφθεί ένα σήμα ιόντων υψηλής έντασης, επιλέχθηκαν οι βέλτιστες τιμές ενέργειας στην κυψέλη σύγκρουσης Q2 (λήφθηκε το εύρος ενέργειας από 0 έως 400 V). Για ιόντα προϊόντων με τιμές Μ/ z 114,2 Da, 130,2 Da και 75,1 Da Η βέλτιστη ενέργεια στην κυψέλη σύγκρουσης ήταν 27 V, αντίστοιχα. 23 V και 49 V.

Θεωρείται ότι το γινόμενο ιόν με την τιμή Μ/ z 114.2 Το Da είναι ένα θραύσμα 5-αμινο-2-αιθυλ-1,3,4-θειαδιαζόλης, καθώς ο κατακερματισμός άλλων παραγώγων 1,3,4-θειαδιαζόλης αποκαλύπτει επίσης ένα προϊόν ιόν με την ίδια τιμή Μ/ z. Προϊόν ιόν με νόημα Μ/ z 130.2 Το Da είναι πιθανώς ένα πρωτονιωμένο τμήμα του ακεξαμικού οξέος. Έτσι, τα αποτελέσματα της ανίχνευσης μάζας του υπό μελέτη δείγματος επιβεβαίωσαν τη χημική δομή του νέου παραγώγου 1,3,4-θειαδιαζόλης.

Στο επόμενο στάδιο της πειραματικής μελέτης, η ένωση δοκιμής αναλύθηκε με φασματομετρία μάζας HPLC.

Στη λειτουργία HPLC-MS/MS, χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες συνθήκες ιονισμού: τάση ηλεκτροψεκασμού 5500,0 V, ταχύτητα ροής κινητής φάσης 400 μL/min, θερμοκρασία αζώτου 400 °C, πίεση ροής αερίου κουρτίνας και ψεκασμού 20,0 και 50,0 psi, αντίστοιχα. Η ταχύτητα καταγραφής μεμονωμένων φασμάτων μάζας ήταν 100 φάσματα ανά δευτερόλεπτο. Για να ληφθεί το συνοπτικό φάσμα μάζας, επιλέχθηκε μια χρονική περίοδος 10,5-11,5 λεπτών στο χρωματογράφημα. Με βάση την ένταση του σήματος των ιόντων προϊόντων, κατασκευάστηκαν καμπύλες της χρονικής εξάρτησης του ρεύματος ιόντων και της περιοχής κορυφής μεμονωμένων σημάτων που αντιστοιχούν στην υπό μελέτη ένωση. Ο όγκος του δείγματος που εισήχθη στην αναλυτική στήλη ήταν 10 μl.

Για την απομόνωση της υπό μελέτη ένωσης, χρησιμοποιήθηκε ένας βαθμιδωτός τρόπος υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, ο οποίος εξασφαλίστηκε με την αλλαγή της σύνθεσης του διαλύματος έκλουσης στην είσοδο της αναλυτικής στήλης. Ως διαλύτες έκλουσης χρησιμοποιήθηκαν ακετονιτρίλιο, απιονισμένο νερό και οξικό αμμώνιο σε διάφορες αναλογίες. Η επιλογή ενός τρόπου χρωματογραφίας βαθμίδωσης οφειλόταν στο γεγονός ότι υπό συνθήκες ισοκρατικού τρόπου έκλουσης (συμπεριλαμβανομένης της χρήσης διαφορετικών συγκεντρώσεων ακετονιτριλίου), δεν ήταν δυνατό να ληφθεί μια κορυφή της υπό δοκιμή ουσίας συμμετρικού σχήματος με χρόνο κατακράτησης κατάλληλο για ανάλυση. Σύμφωνα με τη μελέτη, ο βέλτιστος τρόπος παροχής υγρού έκλουσης ήταν: από 0 έως 4 λεπτά, η συγκέντρωση ακετονιτριλίου ήταν 1%. από 4 έως 8 λεπτά, γραμμική αύξηση της συγκέντρωσης του ακετονιτριλίου στο 99%. από 8 έως 12 λεπτά - ισοκρατική τομή (1% ακετονιτρίλιο). Μετά την ολοκλήρωση της μελέτης, η χρωματογραφική στήλη πλύθηκε με διάλυμα ακετονιτριλίου 30% για 5 λεπτά.

Κατά τη χρήση του περιγραφόμενου τρόπου χρωματογραφίας, λήφθηκε μια συμμετρική κορυφή επαρκούς έντασης για την υπό μελέτη ένωση (Εικ. 4).

Ρύζι. 4. Χρωματόγραμμα LHT 7-09 (αναλυτική στήληΕυκίνητοςPoroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; λειτουργία βαθμίδωσης χρωματογραφίας)

Η ανάλυση των ληφθέντων χρωματογραφημάτων για διαλύματα LCT 7-09 διαφορετικών συγκεντρώσεων έδειξε ότι ο χρόνος κατακράτησης (tR) υπό αυτές τις συνθήκες έκλουσης ήταν 11 λεπτά και δεν εξαρτιόταν από τη συγκέντρωση της υπό μελέτη ουσίας. Από αυτή την άποψη, η τιμή του χρόνου συγκράτησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρόσθετο κριτήριο για την επιβεβαίωση της γνησιότητας του LHT 7-09 σε μείγματα πολλαπλών συστατικών. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι αυτές οι παράμετροι χρωματογραφίας μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την αναγνώριση του LHT 7-09 όχι μόνο χρησιμοποιώντας ανιχνευτή μάζας, αλλά και άλλους ανιχνευτές, συμπεριλαμβανομένων των φωτομετρικών.

Για να ποσοτικοποιηθεί το νέο παράγωγο θειαδιαζόλης, κατασκευάστηκε ένα γράφημα βαθμονόμησης στην περιοχή συγκέντρωσης από 0,397 ng/ml έως 397 ng/ml (Εικ. 5).

Ρύζι. 5. Γράφημα βαθμονόμησης για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του LCT 7-09 (κατά μήκος του άξονα της τετμημένης είναι η συγκέντρωση του LCT 7-09 σε ng/ml, κατά μήκος του άξονα τεταγμένων είναι η περιοχή κορυφής σε παλμούς)

Για την ανάπτυξη ενός διαλύματος βαθμονόμησης, χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα LHT 7-09 σε συγκεντρώσεις 0,397. 1.980; 3.970; 19.8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Η εξάρτηση της περιοχής κορυφής από τη συγκέντρωση της υπό μελέτη ένωσης περιγράφηκε από την ακόλουθη εξίσωση παλινδρόμησης:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, η τιμή του συντελεστή παλινδρόμησης ήταν r=0,9936.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το αναπτυγμένο διάλυμα βαθμονόμησης επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό υψηλής ακρίβειας της υπό μελέτη ένωσης σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων, γεγονός που καθιστά δυνατή τη χρήση αυτής της μεθόδου για την αξιολόγηση της ποιότητας μιας φαρμακευτικής ουσίας και για τη διεξαγωγή φαρμακοκινητικών μελετών.

Έτσι, το αποτέλεσμα της μελέτης ήταν η ανάπτυξη μιας μεθόδου για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός νέου παραγώγου αμινοξέος της θειαδιαζόλης χρησιμοποιώντας HPLC-MS/MS.

συμπεράσματα

1. Το HPLC-MS/MS επιτρέπει την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός νέου παραγώγου αμινοξέος της θειαδιαζόλης με υψηλή ακρίβεια.
2. Η ανίχνευση μάζας του νέου παραγώγου θειαδιαζόλης LHT 7-09 θα πρέπει να πραγματοποιείται στη λειτουργία σάρωσης θετικών ιόντων (μετάβαση MRM - πρόδρομο ιόν Q1 Μ/ z 285.2 Ναι; ιόντα προϊόντος Q3 Μ/ z 114,2 Da, Μ/ z 130,2 Da και Μ/ z 75,1 Da).
3. Για την απομόνωση του LCT 7-09 από μείγματα πολλαπλών συστατικών, έχει αναπτυχθεί μια τεχνική υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (αναλυτική στήλη Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm, ακετονιτρίλιο έκλουσης: απιονισμένο νερό: οξικό αμμώνιο, βαθμίδωση).

Βιβλιογραφικός σύνδεσμος