Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MSMS) in der klinischen Diagnostik. Anwendung der Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MSMS) in der klinischen Diagnostik HPLC MS was

Laut einer in Clinical Biochemist Reviews veröffentlichten Übersicht hat der Einsatz von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Tandem-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) in klinischen Labors in den letzten 10 bis 12 Jahren enorm zugenommen. Die Autoren weisen darauf hin, dass die Spezifität der HPLC-MS/MS-Analyse den immunologischen Methoden und der klassischen Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) zur Analyse niedermolekularer Moleküle deutlich überlegen ist und einen deutlich höheren Durchsatz aufweist als die Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC). -MS). Die Beliebtheit dieser Methode in routinemäßigen klinischen Analysen erklärt sich derzeit aus den einzigartigen Fähigkeiten der Methode.

Die Hauptvorteile der HPLC-MS/MS-Methode sind:
• Möglichkeit einer genauen quantitativen Analyse kleiner Moleküle;
• Gleichzeitige Analyse mehrerer Zielverbindungen;
• Einzigartige Spezifität;
• Hohe Analysegeschwindigkeit.

In den letzten Jahren wurde viel Wert auf die Analysezeit und damit auf die Steigerung der Laborproduktivität gelegt. Durch den Einsatz kurzer analytischer Säulen für HPLC/MS/MS wird eine deutliche Verkürzung der Analysezeit ermöglicht und gleichzeitig die Spezifität der Analyse deutlich erhöht. Der Einsatz von Atmosphärendruckionisation (API), Tandem-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer und fortschrittlicher Hochleistungsflüssigkeitschromatographie sowie damit verbundener Probenvorbereitungstechniken hat HPLC-MS/MS an die Spitze moderner Analysemethoden für die klinische Forschung gebracht.

Hauptanwendungsgebiete von HPLC/MS/MS in der klinischen Medizin:
• Erhalten eines vollständigen Stoffwechselprofils von Steroiden, Purinen und Pyrimidinen und anderen Verbindungen,
  Screening von Neugeborenen auf angeborene Stoffwechselstörungen (Nachweis mehrerer Dutzend Krankheiten in einem Test);
• Therapeutische Überwachung von Arzneimitteln – Immunsuppressiva, Perotikonvulsiva, antiretroviralen Arzneimitteln, Antikoagulanzien und anderen – unabhängig von der Verfügbarkeit der Kits des Herstellers. Sie müssen keine teuren Kits für jede Substanz kaufen – Sie können Ihre eigenen Methoden entwickeln;
• Klinische Toxikologie – Analyse von mehr als 500 narkotischen Verbindungen und ihren Metaboliten in einer Analyse, ohne Bestätigungsanalyse
  Proteomik und Metabolomik.

Darüber hinaus wird HPLC-MSMS für das Screening von Harn-Oligosacchariden, Sulfatiden, langkettigen Fettsäuren, langkettigen Gallensäuren, Methylmalonsäure, Porphyriestudien und das Screening von Patienten mit Störungen des Purin- und Pyrimidinstoffwechsels verwendet.

Anwendungsbeispiele der Flüssigkeitschromatographie
in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie in klinischen Analysen.

Neugeborenenscreening: Das erste Beispiel für den weit verbreiteten Einsatz von HPLC-MS/MS in der klinischen Diagnostik war das Screening angeborener Stoffwechselstörungen bei Neugeborenen. Derzeit ist dies in entwickelten Ländern eine Routinemethode und deckt mehr als 30 verschiedene Krankheiten ab, darunter Acetämie, Aminoazidopathie und Fettsäureoxidationsdefekte. Besonders hervorzuheben sind Studien zu Geburtsfehlern, die zu schwerwiegenden Problemen führen können, wenn sie nicht umgehend behandelt werden (z. B. eine Vergrößerung des Herzens oder der Leber oder eine Schwellung des Gehirns). Der Vorteil des Einsatzes von HPLC-MS/MS beim Neugeborenen-Screening liegt in der Möglichkeit, alle Aminosäuren und Acylcarnitine gleichzeitig schnell, kostengünstig und hochspezifisch zu analysieren.

Therapeutisches Arzneimittelmonitoring: Die Entwicklung und Einführung des Immunsuppressivums Sirolimus (Rapamycin) zur Verhinderung einer Organabstoßung nach einer Transplantation war einer der Hauptgründe für die Einführung von HPLC-MS/MS in klinischen Labors. Die moderne HPLC-MS/MS-Methode ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung von Tacrolimus, Sirolimus, Cyclosporin, Everolimus und Mycofensäure.

HPLC-MS/MS wird auch zur Analyse von zytotoxischen, antiretroviralen Arzneimitteln, trizyklischen Antidepressiva, Antikonvulsiva und anderen Arzneimitteln verwendet, die eine individuelle Dosierung erfordern.

Die HPLC-MSMS-Methode ermöglicht die Trennung und Quantifizierung der R- und S-Enantiomere von Warfarin im Konzentrationsbereich von 0,1–500 ng/ml.

Betäubungsmittel und Schmerzmittel: Aufgrund der einfachen Probenvorbereitung und der kurzen Analysezeit wird HPLC-MS/MS häufig für die Analyse dieser Verbindungen verwendet. Die Methode wird derzeit in klinischen Labors zum Screening auf das Vorhandensein einer Vielzahl von Arzneimitteln eingesetzt. Die einzigartige Spezifität und Empfindlichkeit der Methode ermöglicht die gleichzeitige Analyse von mehr als 500 Verbindungen verschiedener Klassen in einer Probe mit minimaler Probenvorbereitung. Bei der Urinanalyse reicht also eine einfache Verdünnung der Probe um das 50- bis 100-fache aus. Bei der Haaranalyse genügt statt einer Haarsträhne von 100-200 ein einzelnes Haar, um Hinweise auf einen Drogenkonsum zuverlässig zu erkennen.

Endokrinologie und Steroidanalyse: HPLC-MS/MS wird in vielen Endokrinologielabors häufig zur Analyse von Steroiden eingesetzt – Testosteron, Cortisol, Aldesteron, Progesteron, Östriol und viele andere.

Immer mehr Labore beginnen, HPLC-MS/MS zur Bestimmung der Vitamin D3- und D2-Blutspiegel einzusetzen.

I. Bestimmung von Steroiden (Steroidprofil).

Krankenhaus- und Kliniklabore haben nun die Möglichkeit, mithilfe von HPLC/MS/MS gleichzeitig mehrere Steroide zu bestimmen. In diesem Fall ist kein großes Probenvolumen erforderlich, was besonders bei der Analyse pädiatrischer Proben wichtig ist.

Fälle, in denen es ratsam ist, mehrere (Profilierungs-)Steroide zu bestimmen:
• Die angeborene Nebennierenhyperplasie (CAH) ist ein angeborener Defekt der Steroidbiosynthese. Dies ist eine erbliche Gruppe von Krankheiten, die durch eine fehlerhafte Aktivität von Enzymen in der Nebennierenrinde verursacht werden, was zu einer verminderten Cortisolproduktion führt. Für eine zuverlässige Diagnose von NAS wird empfohlen, Cortisol, Androstendion und 17-Hydroxyprogesteron zu messen. HPLC/MS/MS ermöglicht die genaue Quantifizierung aller drei Steroide in einer einzigen Analyse mit 100 %iger Sicherheit.
• Das routinemäßige Neugeborenen-Screening mittels Immunoassays ist durch eine hohe Rate positiver und falsch negativer Ergebnisse gekennzeichnet. Die Bestimmung nicht nur von Cortisol, sondern auch von Aldosteron und 11-Desoxycortisol mittels HPLC/MS/MS ermöglicht die Unterscheidung zwischen primärer und sekundärer Nebenniereninsuffizienz.
• HPLC/MS/MS ermöglicht die Bestimmung von Steroiden bei Prostatitis und chronischem Beckenschmerzsyndrom.
• HPLC-MS/MS kann Steroidprofile bestimmen und Ursachen für eine vorzeitige Pubertät im Zusammenhang mit der Nebennierenrinde bei kleinen Kindern identifizieren. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen von Testosteron, Androstendion, Dehydroepiandrosteron (DHEA) und seinem Sulfat bei diesen Kindern etwas höher waren als bei älteren Kontrollkindern.
• Das Serum von aktiven Rauchern, Passivrauchern und Nichtrauchern wird auf das Vorhandensein von 15 Steroidhormonen und Schilddrüsenhormonen analysiert, um den Zusammenhang zwischen der Rauchexposition des Patienten und den Hormonkonzentrationen zu untersuchen.
• HPLC/MS/MS wird zur Profilierung einiger weiblicher Steroidhormone im Urin verwendet.
• HPLC/MS/MS wurde verwendet, um die Konzentrationen neuroaktiver Hormone zur Vorbeugung diabetischer Neuropathie zu bewerten.

II. Bestimmung von Schilddrüsenhormonen

Routinemethoden zur Bestimmung von Schilddrüsenhormonen basieren in der Regel auf Radioimmunoassays, die teuer sind und nur T3 und T4 nachweisen, was die Fähigkeit zur Bestimmung und vollständigen Regulierung der Schilddrüsenfunktion einschränken kann.

• Derzeit wird mittels HPLC-MSMS die gleichzeitige Analyse von fünf Schilddrüsenhormonen in Serumproben durchgeführt, darunter Thyroxin (T4), 3,3′,5-Triiodthyronin (T3), 3,3′,5′- (rT3). , 3,3'-Diiodthyronin (3,3'-T2) und 3,5-Diiodthyronin (3,5-T2) im Konzentrationsbereich 1 -500 ng/ml.
• Die HPLC/MS/MS-Methode wird auch zur Analyse der Hormonzusammensetzung bei Patienten nach einer Schilddrüsenentfernung eingesetzt. Es werden die Konzentrationen von Thyroxin (T4), Trijodthyronin (T3), freiem T4 und Schilddrüsen-stimulierendem Hormon (TSH) nach der Operation bestimmt. HPLC/MS/MS hat sich als hervorragende Möglichkeit erwiesen, den Zusammenhang zwischen TSH- und Schilddrüsenhormonkonzentrationen festzustellen.
• Zur Bestimmung von Thyroxin (T4) in menschlichem Speichel und Serum wurde die HPLC/MS/MS-Methode verwendet. Die Methode zeichnet sich durch hohe Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und eine Nachweisgrenze von 25 pg/ml aus. Studien haben gezeigt, dass ein diagnostischer Zusammenhang zwischen den T4-Konzentrationen im Speichel zwischen euthyreoten Probanden und Patienten mit Morbus Basedow besteht.

Die HPLC/MS/MS-Methode verfügt nun über die erforderliche Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit für die zuverlässige Bestimmung aller Steroide in biologischen Flüssigkeiten und verbessert damit die diagnostischen Möglichkeiten, insbesondere bei der Bestimmung von Steroidsätzen.

III. Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin D mittels HPLC/MS/MS

25-Hydroxy-Vitamin D (25OD) ist die wichtigste zirkulierende Form von Vitamin D und die Vorstufe seiner aktiven Form. (1,25-Dihydroxyvitamin D). Aufgrund seiner langen Halbwertszeit ist die Bestimmung von 25OD wichtig für die Bestimmung des Vitamin-D-Status im Körper des Patienten. Vitamin D kommt in zwei Formen vor: Vitamin D3 (Cholecalciferol) und Vitamin D2 (Ergocalciferol). Beide Formen werden in ihre jeweiligen 25OD-Formen metabolisiert. Von großer Bedeutung für die Diagnose ist die Verfügbarkeit analytischer Methoden, die beide Formen des Vitamins mit hoher Genauigkeit bestimmen können und eine Überwachung von Patienten mit Vitamin-D-Mangel ermöglichen. Die bisher verwendeten Methoden ermöglichten keine getrennte Bestimmung von Vitamin D2 und D3. Zudem wird bei hohen Konzentrationen an Vitamin D2 die nachweisbare Menge an D3 unterschätzt. Ein weiterer Nachteil ist die Verwendung radioaktiver Isotope. Durch den Einsatz der HPLC/MS/MS-Methode konnte nicht nur der Einsatz radioaktiver Isotope vermieden, sondern auch eine getrennte Bestimmung beider aktiver Formen des Vitamins durchgeführt werden.

Die Methode ist für folgende Patienten anwendbar:
1. Wenn Sie einen niedrigen Vitamin-D-Spiegel im Körper vermuten;
2. Bei Verdacht auf ungeklärte Toxizität;
3. Bei der Untersuchung von Patienten, die wegen eines niedrigen Vitamin-D-Spiegels behandelt werden;
4. Der Einsatz von HPLC/MS/MS ermöglichte die getrennte Bestimmung beider Formen bei der Patientenüberwachung.

IV. Bestimmung von Immunsuppressiva mittels HPLC/MS/MS

Nach einer Organtransplantation müssen lebenslang immunsuppressive Medikamente eingenommen werden, um eine Abstoßung zu vermeiden. Aufgrund ihres sehr engen therapeutischen Spektrums und ihrer hohen Toxizität erfordern Immunsuppressiva eine individuelle Dosierung, um eine maximale Wirkung zu erzielen. Daher ist es wichtig, die wichtigsten immunsuppressiven Medikamente zu überwachen: Cyclosporin A, Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus, um die Medikamentendosis für jeden einzelnen Patienten abhängig von der Konzentration des Medikaments im Blut anzupassen.

Zur Überwachung dieser Medikamente werden immer noch Immunoassays eingesetzt, diese Methoden sind jedoch teuer und weisen eine begrenzte Spezifität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit auf. Basierend auf den Ergebnissen immunologischer Methoden gibt es Fälle von Todesfällen von Patienten durch falsche Dosierung von Immunsuppressiva. Derzeit werden Immunoassays in klinischen Laboren durch HPLC/MS/MS ersetzt. So werden am Universitätsklinikum München täglich etwa 70 Proben mit einem HPLC/MS/MS-System auf den Gehalt an Sirolimus und Cyclosporin A untersucht. Die gesamte Probenvorbereitung und Gerätekontrolle wird von einem Mitarbeiter durchgeführt. Auch das Labor stellt auf die Testung von Tacrolimus mit dieser Methode um.

• Beschrieben wird die Verwendung von HPLC/MS/MS zur routinemäßigen gleichzeitigen Bestimmung von Tacrolimus, Sirolimus, Ascomycin, Demethixisirolimus, Cyclosporin A und Cyclosporin G im Blut. Der durch die Konzentration bestimmte Bereich liegt zwischen 1,0 und 80,0 ng/ml. Für Cyclosporin 25 - 2000 ng/ml. Im Laufe des Jahres analysierte das Labor mehr als 50.000 Proben.
• Da festgestellt wurde, dass die gleichzeitige Anwendung von Tacrolimus und Sirolimus einen positiven therapeutischen Effekt hat, wurde eine einfache und effektive HPLC/MS/MS-Methode für deren getrennte Bestimmung im Blut für die klinische Analyse entwickelt. Die Analyse einer Probe dauert 2,5 Minuten mit einer Genauigkeit von 2,46 % bis 7,04 % für Tacrolimus und 5,22 % bis 8,30 % für Sirolimus für die gesamte Analysekurve. Die untere Nachweisgrenze für Tacrolimus liegt bei 0,52 ng/ml, für Sirolimus bei 0,47 ng/ml.

V. Bestimmung von Homocystein mittels HPLC/MS/MS

Homocystein ist bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen (Thromboembolie, Herzerkrankungen, Arteriosklerose) und anderen klinischen Zuständen (Depression, Alzheimer-Krankheit, Osteoporose, Schwangerschaftskomplikationen usw.) von Interesse. Aktuelle Methoden zur Homocystein-Analyse, einschließlich Immunoassays, sind teuer. Eine schnelle HPLC/MS/MS-Methode zur Analyse von Homocystein wurde für den routinemäßigen klinischen Einsatz bei der Analyse einer großen Anzahl von Proben entwickelt. Die Ionisierung erfolgte mittels Elektrospray-Methode. Die Methode ist reproduzierbar, hochspezifisch und genau. Zu den Vorteilen der Methode zählen außerdem die geringen Kosten für Reagenzien und die einfache Probenvorbereitung. Es ist möglich, 500 oder mehr Proben pro Tag zu analysieren.

Abschluss

Es ist zu beachten, dass trotz der Verwendung deutlich verbesserter Immunoassay-Methoden aufgrund grundlegender technischer Einschränkungen diese Methode niemals die mit HPLC-MSMS vergleichbare Genauigkeit und Spezifität für die Zielsubstanz aufweisen wird, insbesondere in Gegenwart von Metaboliten. Dies führt nicht nur zu einer geringen Genauigkeit der ELISA-Methode und einem hohen Prozentsatz falsch positiver und falsch negativer Ergebnisse, sondern ermöglicht auch keinen Vergleich der Ergebnisse, die in verschiedenen klinischen Abteilungen mit der ELISA-Methode erzielt wurden. Der Einsatz von HPLC-MS/MS beseitigt diesen Nachteil und ermöglicht eine hochspezifische, genaue und schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben mit hoher Zuverlässigkeit in Gegenwart von Metaboliten und ohne Störungen durch begleitende und endogene Substanzen im Plasma und Blut der Patienten.

Trotz der offensichtlich hohen Kosten des Instrumentenkomplexes amortisiert sich dieser Komplex, wie die weltweite Praxis zeigt, bei ordnungsgemäßem Betrieb in 1-2 Jahren. Dies liegt vor allem an den geringen Kosten einer Analyse aufgrund der gleichzeitigen Analyse von Dutzenden oder Hunderten von Verbindungen und dem Fehlen der Notwendigkeit, teure Diagnosekits zu kaufen. Darüber hinaus hat das Labor die Möglichkeit, alle notwendigen Analysemethoden selbstständig zu entwickeln und ist nicht auf den Kit-Hersteller angewiesen.

Auswahl der richtigen Instrumentierungskonfiguration

Es gibt eine große Anzahl verschiedener Massenspektrometriemethoden und Arten von Massenspektrometern, die zur Lösung einer Vielzahl von Problemen entwickelt wurden – von der strukturellen Identifizierung komplexer Proteinmakromoleküle mit einem Gewicht von Hunderttausenden Dalton bis hin zur routinemäßigen quantitativen Hochdurchsatzanalyse kleiner Moleküle.

Um das Problem erfolgreich zu lösen, ist die Wahl des richtigen Gerätetyps eine der Hauptvoraussetzungen. Es gibt kein universelles Gerät, mit dem Sie die gesamte Bandbreite analytischer Probleme lösen können. Daher ist ein Gerät zur Lösung des Problems der Identifizierung von Mikroorganismen nicht in der Lage, eine quantitative Analyse kleiner Moleküle durchzuführen. Umgekehrt. Tatsache ist, dass es sich trotz des gebräuchlichen Namens um völlig unterschiedliche Geräte handelt, die nach unterschiedlichen physikalischen Prinzipien arbeiten. Im ersten Fall handelt es sich um ein Flugzeitmassenspektrometer mit einer Laserionisationsquelle – MALDI-TOF, und im zweiten Fall um einen Dreifachquadrupol mit Elektrospray-Ionisation – HPLC-MSMS.

Der zweitwichtigste Parameter ist die Wahl der richtigen Systemkonfiguration. Es gibt mehrere große Hersteller von Massenspektrometriegeräten. Die Geräte jedes Herstellers haben nicht nur ihre eigenen Stärken, sondern auch Schwächen, über die sie meist lieber schweigen. Jeder Hersteller produziert seine eigene Gerätelinie. Die Kosten für einen Analysekomplex liegen zwischen 100.000 und 1.000.000 Dollar oder mehr. Die Wahl des optimalen Herstellers und der richtigen Gerätekonfiguration spart nicht nur erhebliche finanzielle Ressourcen, sondern löst die Aufgabe auch effizienter. Leider gibt es viele Beispiele, bei denen Laborgeräte ohne Berücksichtigung dieser Faktoren durchgeführt wurden. Das Ergebnis sind ungenutzte Geräte und Geldverschwendung.

Der dritte Faktor, der den erfolgreichen Betrieb eines Labors bestimmt, ist das Personal. Der Betrieb von Massenspektrometern erfordert hochqualifiziertes Personal. Leider gibt es in Russland an keiner einzigen Universität einen Kurs in moderner praktischer Massenspektrometrie, insbesondere in Bezug auf klinische Anwendungen, und die Aufgaben der Ausbildung des Personals in jedem Labor müssen selbst gelöst werden. Natürlich reichen 2-3 Tage Einführungsschulung durch den Hersteller nach der Markteinführung des Gerätes absolut nicht aus, um die Grundlagen der Methode zu verstehen und sich Kenntnisse im Umgang mit dem Gerät anzueignen.

Der vierte Faktor ist der Mangel an vorgefertigten Analysemethoden. Jedes Labor hat seine eigenen vorrangigen Aufgaben, für die es notwendig ist, eigene Methoden zu entwickeln. Dies kann von einer Person durchgeführt werden, die über mindestens 2-3 Jahre Erfahrung im Umgang mit dem Gerät verfügt. Hersteller bieten manchmal ein oder zwei allgemeine Methoden mit Empfehlungscharakter an, passen diese jedoch nicht an die spezifischen Aufgaben des Labors an.

IN BioPharmExpert LLC Wir beschäftigen Spezialisten mit langjähriger Erfahrung in der Arbeit an verschiedenen Arten von Massenspektrometern sowie in der Entwicklung von Methoden und der Durchführung von Hochdurchsatzanalysen. Deshalb bieten wir folgende Dienstleistungen an:

1. Auswahl der optimalen Gerätekonfiguration für die spezifischen Aufgaben des Kunden.
2. Kauf, Lieferung und Einführung von Geräten führender Hersteller von Tandem-Massenspektrometern. Schrittweise Schulung des Personals innerhalb eines Jahres ab dem Datum der Geräteeinführung.
3. Eine Reihe vorgefertigter Methoden und Datenbanken zur Lösung grundlegender klinischer Probleme.
4. Entwicklung von Analysemethoden und Lösung spezifischer Probleme des Kunden in seinem Labor unter Einbindung seiner Mitarbeiter.
5. Methodische Unterstützung in allen Phasen der Arbeit.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Säulenchromatographiemethode, bei der die mobile Phase (MP) eine Flüssigkeit ist, die sich durch eine Chromatographiesäule bewegt, die mit einer stationären Phase (Sorbens) gefüllt ist. HPLC-Säulen zeichnen sich durch einen hohen hydraulischen Druck am Säuleneinlass aus, weshalb HPLC manchmal auch „Hochdruckflüssigkeitschromatographie“ genannt wird.

Abhängig vom Mechanismus der Stofftrennung werden folgende HPLC-Optionen unterschieden: Adsorption, Verteilung, Ionenaustausch, Größenausschluss, chiral usw.

Bei der Adsorptionschromatographie erfolgt die Trennung von Substanzen aufgrund ihrer unterschiedlichen Adsorptions- und Desorptionsfähigkeiten an der Oberfläche eines Adsorbens mit entwickelter Oberfläche, beispielsweise Kieselgel.

Bei der Verteilungs-HPLC erfolgt die Trennung aufgrund der unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten der zu trennenden Substanzen zwischen der stationären Phase (normalerweise chemisch auf die Oberfläche eines stationären Trägers aufgepfropft) und der mobilen Phase.

Basierend auf der Polarität werden PF- und NP-HPLC in Normalphasen- und Umkehrphasen-HPLC unterteilt.

Normalphase ist eine Variante der Chromatographie, die ein polares Sorbens (z. B. Kieselgel oder Kieselgel mit gepfropften NH 2- oder CN-Gruppen) und ein unpolares PF (z. B. Hexan mit verschiedenen Zusätzen) verwendet. In der Umkehrphasenversion der Chromatographie werden unpolare chemisch modifizierte Sorbentien (z. B. unpolarer Alkylrest C 18) und polare mobile Phasen (z. B. Methanol, Acetonitril) verwendet.

Bei der Ionenaustauschchromatographie werden die in Lösung in Kationen und Anionen dissoziierten Moleküle eines Stoffgemisches bei der Bewegung durch ein Sorbens (Kationenaustauscher oder Anionenaustauscher) aufgrund ihrer unterschiedlichen Austauschgeschwindigkeit mit den ionischen Gruppen des Sorbens getrennt.

Bei der Größenausschlusschromatographie (Sieb, Gelpermeation, Gelfiltration) werden Stoffmoleküle aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeit, in die Poren der stationären Phase einzudringen, nach ihrer Größe getrennt. In diesem Fall verlassen die größten Moleküle (mit dem höchsten Molekulargewicht), die in die minimale Anzahl von Poren der stationären Phase eindringen können, als erste die Säule, und Substanzen mit kleinen Molekülgrößen verlassen die Säule als letzte.

Oft erfolgt die Trennung nicht durch einen, sondern durch mehrere Mechanismen gleichzeitig.

Mit der HPLC-Methode kann die Qualität aller nicht gasförmigen Analyten kontrolliert werden. Zur Durchführung der Analyse werden entsprechende Instrumente eingesetzt – Flüssigkeitschromatographen.

Ein Flüssigkeitschromatograph umfasst normalerweise die folgenden Hauptkomponenten:

– PF-Aufbereitungseinheit, einschließlich eines Behälters mit der mobilen Phase (oder Behältern mit einzelnen Lösungsmitteln, die in der mobilen Phase enthalten sind) und einem PF-Entgasungssystem;

– Pumpsystem;

– mobiler Phasenmischer (falls erforderlich);

– Probeneinführungssystem (Injektor);

– Chromatographiesäule (kann in einen Thermostat eingebaut werden);

– Detektor;

– Datenerfassungs- und -verarbeitungssystem.

Pumpsystem

Pumpen versorgen die Säule mit einer bestimmten konstanten Geschwindigkeit mit PF. Die Zusammensetzung der mobilen Phase kann während der Analyse konstant sein oder variieren. Im ersten Fall wird der Prozess als isokratisch und im zweiten Fall als Gradient bezeichnet. Um die mobile Phase zu filtern, werden manchmal Filter mit einem Porendurchmesser von 0,45 µm vor dem Pumpsystem installiert. Ein modernes Flüssigkeitschromatograph-Pumpsystem besteht aus einer oder mehreren computergesteuerten Pumpen. Dadurch können Sie die Zusammensetzung des PF gemäß einem bestimmten Programm während der Gradientenelution ändern. Das Mischen von PF-Komponenten in einem Mischer kann sowohl bei niedrigem Druck (vor den Pumpen) als auch bei hohem Druck (nach den Pumpen) erfolgen. Der Mischer kann zur Vorbereitung des PF und während der isokratischen Elution verwendet werden. Ein genaueres Verhältnis der Komponenten wird jedoch durch Vormischen der PF-Komponenten für den isokratischen Prozess erreicht. Pumpen für die analytische HPLC ermöglichen die Aufrechterhaltung einer konstanten Flussrate von PF in die Säule im Bereich von 0,1 bis 10 ml/min bei einem Druck am Säuleneingang von bis zu 50 MPa. Es wird jedoch empfohlen, dass dieser Wert 20 MPa nicht überschreitet. Druckpulsationen werden durch spezielle Dämpfersysteme minimiert, die in die Konstruktion der Pumpen integriert sind. Die Arbeitsteile der Pumpen bestehen aus korrosionsbeständigen Materialien, was die Verwendung aggressiver Komponenten in der PF-Zusammensetzung ermöglicht.

Zur Identifizierung und Quantifizierung des neuen 1,3,4-Thiadiazol-Aminosäurederivats LXT7-09 wurde eine validierte HPLC-MS/MS-Methode entwickelt. Die maximale Empfindlichkeit des massenspektrometrischen Nachweises von LHT7-09 wurde im Positivionen-Detektionsmodus bei einer Elektrospray-Spannung von 5500 V und einem Declustering-Potential von 36 V erreicht. Die identifizierten MRM-Übergänge bestätigten die chemische Struktur des neuen Aminosäurederivats von 1 ,3,4-Thiadiazol. Um LXT7-09 effektiv aus Mehrkomponentenmischungen von Thiadiazolylamiden zu isolieren, wurde ein Gradientenmodus der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie entwickelt, bei dem eine Mischung aus Acetonitril und entionisiertem Wasser in unterschiedlichen Verhältnissen als Elutionsmittel verwendet wurde. Für diese chromatographischen Bedingungen wurde die Retentionszeit der Verbindung LHT7-09 mit 11 Minuten bestimmt. Zur quantitativen Bestimmung der Verbindung LHT7-09 wurde eine Kalibrierlösung für die Abhängigkeit der chromatographischen Peakfläche von der Lösungskonzentration entwickelt.

HPLC-ms/ms

Chromatographie

Massenspektrometer

Thiadiazol

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Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion ist eine der vielversprechendsten Methoden zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln in verschiedenen biologischen Objekten. Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Spezifität, Genauigkeit und die Fähigkeit zur Bestimmung von Substanzen in minimalen Konzentrationen aus und ermöglicht den Einsatz zur quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln im Rahmen pharmakokinetischer Studien und des Arzneimittelmonitorings, was für die klinische Labordiagnostik von Bedeutung ist. Hierzu ist die Entwicklung und Validierung von Methoden zur quantitativen Bestimmung verschiedener, auch innovativer Arzneistoffe auf Basis der HPLC-MS/MS-Methode erforderlich.

Das Originalarzneimittel aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antirheumatika ist Acexazolamid, ein neues Derivat von 1,3,4-Thiadiazolamid und Acexamsäure. Ein wesentlicher Vorteil dieser Verbindung ist ihre geringe Toxizität und geringe Ulzerogenität. Um pharmakokinetische Studien durchzuführen und die Bioverfügbarkeit dieses Arzneimittels über verschiedene Verabreichungswege zu beurteilen, ist es notwendig, eine zuverlässige Methode für seine quantitative Bestimmung in biologischen Flüssigkeiten zu entwickeln.

Der Zweck dieser Studie war die Entwicklung einer Technik zur Identifizierung und quantitativen Bestimmung eines neuen nichtsteroidalen Antiphlogistikums aus der Gruppe der Thiadiazol-Derivate mittels HPLC-MS/MS.

Materialen und Methoden

Gegenstand der Studie war ein neues Derivat von Thiadiazol mit dem Laborcode LHT 7-09, synthetisiert bei OJSC „VNTs BAV“ (Staraya Kupavna) von Prof. S.Ya. Skachilova (Abb. 1).

2-(5-Ethyl-1,3,4-thiadiazolyl)amid-2-acetylaminohexansäure

Reis. 1. Chemische Struktur von LHT 7-09 (Bruttoformel: C 12 H 20).N 4 O 2S; Molmasse 284,4g/mol)

Die Verbindung LHT 7-09 ist optisch ein weißes Pulver, das in Wasser praktisch unlöslich, in Alkohol löslich und in Acetonitril leicht löslich ist.

Zur Identifizierung und Quantifizierung von LCT 7-09 wurde eine validierte Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (HPLC-MS/MS) verwendet.

Die Chromatographie wurde mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographen Agilent 1260 InfinityII (Agilent Technologies, Deutschland) durchgeführt. In der Studie wurde eine Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1 x 10 mm Analysesäule verwendet. Um die untersuchte Verbindung zu isolieren, haben wir einen Gradientenchromatographiemodus entwickelt. Als Elutionsmittel wurden Acetonitril, entionisiertes Wasser und Ammoniumacetat in verschiedenen Verhältnissen verwendet.

Für die Massenspektrometrie wurde ein Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer ABSciexQTrap 3200 MD (ABSciex, Singapur) mit einer Elektrospray-Ionenquelle (TurboV mit TurboIonSpray-Sonde) verwendet. Das Massenspektrometer wurde mit einer Testlösung von Reserpin in einer Konzentration von 6,1 × 10 –2 mg/l kalibriert.

Die massenspektrometrische Analyse der untersuchten Proben wurde im Elektrospray-Modus mit direkter Injektion der vom Chromatographen gelieferten Probe und des Eluats durchgeführt. Die direkte Injektion der Testproben in den Massenchromatographen erfolgte mit einer Spritzenpumpe mit einem Durchmesser von 4,61 mm und einer Geschwindigkeit von 10 μL/min.

Bei der Entwicklung einer Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Thiadiazol-Derivats wurden optimale Bedingungen für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie und Massendetektion ausgewählt. Der Zeitpunkt der Freisetzung des Stoffes aus der Chromatographiesäule und der MRM-Übergang wurden berücksichtigt (Registrierung wurde durchgeführt). M/z Vorläuferion auf dem ersten analytischen Quadrupol Q1 und M/z Produktionen auf dem zweiten analytischen Quadrupol Q3). Zur Quantifizierung von LCT 7-09 wurde eine Kalibrierungskurve im Konzentrationsbereich von 0,397 bis 397 ng/ml erstellt.

Als Software wurde AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex) verwendet.

Resultate und Diskussion

In der ersten Phase der experimentellen Studie wurde der Massennachweis der Testprobe durchgeführt, indem diese mit einer Spritzenpumpe direkt in den Massendetektor eingeführt wurde. Bei der Probenvorbereitung wurde eine Lösung von LHT 7-09 (500 ng/ml) in einer Mischung aus Acetonitril und ionisiertem Wasser im Verhältnis 2:1 unter Zusatz von Ammoniumacetat (0,1 %) hergestellt.

Vorläufige Experimente zeigten, dass bei der Registrierung positiver Ionen die Empfindlichkeit der Bestimmung von LHT 7-09 höher war und das Massenspektrum intensiver und aussagekräftiger war als bei der Registrierung negativer Ionen. Diesbezüglich wurde in weiteren Studien nur der positive Ionisationsmodus verwendet.

Um einen intensiven Peak zu erhalten, wurden die folgenden Massendetektionsbedingungen ausgewählt: : positive Polarisation, Elektrospray-Spannung 5500,0 V, Declustering-Potenzial und Injektionspotential – 36,0 bzw. 6,5 V, mit Vorhanggasdruck von 20,0 psi und Zerstäubungsgasdruck von 40,0 psi, Geschwindigkeit 10 μl/min. Der Scanbereich betrug 270–300 Da.

Die Analyse des erhaltenen Massenspektrums des ersten analytischen Quadrupols Q1 zeigte, dass unter diesen Bedingungen durch die Zugabe eines Wasserstoffprotons ein protoniertes Molekül der untersuchten Verbindung + mit dem Wert gebildet wird M/ z 285,2 Ja (Abb. 2).

Reis. 2. Massenspektrum des protonierten Moleküls LHT 7-09 (im Positivionen- und Scanmodus)

Auf dem zweiten analytischen Quadrupol Q3 wurden Produktionen für das Vorläuferion mit dem Wert aufgezeichnet m/z 285,2 Ja. Die Analyse des Massenspektrums 2. Ordnung zeigte das Vorhandensein vieler Peaks, von denen 3 die intensivsten waren – m/z 114.2 Ja, m/z 130,2 Da und m/z 75,1 Da (Abb. 3).

Reis. 3. Massenspektrum von Produktionen (im Scanmodus für positive Ionen, Vorläuferion).M/ z285,2 Ja)

Um ein hochintensives Ionensignal zu erhalten, wurden die optimalen Energiewerte in der Q2-Kollisionszelle ausgewählt (berücksichtigt wurde der Energiebereich von 0 bis 400 V). Für Produktionen mit Werten M/ z 114,2 Da, 130,2 Da und 75,1 Da. Die optimale Energie in der Kollisionszelle betrug jeweils 27 V; 23 V und 49 V.

Es wird davon ausgegangen, dass die Produktion mit dem Wert M/ z 114,2 Da ist ein Fragment von 5-Amino-2-ethyl-1,3,4-thiadiazol, da auch die Fragmentierung anderer 1,3,4-Thiadiazol-Derivate ein Produkt-Ion mit demselben Wert ergibt M/ z. Produktion mit Bedeutung M/ z 130,2 Da ist wahrscheinlich eine protonierte Einheit von Acexamsäure. Somit bestätigten die Ergebnisse der Massendetektion der untersuchten Probe die chemische Struktur des neuen 1,3,4-Thiadiazol-Derivats.

Im nächsten Schritt der experimentellen Studie wurde die Testverbindung mittels HPLC-Massenspektrometrie analysiert.

Im HPLC-MS/MS-Modus wurden die folgenden Ionisierungsbedingungen verwendet: Elektrospray-Spannung 5500,0 V, Flussrate der mobilen Phase 400 μL/min, Stickstofftemperatur 400 °C, Vorhanggas- und Sprühflussdruck 20,0 bzw. 50,0 psi. Die Aufnahmegeschwindigkeit einzelner Massenspektren betrug 100 Spektren pro Sekunde. Um das zusammengefasste Massenspektrum zu erhalten, wurde auf dem Chromatogramm ein Zeitraum von 10,5–11,5 Minuten gewählt; Basierend auf der Intensität des Signals von Produktionen wurden Kurven der Zeitabhängigkeit des Ionenstroms und der Peakfläche einzelner Signale entsprechend der untersuchten Verbindung erstellt. Das Volumen der in die analytische Säule eingebrachten Probe betrug 10 μl.

Zur Isolierung der untersuchten Verbindung wurde ein Gradientenmodus der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet, der durch Änderung der Zusammensetzung des Eluenten am Eingang der Analysesäule sichergestellt wurde. Als Elutionsmittel wurden Acetonitril, entionisiertes Wasser und Ammoniumacetat in verschiedenen Verhältnissen verwendet. Die Wahl des Gradientenchromatographiemodus war darauf zurückzuführen, dass es unter den Bedingungen eines isokratischen Elutionsmodus (auch bei Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen von Acetonitril) nicht möglich war, einen Peak der Testsubstanz mit symmetrischer Form und Retentionszeit zu erhalten zur Analyse geeignet. Der Studie zufolge war der optimale Modus der Elutionsmittelzufuhr: Von 0 bis 4 Minuten betrug die Acetonitrilkonzentration 1 %; von 4 bis 8 Minuten ein linearer Anstieg der Acetonitrilkonzentration auf 99 %; von 8 bis 12 Minuten – isokratischer Abschnitt (1 % Acetonitril). Nach Abschluss der Studie wurde die Chromatographiesäule 5 Minuten lang mit einer 30 %igen Acetonitrillösung gewaschen.

Bei Verwendung des beschriebenen Chromatographiemodus wurde für die untersuchte Verbindung ein symmetrischer Peak ausreichender Intensität erhalten (Abb. 4).

Reis. 4. Chromatogramm LHT 7-09 (analytische SäuleAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 µm 2,1×10 mm; Gradientenchromatographie-Modus)

Die Analyse der erhaltenen Chromatogramme für LCT 7-09-Lösungen unterschiedlicher Konzentration zeigte, dass die Retentionszeit (tR) unter diesen Elutionsbedingungen 11 Minuten betrug und nicht von der Konzentration der untersuchten Substanz abhing. In diesem Zusammenhang kann der Retentionszeitwert als zusätzliches Kriterium zur Bestätigung der Echtheit von LHT 7-09 in Mehrkomponentenmischungen herangezogen werden. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass diese Chromatographieparameter zur Identifizierung von LHT 7-09 nicht nur mit einem Massendetektor, sondern auch mit anderen Detektoren, einschließlich photometrischen, verwendet werden können.

Zur Quantifizierung des neuen Thiadiazol-Derivats wurde eine Kalibrierkurve im Konzentrationsbereich von 0,397 ng/ml bis 397 ng/ml erstellt (Abb. 5).

Reis. 5. Kalibrierungsdiagramm zur Bestimmung der Konzentration von LCT 7-09 (auf der Abszisse ist die Konzentration von LCT 7-09 in ng/ml aufgetragen, auf der Ordinate ist die Peakfläche in Impulsen aufgetragen)

Zur Entwicklung einer Kalibrierlösung wurden Lösungen von LHT 7-09 in Konzentrationen von 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 ng/ml. Die Abhängigkeit der Peakfläche von der Konzentration der untersuchten Verbindung wurde durch die folgende Regressionsgleichung beschrieben:

y= 8,9e 5 ·x 0,499, der Regressionskoeffizientwert war r=0,9936.

Es ist zu beachten, dass die entwickelte Kalibrierungslösung eine hochpräzise quantitative Bestimmung der untersuchten Verbindung in einem breiten Konzentrationsbereich ermöglicht, was es ermöglicht, diese Methode zur Beurteilung der Qualität eines Arzneimittels und zur Durchführung pharmakokinetischer Studien zu verwenden.

Das Ergebnis der Studie war somit die Entwicklung einer Methode zur Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Aminosäurederivats von Thiadiazol mittels HPLC-MS/MS.

Schlussfolgerungen

1. HPLC-MS/MS ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung eines neuen Aminosäurederivats von Thiadiazol mit hoher Genauigkeit.
2. Der Massennachweis des neuen Thiadiazol-Derivats LHT 7-09 sollte im Positiv-Ionen-Scanmodus (MRM-Übergang – Vorläuferion Q1) erfolgen M/ z 285,2 Ja; Produktionen Q3 M/ z 114.2 Ja, M/ z 130,2 Da und M/ z 75,1 Da).
3. Um LCT 7-09 aus Mehrkomponentengemischen zu isolieren, wurde eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographietechnik entwickelt (analytische Säule Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 μm 2,1×10 mm; Eluent Acetonitril: entionisiertes Wasser: Ammoniumacetat; Gradientenmodus).

Bibliografischer Link