Moderne Probleme der Wissenschaft und Bildung. Methoden zur Beurteilung von Apoptose-Apoptose-Markern

Untersucht wurden 45 Kinder im Alter von 3–15 Jahren. Ziel der Studie war es, die Apoptosebereitschaft peripherer Blutlymphozyten und Neutrophiler durch Bestimmung der Apoptosemarker CD95, CD95L, BSL2 zu bestimmen. Bei der Beurteilung der Apoptose immunkompetenter Zellen wurde eine Abnahme der Bereitschaft zum programmierten Zelltod von Lymphozyten und eine Zunahme neutrophiler Granulozyten festgestellt. Die stärksten Veränderungen werden in der Altersgruppe von 7–15 Jahren mit einer Krankheitserfahrung von mehr als 3 Jahren verzeichnet. Die erhaltenen Daten können ein Zeichen für die Unterdrückung des programmierten Todes autoreaktiver Lymphozyten im Pankreasgewebe sein, was zur Verlängerung der Immunantwort beiträgt. Eine Erhöhung des Anteils von Leukozytenzellen, die CD95L exprimieren, kann zu verstärkten Prozessen des programmierten Zelltods in β-Zellen der Pankreasinseln beitragen, die mit immunkompetenten Zellen infiltriert sind.

Neutrophile Apoptose

Lymphozyten-Apoptose

Diabetes mellitus Typ 1

1. Pekareva E. V. Marker der Apoptose bei Patienten mit Typ-1-Diabetes mellitus zu Beginn der Krankheit / E. V. Pekareva et al. // Diabetes mellitus. – 2009. – Nr. 4. – S. 86-89.

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Einführung

Diabetes mellitus Typ 1 (T1DM) ist eine polygene, multifaktorielle Erkrankung, die mit der Bildung von Autoantikörpern und autoreaktiven T-Lymphozyten gegen Pankreas-β-Zellen einhergeht.

Die Hauptursachen für die Pathogenese von Autoimmunläsionen sind eine Fehlregulation der Immunität und der programmierte Zelltod.

Die kontrollierte Apoptose gilt heute als Hauptmechanismus zur Aufrechterhaltung eines optimalen Zellgleichgewichts an der Entzündungsstelle, zur Begrenzung der Ausbreitung aktivierter Klone und zur Verhinderung der Entwicklung von Autoimmunreaktionen. Kommt es zu einem Defekt in der Umsetzung, können sich aktivierte Immunzellen ansammeln, was zur Entstehung von Autoimmunerkrankungen führt.

Zweck der Studie: Untersuchung der Aktivierungsmarker der Apoptose CD95, CD95L, Bsl2 auf peripheren Blutlymphozyten und Neutrophilen bei Typ-1-Diabetes mellitus bei Kindern.

Material und Forschungsmethoden

Es wurde eine Befragung von 45 Kindern mit Typ-1-Diabetes mellitus im Alter von 3 bis 15 Jahren durchgeführt. Gruppe I umfasste 20 Kinder im Alter von 3–6 Jahren (Vorschulkinder), Gruppe II – 12 Kinder im Alter von 7–15 Jahren (Schulkinder) mit einer Krankheitsdauer von weniger als 3 Jahren, Gruppe III – 13 Kinder im Alter von 7–15 Jahren (Schulkinder) mit einer Krankheitserfahrung von mehr als 3 Jahren. Die Kontrollgruppe bestand aus 30 gesunden Kindern im Alter von 3–6 (15) und 7–15 (15) Jahren. Die Studie wurde auf Basis der endokrinologischen Abteilung des gleichnamigen Children's City Clinical Hospital durchgeführt. G. K. Filippsky, Stawropol.

Zur Beurteilung des programmierten Zelltods wurde die Anzahl der Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten ermittelt, die Apoptosemarker exprimieren. Lymphozyten wurden auf einem Ficoll-Paque-Dichtegradienten isoliert, Neutrophile – auf einem doppelten Dichtegradienten Ficoll-Paque und Ficoll-Urografin (GE Healthcare, Schweden). Die Zellsuspension wurde dreimal in RPMI-1640-Medium (Vector-Best, Russland) gewaschen. In Kulturen von Lymphozyten und Neutrophilen wurde die Anzahl der Zellen, die CD95, CD95L und Bsl2 exprimierten, durch Durchflusszytometrie unter Verwendung monoklonaler Antikörper (Invitrogen, USA) bestimmt.

Zur statistischen Auswertung der Daten wurde das Softwarepaket „Primer of Biostat 4.0“, Attestat 10.5.1 verwendet.“ Zur Beurteilung der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde eine Varianzanalyse wiederholter Messungen mit der Berechnung der Newman-Keuls- und Dunn-Kriterien durchgeführt.

Quantitative Werte waren nicht normalverteilt und wurden als Median- und Interquantilbereich (25. und 75. Perzentil) dargestellt (Me (Q1-Q)). Unterschiede auf S<0,05.

Ergebnisse und ihre Diskussion

Die Arbeit ergab eine Abnahme der Anzahl von Lymphozyten, die Fas-Rezeptoren (CD95) exprimieren, bei Patienten aller Gruppen im Vergleich zu gesunden Kindern (Tabelle 1). Die Mindestindikatoren wurden bei Kindern im Alter von 7 bis 15 Jahren mit einer Krankheitserfahrung von mehr als 3 Jahren beobachtet (Tabelle 1).

Tabelle 1

Indikatoren der Lymphozyten-Apoptose bei Kindern mit Typ-1-Diabetes mellitus

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой

Bei der Beurteilung des Expressionsniveaus von anti-apoptotischen Markern (Bsl2) wurde ein Anstieg in den Lymphozyten von Kindern aller Gruppen festgestellt, der bei Schulkindern mit einer Krankheitsdauer von mehr als 3 Jahren stärker ausgeprägt war, was ebenfalls auf eine Verletzung von Fas- hindeutet. abhängige Apoptose bei Kindern mit Typ-1-Diabetes mellitus, was zu einer Verlangsamung der Prozesse des Zelltods autoreaktiver Formen von Lymphozyten führt.

Unsere Ergebnisse könnten ein indirektes Zeichen für die Unterdrückung des programmierten Todes aktivierter Lymphozyten im Pankreasgewebe sein, was zur Verlängerung der Immunantwort beiträgt.

Der Grad der Apoptosebereitschaft lymphoider Zellen hängt von der Dauer der Erkrankung ab und nimmt bei Kindern mit T1DM über einen Zeitraum von mehr als 3 Jahren ab.

Es wurde zuvor gezeigt, dass bei Diabetes mellitus eine Resistenz der Lymphozyten gegen Apoptose besteht, was die Art und Dauer der Autoimmunreaktion erklären könnte.

In der Lymphozytenkultur von Kindern mit Diabetes wurde im Vergleich zu einer Gruppe gesunder Kinder ein Anstieg des Prozentsatzes CD95L exprimierender Lymphozyten festgestellt (Tabelle 1). Die höchsten Raten wurden bei Kindern im Alter von 7–15 Jahren mit einer Krankheitserfahrung von mehr als 3 Jahren ermittelt (Tabelle 1).

Es ist bekannt, dass bei T1DM die Pankreasinseln von Immunzellen infiltriert werden, die ein breites Spektrum an Zytokinen produzieren, was mit einer fehlerhaften Expression von Membranrezeptoren einhergeht. Unter dem Einfluss erhöhter Glukose- und Zytokinkonzentrationen beginnen β-Zellen, CD95 auf ihrer Oberfläche zu exprimieren, was normalerweise praktisch nicht vorkommt.

Eine erhöhte Expression von CD95L auf lymphoiden Zellen kann zu einem ausgeprägteren apoptotischen Prozess in den β-Zellen der Bauchspeicheldrüse und deren anschließender Entfernung beitragen.

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass neutrophile Granulozyten aktiv an der Entstehung von Autoimmunentzündungen beteiligt sind. Die Reaktion von Neutrophilen, die auf die Lokalisierung und Eliminierung von Autoantigenen abzielt, hängt weitgehend von der Stärke und Dauer der antigenen Wirkung auf das Immunsystem sowie vom anfänglichen Niveau der funktionellen Aktivität der Zellen ab.

Wir haben festgestellt, dass der Verlauf von Diabetes mellitus bei Kindern mit einem Anstieg des Prozentsatzes von Neutrophilen, die Apoptosemarker (CD95) exprimieren, und einem Rückgang des Anteils von Zellen mit anti-apoptotischen Proteinen Bsl2 auf ihrer Oberfläche einhergeht (Tabelle 2).

Tabelle 2

Indikatoren der Neutrophilen-Apoptose bei Kindern mit Typ-1-Diabetes mellitus

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keuls-Test, Dunn-Test).

Bei vergleichenden Intergruppenmerkmalen sind die maximalen CD95-Werte (S<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

Es wurde ein Anstieg des Prozentsatzes polymorphkerniger Leukozyten mit CD95L auf ihrer Oberfläche festgestellt. Die höchsten Raten wurden bei Schulkindern mit einer Krankheitsgeschichte von mehr als 3 Jahren beobachtet.

Die in der Literatur vorgestellten Ergebnisse der Studien zur PMN-Apoptose bei Diabetes mellitus sind widersprüchlich. Es gibt Hinweise auf einen Anstieg der Apoptoserate von Neutrophilen im peripheren Blut bei T1DM und T2DM.

In einer Reihe von Studien wurde jedoch eine Abnahme der Apoptose neutrophiler Granulozyten bei Patienten mit Typ-1-Diabetes festgestellt, insbesondere unter Bedingungen einer Hyperglykämie, die wahrscheinlich chronische Entzündungsprozesse mit Gewebeschäden auslöst und bei Patienten mit Typ-1-Diabetes auch zu längeren bakteriellen Infektionen prädisponiert 1 Diabetes.

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Patienten mit T1DM eine erhöhte Prädisposition von PMN für Apoptose haben, was Ausdruck einer Schutzreaktion sein kann, die darauf abzielt, den „Überschuss“ an aktiven Neutrophilen zu beseitigen, deren Bildung die Gewebeschädigung erhöht.

Ein Anstieg des apoptotischen Potenzials neutrophiler Granulozyten spiegelt die aktive Beteiligung von PMN an der Immunpathogenese der Krankheit wider.

Eine erhöhte Expression von CD95L auf neutrophilen Granulozyten bei Patienten mit Diabetes kann wahrscheinlich zur Eliminierung nicht nur von Pankreaszellen, sondern auch ihrer eigenen Leukozytenzellen beitragen.

So wurde bei der Beurteilung der Apoptose immunkompetenter Zellen bei Kindern mit Typ-1-Diabetes mellitus eine Abnahme der Bereitschaft zum programmierten Zelltod von Lymphozyten und ein Anstieg polymorphkerniger Leukozyten festgestellt.

Die stärksten Veränderungen werden in der Altersgruppe von 7-15 Jahren mit einer Krankheitserfahrung von mehr als 3 Jahren verzeichnet. Bei Kindern aller Gruppen wurde ein Anstieg des Anteils an Leukozytenzellen festgestellt, die CD95L auf ihrer Oberfläche exprimierten.

Es ist bekannt, dass PMNs eine Verbindung zwischen der angeborenen und adaptiven Immunität darstellen und eine führende Rolle beim antibakteriellen Schutz spielen.

Eine Erhöhung ihrer apoptotischen Aktivität kann zu einer geringen altersbedingten Widerstandskraft und Anfälligkeit eines Kindes für Infektionskrankheiten führen.

Eine Abnahme der Anzahl lymphoider Zellen, die auf die Induktion von Apoptose reagieren, ist ein indirektes Zeichen für die Unterdrückung des programmierten Zelltods und eine beeinträchtigte Eliminierung aktivierter Formen von Lymphozyten.

Schlussfolgerungen

1. Bei Kindern mit Diabetes mellitus Typ 1 kommt es zu einer Abnahme der Apoptosebereitschaft peripherer Blutlymphozyten, einem Anstieg neutrophiler Granulozyten, der mit einer Veränderung der Expression von CD95 und Bsl2 einhergeht und von der Dauer abhängt die Krankheit.

2. Eine erhöhte Expression von CD95L auf Lymphozyten und neutrophilen Granulozyten bei T1DM kann zu verstärkten Prozessen des programmierten Zelltods in β-Zellen der Pankreasinseln beitragen, die mit immunkompetenten Zellen infiltriert sind.

Rezensenten:

Shchetinin E.V., Doktor der medizinischen Wissenschaften, Professor, Vizerektor für Wissenschafts- und Innovationsarbeit der St. State Medical University, Leiter der Abteilung für HBO für höhere Berufsbildung „Stavropol State Medical University“ des Gesundheitsministeriums der Russischen Föderation , Stawropol.

Golubeva M.V., Doktor der medizinischen Wissenschaften, Professorin, Leiterin der Abteilung für Infektionskrankheiten bei Kindern der HBO Higher Professional Educational Institution „Stavropol State Medical University“ des Gesundheitsministeriums der Russischen Föderation, Stawropol.

Bibliografischer Link

Apoptose ist eine programmierbare, genetisch vermittelte Form des Zelltods, bei der äußere oder innere Signale der Zelle einen Impuls geben, Enzyme zu bilden oder zu aktivieren, die sie zur Selbstzerstörung führen. Morphologisch ist Apoptose durch Zellschrumpfung, Kondensation und Fragmentierung des Zellkerns, Zerstörung des Zytoskeletts und bullöse Vorwölbung der Zellmembran gekennzeichnet. Ein Merkmal der Apoptose besteht darin, dass eine sterbende Zelle die Integrität ihrer Membran beibehält, bis der Prozess abgeschlossen ist, und erst dann ist die Zerstörung ihrer Membran ein Signal für nahegelegene Phagozyten, die verbleibenden Fragmente zu absorbieren und den Prozess des Zellabbaus abzuschließen. Apoptotische Zellen, die keiner sofortigen Phagozytose unterliegen, werden zu kleinen, membrangebundenen Fragmenten, die „apoptotische Körper“ genannt werden. Ein wichtiges Merkmal der Apoptose besteht darin, dass sterbende Zellen entfernt werden, ohne dass es zu einer Entzündung kommt.

Apoptose spielt eine wichtige Rolle in physiologischen Prozessen: Organogenese, Embryonalentwicklung, Regulierung der Zusammensetzung und Anzahl der Zellpopulationen im Gewebe eines erwachsenen Organismus, verschiedene hormonelle Veränderungen im Körper. Die Rolle der Apoptose ist auch bei verschiedenen pathologischen Prozessen wichtig. Es wurde am umfassendsten beim Tumorwachstum untersucht.

Der Prozess der Apoptose kann in zwei Phasen unterteilt werden:

· Bildung und Weiterleitung apoptotischer Signale – Entscheidungsphase;

· Abbau zellulärer Strukturen – Effektorphase.

Die Umsetzung von Apoptosemechanismen ist mit der Aktivierung endogener zellulärer Enzyme – Cysteinproteasen (Caspasen) – verbunden. Caspasen befinden sich in Zellen in einem inaktiven Zustand (Procaspasen). Die Aktivierung erfolgt durch ihre proteolytische Spaltung und anschließende Dimerisierung unter Bildung aktiver Untereinheiten. Die Ziele von Caspasen sind Proteine, die für verschiedene lebenswichtige Funktionen der Zelle verantwortlich sind. Derzeit sind 14 Arten von Caspasen beschrieben, die sich anhand ihrer funktionellen Eigenschaften in drei Gruppen einteilen lassen:

Aktivatoren von Zytokinen (Caspasen 1, 4, 5, 13)

Caspasen – Induktoren der Aktivierung von Effektor-Caspasen (Caspasen 2, 8, 9, 10)

· Effektor-Caspasen – Ausführende der Apoptose (3, 6, 7)

Einer der zellulären Membranrezeptoren, die für die Mechanismen der Apoptose verantwortlich sind, ist ein Protein namens Fas-Rezeptor (CD95/APO1). Der Ligand für den Fas-Rezeptor ist das Protein Fas-Ligand (Fas-L), das zur Familie der tumornekrotischen Faktoren gehört und entweder in Form eines Membranproteins oder in löslicher Form vorliegen kann. Die Bindung des Fas-Rezeptors an den Fas-Liganden führt zur Aktivierung von Apoptosemechanismen mit der Aktivierung von Caspase-Induktoren. Mit der anschließenden Aktivierung von Effektor-Caspasen beginnt eine Kette proteolytischer Reaktionen, deren Zweck die apoptotische „Zerlegung“ der Zelle ist: DNA-Fragmentierung, direkte Spaltung der Strukturproteine ​​der Zelle, Dysregulation der Proteinsynthese. Somit führt die Beteiligung von Effektor-Caspasen an der Apoptose zum Bruch der apoptotischen Zelle mit umgebenden Zellen, zur Reorganisation des Zytoskeletts, zu verminderten Fähigkeiten der DNA-Reparatur und -Replikation, zum Bruch der Kernmembran und zur DNA-Zerstörung sowie zur Freisetzung von Signalen, die die Zelle markieren Apoptose und Zerstückelung der Zelle in apoptotische Körper. Es ist kein Zufall, dass Effektor-Caspasen „Henker-Caspasen“ genannt werden.

Die Methoden zur Untersuchung der Apoptose sind sehr vielfältig. Ursprünglich war die Elektrophorese der extrahierten DNA-Fraktion die gebräuchlichste Methode zur Bestimmung der Apoptose, wodurch die Diskretion von DNA mit niedrigem Molekulargewicht pro Mol ermittelt werden konnte. Masse (als Folge des internukleosomalen DNA-Abbaus). In morphologischen Studien wird zum Nachweis von DNA-Brüchen die TUNEL-Methode verwendet, die auf der Bildung von Inserts markierter Oligonukleotide an den Stellen von DNA-Brüchen basiert, deren Bildung durch das TdT-Enzym katalysiert wird.

Zur Erfassung der Lymphozyten-Apoptose werden derzeit zunehmend Methoden auf Basis der Durchflusszytometrie eingesetzt. Zu dieser Gruppe gehört eine Methode, die auf dem Nachweis des Verlusts eines Teils der DNA durch Zellen (hypodiploide Zellen) mithilfe eines Fluoreszenzfarbstoffs – Propidiumiodid – basiert und im Folgenden beschrieben wird. Zur Bestimmung der Apoptose werden auch andere Methoden auf Basis der Durchflusszytometrie eingesetzt. Die Apoptose von Lymphozyten kann in frühen Stadien mithilfe von Fluorochrom-markiertem Annexin V nachgewiesen werden, das an Phosphatidylserin bindet, das auf der Membran von Zellen erscheint, die Apoptose durchlaufen. Eine ungefähre Vorstellung von der „Neigung“ von Lymphozyten, Apoptose zu entwickeln, kann durch die Bestimmung der Expression des Fas-Rezeptors (CD95) auf ihrer Oberfläche und in den Mitochondrien des Protonkogens bcl-2 gewonnen werden.

Die klinische Bedeutung der Beurteilung der Apoptose im Rahmen der klinischen und immunologischen Untersuchung von Patienten ist unbestritten, da ihre Beeinträchtigung mit einer Reihe von Krankheiten verbunden ist. Die Abschwächung der Apoptose ist auf die Entstehung von Autoimmunerkrankungen zurückzuführen (aufgrund einer Störung des Prozesses der Abtötung autospezifischer Lymphozytenklone). Daher kann die Aufzeichnung der Abschwächung der Apoptose als Informationsquelle über die pathogenetischen Mechanismen von Autoimmunerkrankungen wie systemischem Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis sowie dem autoimmunen lymphoproliferativen Syndrom dienen, das auf Mutationen von Genen beruht, die Rezeptoren für apoptotische Signale bestimmen . Eine gestörte Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus bei der Entstehung bösartiger Prozesse. In Tumorzellen wird häufig eine Mutation des p53-Gens nachgewiesen, das für ein Protein kodiert, das ein Signal über das Vorhandensein nicht reparierter DNA-Brüche und chromosomaler Mutationen erkennt, was zur Entwicklung von Apoptose führt. Dadurch werden genetisch defekte Zellen nicht verworfen und werden zur Quelle der Tumorbildung.

Bei einer Reihe anderer Erkrankungen wird dagegen ein Anstieg der Apoptose beobachtet. Dies geschieht bei infektiösen Prozessen (massive Apoptose von T-Zellen wird häufig durch mikrobielle Superantigene verursacht), Sepsis und verschiedenen Viruserkrankungen, einschließlich AIDS. Die Apoptose wird bei einer Reihe von Blutkrankheiten und primären Immundefekten verstärkt, wenn sie durch eine unzureichende Produktion von Zellüberlebensfaktoren verursacht wird, deren Rolle Zytokine spielen. So kommt es bei einer der Formen schwerer kombinierter Immunschwäche, die mit einer Mutation des IL-7-Gens oder der gemeinsamen γ-Kette von Zytokinrezeptoren einhergeht, zum Tod von Lymphvorläufern aufgrund eines IL-7-Mangels.

Am allgemeinsten bedeutsam ist jedoch die Beurteilung der „aktivierten Apoptose“, die Lymphozyten durchlaufen, wenn sie durch Mitogene stimuliert werden. Tatsache ist, dass Apoptose neben der Proliferation eine Form der Reaktion von Lymphozyten auf Aktivierungsreize ist. In den frühen Stadien der Differenzierung überwiegt die apoptotische Reaktion und ihr Ergebnis ist die Bildung einer Toleranz gegenüber dem Induktor-Antigen. Reife Lymphozyten reagieren auf die Stimulation vorwiegend durch Proliferation (die als Anfangsstadium und Voraussetzung für die Entwicklung einer Immunantwort dient), es besteht jedoch weiterhin eine gewisse Wahrscheinlichkeit für den Eintritt in die Aktivierungsapoptose. Da Apoptose als Prozessalternative zur Proliferation fungiert, kann ihr Verhältnis als Maß für die Wirksamkeit der Zellreaktion auf aktivierende Signale dienen. Je höher der Beitrag der Apoptose zur Lymphozytenantwort auf Mitogen ist, desto weniger wirksam ist die antigenspezifische Immunabwehr. Daher ist die Bestimmung der Apoptose während der Aktivierung von Lymphozyten durch Mitogene am aussagekräftigsten, sofern parallel die proliferative Reaktion von Zellen auf denselben Reiz bewertet wird.

Während des Prozesses der Apoptose findet in einer Zelle auf molekularer Ebene eine komplexe Reaktionskette statt, die zu Veränderungen der Stoffwechselprozesse und phänotypischen Eigenschaften der Zellen führt. Diese Veränderungen können durch biochemische, mikroskopische oder zytometrische Methoden bestimmt werden und werden als Marker der Apoptose verwendet.

Einer der frühen Marker der Apoptose ist das Auftreten auf der Zytoplasmamembran der Zelle. Annexin-Rezeptoren. In apoptotischen Zellen wird das Phospholipid Phosphatyldiserin (PD) neu ausgerichtet und auf der Oberfläche der Zellmembran lokalisiert. Die Lokalisierung von PS auf der Membranoberfläche wird ausgehend von beobachtet
frühes Stadium der Apoptose vor dem vollständigen Zellabbau. Rekombinant-
Ny-Annexin-V-Protein (35–36 kDa), das eine hohe Affinität aufweist
Beständigkeit gegen PS in Gegenwart von Ca +2-Ionen. Kontaktierung des FS an der Oberfläche
ty-Zellen dient Annexin V, konjugiert an ein Fluorochrom
Marker der Apoptose. Annexin V wird normalerweise in Kombination mit verwendet
Propidiumiodid (PI), das eine gleichzeitige Erkennung ermöglicht
intakte Zellen (sowohl Annexin V als auch PI negativ), Zellen
sich in „früher“ Apoptose befinden (Annexin-V-positiv,
negativ für PI) und Zellen in später Apoptose oder
bei Nekrose (positiv für Annexin V und PI).

CD95 Fas oder APO-1 ist ein Transmembran-Glykoprotein (45 kDa), das zur Familie der Tumornekrosefaktor (TNF-α)-Rezeptoren gehört. Das CD95-Antigen wird in erheblichen Mengen auf Thymozyten, CD4+- und CD8+-Lymphozyten des peripheren Blutes und in geringerem Maße auf B-Lymphozyten und NK-Zellen exprimiert. Dieses Antigen wird auch auf Granulozyten und Monozyten exprimiert, seine Expression findet sich jedoch nicht auf Blutplättchen und Erythrozyten. Der CD95-Rezeptor wird auch auf Zellen normaler Gewebe und Tumoren beobachtet. Die Bindung von CD95 durch den Fas-Liganden (Fas-L, CD95L) induziert Apoptose in Zellen, die es exprimieren. Monoklonale Antikörper gegen CD95 ermöglichen die Identifizierung einer Population von Zellen, die zur Apoptose bereit sind, mittels Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie.

CD95L (Fas-L)– genannt Fas-Ligand, ist ein Membranprotein (40 kDa). Es gibt auch eine lösliche Form von CD95L (sFas-L), ein Protein (26 kDa) aus der (TNF-α)-Rezeptorfamilie. Dieses Antigen wird von zytotoxischen E-Lymphozyten und NK-Zellen exprimiert und wurde auch auf vielen Tumorzellen nachgewiesen. Die Bindung von Fas-L an den CD95-Rezeptor induziert den Prozess der Apoptose in Zielzellen. Monoklonale Antikörper gegen CD95L ermöglichen die Identifizierung einer Population von Zellen, die zur Apoptose bereit sind, mithilfe von Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie.

Bcl-2– ein Protein (26 kDa), dessen Überexpression die Apoptose blockiert. Bcl-2 ist ein intrazelluläres Protein, das in Mitochondrien lokalisiert ist. Um es mithilfe monoklonaler Antikörper nachzuweisen, ist daher eine vorherige Permeabilisierung der Zellmembran erforderlich.

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Methoden zur Beurteilung des Immunstatus – ein Lehrbuch für Studierende der medizinischen, pädiatrischen und medizinisch-prophylaktischen Fakultäten

Staatliche Medizinische Universität Kursk, Bundesagentur für Gesundheit und soziale Entwicklung. Abteilung für klinische Immunologie und Allergologie.

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Immunstatus und Methoden zu seiner Beurteilung
Der Immunstatus (IS) ist eine Reihe von Laborparametern, die die quantitative und funktionelle Aktivität von Zellen des Immunsystems charakterisieren. IP-Indikatoren sind hoch

Gegenstände und Methoden der immunologischen Forschung
Untersuchungsobjekte Untersuchungsmethoden Phänotypische Eigenschaften immunkompetenter Zellen Durchflusszytofluormetrie Imm

Lymphozyten
Als Teil der Zellen des Immunsystems sind echte Immunozyten alle Varianten von Lymphozyten. Andere Arten von Leukozyten (Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten), Makrophagen, Blutplättchen, Mastzellen

MFS-Zellen
Periphere Blutmonozyten und Gewebemakrophagen werden aus pluripotenten Stammzellen gewonnen. Sobald Monozyten im Blutkreislauf sind, siedeln sie sich innerhalb von 2–3 Tagen im Gewebe an und verwandeln sich dort in Gewebe

Antimikrobielles, sauerstoffabhängiges System
Sauerstoffabhängige Mechanismen der bakteriziden Glucose + NADP+ → Pentosephosphat + NADPH Cytochrom b245 NADP + O2 ͛

Mediatorzellen
Granulozyten sind polymorphkernige Leukozyten, die im Blut zirkulieren und wie Monozyten-Makrophagen-Zellen aus einer myeloischen Stammzelle im Knochenmark entstehen. Es gibt drei Arten von Granu

Methoden zur Lymphozyten-Immunphänotypisierung
Bei der Untersuchung von Lymphozyten werden deren Anzahl im peripheren Blut und ihre funktionelle Aktivität beurteilt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt unter Berücksichtigung der Differenzierungsantigene auf und

Isolierung der mononukleären Zellfraktion
Die Methode zur Isolierung mononukleärer Zellen basiert auf dem unterschiedlichen Auftrieb verschiedener Blutzellen. Die Verwendung eines Gradienten einer bestimmten Dichte ermöglicht die Trennung mononukleärer Zellen (Lymphozyten, Monozyten, Blutzellen).

Durchflusszytometrie
Die Methode der Durchflusszytometrie basiert auf der Messung der optischen Eigenschaften von Zellen. Zellen werden einzeln in eine laminare Strömung in einer Quarz-Durchflusszelle eingeführt, wo sie fokussiertes Licht passieren

Indirekte Immunfluoreszenzmethode
Die indirekte Immunfluoreszenz ist eine Methode, die auf der Verwendung monoklonaler, mit Fluorochrom markierter Antikörper basiert und deren Ergebnisse unter Berücksichtigung der spezifischen Lumineszenz von Zellen während der Lumineszenzmikroskopie bewertet werden

Immunzytochemische Methode
Immunzytochemische Methoden basieren auf der Verwendung von Enzymen wie Peroxidase und alkalischer Phosphatase. Derzeit ist die am häufigsten verwendete Methode PA (Peroxidase-Antiperoxidase), st.

Methoden zur Untersuchung der funktionellen Aktivität von Lymphozyten
Die funktionelle Aktivität von Lymphozyten wird anhand folgender Effekte beurteilt: Fähigkeit, Antigene zu erkennen, Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von Zellen. Fähigkeit zur Lymphozytenerkennung

Transformationsreaktion der Lymphozytenexplosion
Der Kontakt eines Lymphozyten mit einem fremden Antigen oder unspezifischen Mitogen geht mit einer Aktivierung und einer Blastentransformationsreaktion (BTLR) einher, d. h. Zellproliferation mit Übergang von kleinen Lymphozyten zu Blasten

Mischkultur von Lymphozyten
Die gemeinsame Kultivierung von Lymphozyten mit MHC-II-Molekülen unterschiedlicher Haplotypen führt zu deren Blastentransformation und -proliferation. Die antwortenden Zellen gehören zu den T-Lymphozyten und werden durch Fremdkörper stimuliert

Blutplasmaproteine
Im menschlichen Plasma sind mehr als zweihundert Proteine ​​vorhanden, von denen die meisten isoliert und strukturell und funktionell beschrieben wurden. Plasmaproteine ​​werden überwiegend durch Glykoproteine ​​repräsentiert. Mit Elektropho

Globuline
α1-Antitrypsin ist ein α1-Globulin, das mehr als 80 % der Antiproteaseaktivität im Serum ausmacht und den Hauptbestandteil der α-Bande darstellt. In Molkensoda

Globuline
Haptoglobin hat eine Halbwertszeit von 2–4 Tagen. Der normale Gehalt an Haptoglobin im Serum beträgt 0,3 - 2,0 g/l. Seine funktionelle Hauptaufgabe besteht darin, freies Hämoglobin im Serum zu binden

Methoden der Proteinelektrophorese
Die Elektrophorese wird häufig zur semiquantitativen Bestimmung von Serumproteinen und zum Nachweis von Paraproteinen eingesetzt. Die Elektrophorese wird also mit Serum und nicht mit Plasma durchgeführt

Immunglobuline
Immunglobuline (Ig) sind spezifische Proteine, die vom Immunsystem als Folge einer Reaktion auf fremde Antigene produziert werden und sich im Blutserum und anderen biologischen Flüssigkeiten anreichern

Menschliche Immunglobuline
Eigenschaft IgM IgG IgA IgD IgE Molekulare Form Pentamer

Methoden zur Bestimmung von Immunglobulinen
Zur quantitativen Bestimmung des Gehalts an Ig verschiedener Klassen in Blutserum und anderen biologischen Flüssigkeiten werden häufig verschiedene Möglichkeiten zur Durchführung der Fällungsreaktion in einem Gel eingesetzt.

Paraproteine
Paraproteine ​​sind Immunglobuline oder Fragmente davon, die von Plasmazellen produziert werden, die aus einer bestimmten Zelllinie von B-Lymphozyten (Monoklon) stammen. Paraproteine ​​versagen oft

Kryoglobuline
Kryoglobuline sind pathologische Plasmaproteine ​​(10-80 mg/ml), die die Eigenschaft haben, bei Temperaturen unter 37°C in einen geleeartigen Zustand überzugehen. Die meisten Kryoglobuline sind polyklonale Komplexe

Methoden zur Bestimmung von Immunkomplexen
Die Bindung von Ig an ein Antigen ist ein physiologischer Prozess, der zur Bildung von Immunkomplexen (IC) führt, die das Antigen aus dem Körper eliminieren sollen. Allerdings unter bestimmten Voraussetzungen

Bestimmung von Autoantikörpern in der Diagnostik systemischer Bindegewebserkrankungen
Nach modernen Konzepten bezieht sich Autoimmunität auf Zustände, bei denen im Körper Antikörper oder sensibilisierte Lymphozyten gegen normale Antigene des eigenen Gewebes auftreten.

Wichtigste serologische Marker für Autoimmunerkrankungen
Antigen Originalname Molekülstruktur Funktion Diagnostischer Wert

Bestimmung von ANA in der indirekten Immunfluoreszenzreaktion
Bei einem typischen Test wird das Serum des Patienten mit antigenen Substraten (tierisches Leber- oder Nierengewebe, Hep-2-Zellkultur) inkubiert, um die vorhandenen Substanzen spezifisch zu binden.

Indirekte Immunfluoreszenz
Charakter der Lumineszenz Antigenspezifität Klinische Bedeutung Periphere oder marginale dsDNA, l

Bestimmung von ANA und ENA mittels Festphasen-ELISA
Testsystem für ELISA ANA (UBI MAGIWELL) – für die Screening-Analyse auf antinukleäre Antikörper ermöglicht die semiquantitative Bestimmung einer breiten Palette von Antikörpern gegen den in den Wells sorbierten Komplex

Autoimmunerkrankungen
Art der Pathologie Ergebnisse der immunologischen Forschung. Art der Antikörper und ihre Häufigkeit (%)

Zytokinsystem
Zytokine sind eine Klasse löslicher Peptidmediatoren des Immunsystems, die für dessen Entwicklung, Funktion und Interaktion mit anderen Körpersystemen notwendig sind. Sie definieren

Interleukine
IL-1 ist ein immunregulatorischer Mediator, der bei Entzündungsreaktionen, Gewebeläsionen und Infektionen freigesetzt wird (proinflammatorisches Zytokin). IL-1 stimuliert die Proliferation und Differenzierung

Interferone
Interferon (IFN) wurde als Protein mit antiviraler Aktivität entdeckt. Die antivirale Wirkung von IFN beruht auf seiner Fähigkeit, die intrazelluläre Replikation des Virus im Stadium zu verhindern

Tumornekrosefaktoren
Der Tumornekrosefaktor (TNF) ist der Hauptmediator, den der Körper als Reaktion auf gramnegative Bakterien produziert. Der Wirkstoff gramnegativer Bakterien ist LPS, ein Bestandteil des Zellsystems.

Koloniestimulierende Faktoren
Eine Reihe von Zytokinen, die während der Entwicklung der Immunantwort produziert werden, wirken stimulierend auf die Differenzierung von Knochenmarksvorläufern. Diese Zytokine werden Kolonie-stimulierende Zytokine genannt.

Wachstumsfaktoren
Der transformierende Wachstumsfaktor (TGFβ) ist eine Familie verwandter Peptide mit vielfältigen Auswirkungen auf allgemeine Prozesse, die Wachstum und Morphogenese regulieren. TGFβ – Hauptzytokin

Methoden zur Bestimmung von Zytokinen
Die Bestimmung des Zytokingehalts in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten ist von großer Bedeutung für die Beurteilung der funktionellen Aktivität immunkompetenter Zellen und die Regulierung der Immunantwort. In getrennten Worten

Komplementsystem
Das Komplementsystem ist ein Komplex von Blutserumproteinen, der zur Selbstorganisation und zur Vermittlung von humoralen Immunitäts- und Phagozytosereaktionen fähig ist. Das ist derzeit bekannt

Methoden zur Bestimmung der Komplementaktivität
Die Gesamtaktivität (Titer) des Komplements wird in der Hämolysereaktion anhand von Schaferythrozyten bestimmt. Das im Testserum enthaltene Komplement führt bei sensibilisierten Schafen zu einer Hämolyse

Komplementtiter bei 50 % HE
Hämolyse, % K Hämolyse, % K Hämolyse, % K Hämolyse, % K

Bestimmung von Komplementkomponenten
Zur Bestimmung von Komplementkomponenten kommen ELISA und die turbidimetrische Methode zum Einsatz, deren Durchführung in den den diagnostischen Testsystemen beigefügten Anleitungen beschrieben ist. In der klinischen Praxis

Komplementkomponenten
Komplementkomponente Klinische Manifestationen C1-Mangel verursacht normalerweise keine klinisch signifikanten Störungen, da es isst

Methoden zur Untersuchung der phagozytischen Aktivität von Granulozyten
Das wichtigste Merkmal der Granulozytenfunktion ist die Beurteilung ihrer phagozytischen Aktivität. Sein Rückgang kann auf einen Mangel an serumopsonisierenden Faktoren (Antikörper, Komplement) zurückzuführen sein

NST-Test
Der Nitroblau-Tetrazolium-Test (NBT-Test) dient dem Nachweis sogenannter aktivierter Granulozyten und Monozyten. Die Aktivierung von Fresszellen beruht auf einem starken Anstieg oxidativer Reaktionen

Forschungsmethodik
Erforderliche Reagenzien und Materialien: KN 42 OPO 44 0, Na 42 OPO 44 0, NaCl, Glucose, Nitroblautetrazolium, Heparin, Methylalkohol, 1 %ige wässrige Lösung von Methylengrün (falls vorhanden).

Bestimmung von Myeloperoxidase
Myeloperoxidase oxidiert eine Reihe von Substraten (Benzidin, Orthophenyldiamin) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid, was mit einer Farbreaktion einhergeht. Myeloperoxidase ist ein Enzym, das in Phagenkörnern enthalten ist

Chemilumineszenz
Spontane Lumineszenz, die bei chemischen Reaktionen aufgrund der Energie der reagierenden Stoffe auftritt, wird Chemilumineszenz (CL) genannt. Es ist allen Geweben und Zellen eines lebenden Organismus inhärent, sofern sie enthalten

Bestimmung des IgE-Gehalts
Unter den immunologischen Methoden zur Beurteilung unspezifischer Parameter des Immunstatus bei den meisten atopischen Erkrankungen ist die Bestimmung der Gesamt-IgE-Menge von größter Bedeutung. Allerdings stimme ich zu

Basophiler Degranulationstest
Bei allergischen Patienten wird ein erheblicher Teil des IgE von verschiedenen Leukozyten über deren Fc-Rezeptoren gebunden. Das Vorhandensein von Antikörpern tragenden Zellen weist auf deren Sensibilisierung gegenüber dem entsprechenden Allergen hin. B

Basophiler zellulärer Antigen-Stimulationstest – CAST
Bei IgE-vermittelten allergischen Reaktionen beginnt der auslösende Mechanismus mit der Bindung des Allergens an spezifische IgE-Moleküle auf der Oberfläche von Basophilen oder Mastzellen. E

Hemmungsreaktion der Leukozytenmigration
Die Reaktion wird durchgeführt, um Lymphozyten zu identifizieren, die gegen das vermutete Allergen sensibilisiert sind. Sensibilisierte Lymphozyten setzen bei Interaktion mit einem spezifischen Allergen Mediatoren frei (FPML).

Aufgabe Nr. 1
Ein 23-jähriger Patient klagt über immer wieder auftretende Furunkel im Gesicht und an den Beinen. Stellt häufige Erkältungen (bis zu 7-8 Mal im Jahr) und Herpesausschläge an den Lippen fest.

Problem Nr. 2
Patient N., 22 Jahre alt, wandte sich an einen Immunologen mit Beschwerden über wiederkehrende akute respiratorische Virusinfektionen (bis zu 7 Mal pro Jahr), oft begleitet von einer Verschlimmerung einer chronisch obstruktiven Bronchitis. Antibakteriell durchgeführt

Problem Nr. 3
Patient T., 27 Jahre alt, konsultierte wiederholt einen Arzt wegen wiederkehrender akuter respiratorischer Virusinfektionen, Tracheobronchitis, Schwäche und Unwohlsein. Aus der Anamnese wurde festgestellt, dass er im Laufe des Jahres sechsmal, zweimal, an ARVI litt

Problem Nr. 4
Patient K, 45 Jahre alt. Diagnose: systemischer Lupus erythematodes. Eine immunologische Studie ergab: Leukozyten – 5,5 x 109/l Lymphozyten –37 %, abs. 2,03 x 109

Problem Nr. 5
Kind, 5 Jahre alt, gehört zur Gruppe der häufig und langzeitkranken Kinder, Rückfälle von ARVI einmal im Monat, chronische Infektionsherde (chronische Sinusitis, Adenoiditis), vergrößerte Halslymphknoten

Während der immunologischen Untersuchung
Tests der ersten Stufe Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen. Leukoformel T-Lymphozyten B-Lymphozyten

Allgemeine Blutanalyse
Norm SI-Einheiten Hämoglobin M F 130,0–160,0 120,0–140,0 g/l

Haupt-CD-Marker von Zellen des Immunsystems
CD-Marker Zellpopulation % der Zellen CD2 T- und NK-Zellen

Lymphozyten-Subpopulation bei Kindern
Lymphozyten 4–5 Tage – 3 Monate 4–8 Monate 1–2 Jahre 2–5 Jahre über 5 Jahre alle

Immunglobulinspiegel im Blutserum von Erwachsenen
IgM IgG IgA IgE 1,3 – 1,7 g/l 12 – 14 g/l 2,1 – 2,9 g/l

Allergie-MAST-Panel (multipler Allergosorbent-Test) zur Identifizierung spezifischer Immunglobuline gegen Allergene verschiedener Gruppen
Lebensmittel-Ig-E-Panel, russisches erweitertes Ig-E-Panel, Lebensmittel-Ig-G-Panel, russisches universelles Ig-E-Panel

Glossar der Begriffe
Avidität ist die Stärke der Bindung eines Antigens an einen Antikörper, die durch die Affinität und Wertigkeit der Antikörper bestimmt wird. Agglutination - Aggregation zu

Liste der Abkürzungen und Symbole
AG – Antigen AOK – Antikörper-bildende Zelle APC – Antigen-präsentierende Zelle AT – Antikörper VLS – ableitendes Lymphgefäß VVC – virusinfiziert

Markova A.A. 1Kashkina E.I. 1 Rubtsov V.S. 1 Lyakisheva R.V. 1

1 Staatliche Medizinische Universität Saratow, benannt nach. IN UND. Rasumowski, Saratow

Die Expression von Apoptose- und Proliferationsmarkern wurde bei 61 Patienten mit Colitis ulcerosa in Abhängigkeit von der Dauer, der Schwere der Erkrankung und der Lokalisierung des Entzündungsprozesses im Dickdarm analysiert. Die Vergleichsgruppe bestand aus 15 praktisch gesunden Personen. Die Patienten wurden mit klinischen, labortechnischen, endoskopischen und morphologischen Methoden untersucht. In Biopsieproben der Dickdarmschleimhaut wurde die Expression der immunhistochemischen Marker Ki-67, P53, BAX und CEA bestimmt. Die Studie ergab eine statistisch signifikante Abnahme der proliferativen Aktivität der Dickdarmschleimhaut bei Patienten mit Colitis ulcerosa im Vergleich zu einer Gruppe gesunder Personen sowie eine Abnahme der Proliferationsprozesse und eine Zunahme der Expression von Apoptose-Markern in Bezug auf Dauer und Schweregrad der klinischen Manifestationen der Krankheit nahmen zu.

unspezifische Colitis ulcerosa

Marker für Apoptose und Proliferation

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Die unspezifische Colitis ulcerosa (UC) ist eine der schwersten Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts und führt zu Behinderungen und zum Tod der Patienten.

In den letzten Jahrzehnten kam es in verschiedenen Ländern der Welt zu einem Anstieg der Inzidenz von UC, was größtenteils auf eine verbesserte Diagnose dieses pathologischen Prozesses zurückzuführen ist.

Derzeit wird bei der Diagnose von UC ein integrierter Ansatz verwendet, bei dem Röntgen-, endoskopische und histologische Untersuchungsmethoden zum Einsatz kommen. Eine der vielversprechenden Methoden zur Beurteilung des Zustands der Dickdarmschleimhaut ist die Immunhistochemie mit der Bestimmung von Proliferations- und Apoptosemarkern.

Unter den Methoden der immunhistochemischen Forschung werden die Apoptosemarker bcl und p53 am häufigsten verwendet. Es ist bekannt, dass Proteine ​​der bcl-Familie entweder Apoptose-Induktoren (Bad, Bax, Bak usw.) oder Apoptose-Inhibitoren (Bcl-2, Bcl-XL, BOO usw.) sind. Es ist zu beachten, dass p53-Protein in vielen transformierten Zellen nachgewiesen wird. Seine Funktionen zielen darauf ab, die Übertragung beschädigter genetischer Informationen von einer Zellgeneration auf eine andere zu verhindern, unter anderem durch die Auslösung der Apoptose. Ein hoher p53-Gehalt führt zu einem Anstieg der Bax-Konzentration in der Zelle und einem Abfall der bcl-2-Konzentration, was den Zelltod durch Apoptose fördert.

Als Marker für die Proliferation werden mehrere Antigene verwendet. Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) ist nicht nur an der Zellproliferation beteiligt, sondern auch an der DNA-Reparatur nach einer Schädigung, was dieses Antigen bedingt spezifisch für den Zellzyklus macht, da die DNA-Reparatur in der Ruhephase durchgeführt werden kann. Ein weiteres Antigen, das zuverlässig mit Zellzyklusphasen assoziiert ist, ist Ki-67. Die Expression dieses Proteins erfolgt während der präsynthetischen Phase, nimmt während des gesamten Zellzyklus zu und nimmt während der mitotischen Phase stark ab. Dieses Protein ist im Gegensatz zu PCNA nicht an der DNA-Reparatur beteiligt. Die Expression von Ki-67 ermöglicht die Identifizierung von Zellen in allen Phasen des Zellzyklus mit Ausnahme der Ruhephase.

Der Zweck der Studie besteht darin, die Expression von Apoptose- und Proliferationsmarkern bei Patienten mit Colitis ulcerosa in Abhängigkeit von der Dauer, der Schwere der Erkrankung und der Lokalisation des Entzündungsprozesses zu analysieren.

Materialien und Forschungsmethoden

Die Hauptgruppe bestand aus 61 Patienten mit UC im Alter von 19 bis 66 Jahren (27 Frauen und 34 Männer), die Vergleichsgruppe aus 15 praktisch gesunden Menschen. Die Patienten wurden mit klinischen, labortechnischen, endoskopischen, morphologischen Methoden sowie immunhistochemischen Untersuchungen von Biopsien der Dickdarmschleimhaut untersucht.

Patienten mit CU wurden je nach Schwere der klinischen Manifestationen, Dauer der Erkrankung und Lokalisierung des Entzündungsprozesses in Gruppen eingeteilt.

Die proliferative Aktivität von Zellen wurde mit dem proliferativen Indikator Ki-67 anhand der Formel bestimmt:

Wo X- die Anzahl der Kerne im Sichtfeld des Mikroskops. Die Zählung erfolgte in mindestens 10 Sichtfeldern.

Die Apoptose wurde anhand der Expression von p53- und BAX-Proteinen im oberflächlichen und Drüsenepithel des Dickdarms beurteilt. Um regenerative Prozesse in der Dickdarmschleimhaut bei CU zu beurteilen, wurde die Expression des embryonalen Krebsantigens (CEA) bestimmt.

Forschungsergebnisse und Diskussion

Eine immunhistochemische Studie ermittelte die Abhängigkeit der Expression dieser Marker von der Dauer der UC, der Schwere ihrer klinischen Manifestationen und der Prävalenz des Entzündungsprozesses im Dickdarm.

Bei der statistischen Verarbeitung der erhaltenen Daten nach Prüfung auf Varianzgleichheit und Normalverteilung wurde nachgewiesen, dass die Stichprobe nicht dem Gesetz der Normalverteilung entsprach, weshalb zum Vergleich der Gruppen nichtparametrische Kriterien verwendet wurden. Zur Beschreibung quantitativer Merkmale wurden der Median, das obere und das untere Quartil verwendet.

So betrug der Ki-67-PI bei gesunden Personen 54 (46;67), was auf eine hohe proliferative Aktivität der Dickdarmzellen hinweist (Tabelle).

Proliferationsindex Ki-67 von Epithelzellen der Dickdarmschleimhaut (%) bei gesunden Menschen und Patienten mit Colitis ulcerosa, abhängig von deren Dauer, Schweregrad und Lokalisation

Anmerkungen:

• R 0 – Signifikanz der Unterschiede zur Kontrollgruppe;
• R 1 – Signifikanz der Unterschiede bei einer Krankheitsdauer von weniger als 1 Jahr;
• R 2 - Bedeutung der Unterschiede bei mildem Krankheitsverlauf;
• R 3 – Bedeutung der Unterschiede bei der distalen Lokalisierung der Krankheit.

Bei gesunden Personen fehlte in 80 % der Fälle die BAX-Expression und in 20 % war die Expression des Markers gering. Die CEA-Expression wurde in 50 % der Fälle beobachtet und war ebenfalls gering.

Alle Patienten wurden je nach Krankheitsdauer in 3 Gruppen eingeteilt: 1. mit einer CU mit einer Dauer von bis zu 1 Jahr, 2. mit einer Dauer von 1 bis 5 Jahren und 3. mit einer Dauer von mehr als 5 Jahren.

Wie aus der Tabelle hervorgeht, ist der Anstieg des Ki-67-PI in der Gruppe der Patienten mit einer Krankheitsdauer von 1 bis 5 Jahren im Vergleich zu Gruppe 1 ( R≤ 0,02) kann durch eine erhöhte proliferative Aktivität der Zellen erklärt werden, die reparative Prozesse in der Schleimhaut des Dickdarms widerspiegelt. Ein niedriger Ki-67-PI in der Gruppe der Patienten mit Colitis ulcerosa, der bis zu einem Jahr andauert, in Höhe von 31(25;36), kann auf eine deutliche Abnahme proliferativer Prozesse in der Darmschleimhaut zu Beginn der Erkrankung hinweisen.

Bei der Untersuchung des p53-Indikators in Abhängigkeit von der Krankheitsdauer wurde kein Expressionsmuster dieses Proteins festgestellt, es besteht jedoch ein Unterschied in der Expression dieses Markers zwischen der Gruppe der gesunden Personen und der Gruppe der Patienten mit einer Krankheitsdauer von 1 Jahr bis 5 Jahren ( R≤ 0,05) und mehr als 5 Jahre ( R ≤ 0,03).

Die BAX-Expression wurde sowohl im oberflächlichen als auch im Drüsenepithel des Dickdarms nachgewiesen. Es zeigte sich, dass die Expression dieses Markers im Oberflächenepithel und im Epithel der Drüsen in jedem Einzelfall nahezu gleich ist. Die BAX-Expression bei UC-Patienten wurde in 100 % der Fälle nachgewiesen; statistisch signifikante Unterschiede in der Markerexpression wurden zwischen der Vergleichsgruppe und UC-Patienten festgestellt ( R ≤ 0,01).

Beim Vergleich der Intensität der CEA-Expression konnte mit zunehmender Krankheitsdauer ein deutlicher Anstieg festgestellt werden. In der Vergleichsgruppe zeigte sich die CEA-Expression nur in Einzelfällen ( R ≤ 0,003).

Abhängig vom Schweregrad der klinischen Manifestationen von UC wurden auch Veränderungen im Ki-67 PI festgestellt (siehe Tabelle). Der Ki-67-PI verringerte sich bei Patienten mit mittelschwerer Erkrankung ( R≤ 0,05) und schwere Form ( R≤ 0,02) im Vergleich zu Patienten mit mildem Verlauf gab es auch einen Unterschied zwischen der Gruppe der gesunden Personen und Patienten mit CU jeglicher Schwere ( R ≤ 0,004).

Veränderungen in der Expression des p53-Markers hingen von der Schwere der Exazerbation ab (12,5 % für leichte Exazerbation; 35,7 % für mittelschwere Schwere und 50 % für schwere Exazerbation). Statistisch signifikante Unterschiede wurden zwischen Gruppen gesunder Personen und Patienten mit mittelschweren und schweren Formen von UC festgestellt ( R ≤ 0,03).

BAX und CEA wurden in 100 % der Fälle exprimiert; es wurde jedoch keine Abhängigkeit der Intensität der Expression dieser Marker von der Schwere der klinischen Manifestationen von UC festgestellt. Unterschiede in der Markerexpression wurden zwischen der Vergleichsgruppe und Patienten mit CU festgestellt, unabhängig von der Schwere der klinischen Manifestationen (p ≤ 0,01).

Bei der Analyse der Abhängigkeit von Ki-67 PI von der Lokalisation des Entzündungsprozesses wurde in der Gruppe der Patienten mit CU im Vergleich zu gesunden Menschen ein signifikanter Anstieg der Markerexpression festgestellt ( R≤ 0,002), jedoch wurden in einer vergleichenden Analyse innerhalb der Hauptgruppe keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Markerexpression und verschiedenen Lokalisationen des Prozesses erhalten ( R ≥ 0,05).

Eine p53-Expression wurde nicht bei allen Patienten nachgewiesen. Bei Patienten mit distaler Kolitis wurde nur in 20 % der Fälle ein positives Ergebnis erzielt, bei linksseitiger Kolitis bei 18 % der Patienten. Bei einer vollständigen Darmschädigung wurde die p53-Expression in 100 % der Fälle nachgewiesen ( R≤ 0,03 im Vergleich zur distalen Kolitis). Es ist zu beachten, dass die Expression in Bereichen mit Anzeichen einer Epithelmetaplasie am intensivsten war.

Die Intensität der BAX-Expression war in der Gruppe mit totaler Kolitis signifikant höher als in der Gruppe mit distaler Kolitis ( R ≤ 0,03).

Die CEA-Expression hing nicht vom Ort des Entzündungsprozesses ab, war jedoch bei Patienten mit CU im Vergleich zur Vergleichsgruppe signifikant höher ( R ≤ 0,03).

Bei der unspezifischen Colitis ulcerosa ist die proliferative Aktivität der Epithelzellen der Dickdarmschleimhaut deutlich geringer und die Apoptoseraten höher als ohne entzündliche Veränderungen.

Eine Verlängerung der Dauer einer unspezifischen Colitis ulcerosa geht mit einer geringen proliferativen Aktivität des Epithels der Dickdarmschleimhaut einher, was dessen Reparatur beeinträchtigen kann.

Mit zunehmender Schwere der klinischen Manifestationen der Colitis ulcerosa nimmt nicht nur der Grad der proliferativen Aktivität der Dickdarmepithelzellen ab, sondern auch die Rate der Apoptoseaktivierung.

Wenn sich der Entzündungsprozess auf die proximalen Teile des Dickdarms ausbreitet, wurde ein Anstieg der Apoptoseraten festgestellt.

Rezensenten:

Shvarts Yu.G., Doktor der medizinischen Wissenschaften, Professor, Leiter. Abteilung für Fakultätstherapie, Staatliche Medizinische Universität Saratow, benannt nach V.I. Razumovsky“ Ministerium für Gesundheit und soziale Entwicklung Russlands, Saratow;

Fedorina T.A., Doktor der medizinischen Wissenschaften, Professorin, Leiterin. Abteilung für allgemeine und klinische Pathologie: Pathologische Anatomie, Pathologische Physiologie, Staatliche Medizinische Universität Samara, Ministerium für Gesundheit und soziale Entwicklung Russlands, Samara.

Das Werk ist am 9. Dezember 2011 beim Herausgeber eingegangen.

Bibliografischer Link

CAD (Caspase aktivierte DNase) in Fragmente mit einer Größe von Vielfachen von 180–200 Nukleotiden. Als Folge der Apoptose entstehen apoptotische Körper – Membranvesikel, die intakte Organellen und Fragmente von Kernchromatin enthalten. Diese Körper werden durch Phagozytose von benachbarten Zellen oder Makrophagen verschlungen. Da die extrazelluläre Matrix auch bei einer großen Anzahl apoptotischer Zellen nicht durch zelluläre Enzyme beeinflusst wird, wird keine Entzündung beobachtet.

Der Prozess der Apoptose ist notwendig für die physiologische Regulierung der Anzahl der Körperzellen, für die Zerstörung alter Zellen, für die Bildung von Lymphozyten, die nicht auf ihre Antigene (Autoantigene) reagieren, für den Herbstfall der Pflanzenblätter, für die zytotoxische Wirkung von Killer-T-Lymphozyten, für die Embryonalentwicklung des Körpers (Verschwinden der Hautmembranen zwischen den Fingern bei Vogelembryonen) und andere.

Eine Störung der normalen Zellapoptose führt zu einer unkontrollierten Zellproliferation und dem Auftreten eines Tumors.

1. Die Bedeutung von Apoptose

Apoptose ist ein wesentlicher Bestandteil des Lebens der meisten mehrzelligen Organismen. Es spielt insbesondere in Entwicklungsprozessen eine wichtige Rolle. Beispielsweise sind die Gliedmaßen von Tetrapoden als spatenförmige Auswüchse ausgebildet, und die Bildung von Fingern erfolgt aufgrund des Absterbens von Zellen zwischen ihnen. Auch nicht mehr benötigte Zellen unterliegen der Apoptose, so wird bei Kaulquappen insbesondere der Schwanz bei der Metamorphose zerstört. Im Nervengewebe von Wirbeltieren sterben während der Embryonalentwicklung mehr als die Hälfte der Neuronen unmittelbar nach der Entstehung durch Apoptose ab.

Apoptose ist auch Teil des Systems zur Kontrolle der „Qualität“ von Zellen. Sie ermöglicht die Zerstörung von Zellen, die falsch lokalisiert, beschädigt, nicht funktionsfähig oder potenziell gefährlich für den Körper sind. Ein Beispiel sind B-Lymphozyten, die absterben, wenn sie keine nützlichen antigenspezifischen Rezeptoren tragen oder autoreaktiv sind. Die meisten während der Infektion aktivierten Lymphozyten sterben auch nach überstandener Infektion durch Apoptose ab.

Bei erwachsenen Organismen ermöglicht die gleichzeitige Regulierung von Zellproliferation und Apoptose den Erhalt der Größe des gesamten Individuums und seiner einzelnen Organe. Beispielsweise kommt es nach der Gabe des Medikaments Phenobarbital, das die Proliferation von Hepatozyten anregt, zu einer Vergrößerung der Leber von Ratten. Unmittelbar nach Beendigung der Wirkung dieser Substanz unterliegen jedoch alle überschüssigen Zellen der Apoptose, wodurch die Leber wieder ihre normale Größe annimmt.

Apoptose tritt auch auf, wenn eine Zelle eine große Menge an inneren Schäden „spürt“, die sie nicht reparieren kann. Beispielsweise kann sich eine Zelle im Falle einer DNA-Schädigung in eine Krebszelle verwandeln; um dies zu verhindern, begeht sie unter normalen Bedingungen „Selbstmord“. Auch eine Vielzahl von mit Viren infizierten Zellen sterben durch Apoptose.

2. Marker apoptotischer Zellen

Apoptose-Marker

Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen mit der TUNEL-Methode. Eine Probe von Mauslebergewebe, der Kern einer apoptotischen Zelle ist braun gefärbt, optische Mikroskopie.

Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen mittels Agarosegelelektrophorese. Links: Aus apoptotischen Zellen isolierte DNA – eine „DNA-Leiter“ ist sichtbar; Mitte: Markierungen; Fall: Kontroll-DNA-Probe aus unbehandelten Zellen. Zelllinie H4IIE (Rattenhepatom), Apoptose-Induktor – Paraquat, Visualisierung mittels Ethidiumbromid.

Oben: Nachweis der Chromatinkondensation und -fragmentierung durch Anfärbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Hoechst 34580). Mitte: Nachweis der Translokation von Phosphadidylserin in die äußere Schicht des Plasmalemmas durch Färbung mit Annexin V. Unten: Hellfeldmikroskopische Aufnahme apoptotischer Zellen. Zelllinie – Jurkat, Apoptose-Induktor – TRAIL, konfokal und lichtoptische Mikroskopie.

Zellen, die durch Apoptose absterben, können an einer Reihe morphologischer Merkmale erkannt werden. Sie werden kleiner und dichter (Pyknose), rundlich und verlieren Pseudopodien, das Zytoskelett in ihnen wird zerstört, die Kernmembran zerfällt, Chromatin kondensiert und fragmentiert. Auf der Oberfläche der Zellen erscheinen zahlreiche Vesikel; wenn die Zellen groß genug sind, zerfallen sie in Fragmente, die von Membranen umgeben sind – apoptotische Körper.

In apoptotischen Zellen kommt es neben morphologischen auch zu einer Vielzahl biochemischer Veränderungen. Teile der DNA werden durch spezielle Nukleasen in den Linkerregionen zwischen Nukleosomen in gleich lange Fragmente zerschnitten. Daher kann bei der Trennung der gesamten DNA aus einer apoptotischen Zelle mittels Elektrophorese eine charakteristische „Leiter“ beobachtet werden. Eine weitere Methode zum Nachweis der DNA-Fragmentierung besteht darin, ihre freien Enden mit der TUNEL-Methode zu markieren ( T terminale Desoxynukleotidyltransferase d U TP N ick e nd l Abeling ) .

Auch die Plasmamembran apoptotischer Zellen unterliegt Veränderungen. Unter normalen Bedingungen ist das negativ geladene Phospholipid Phosphatidylserin nur in seiner inneren (in das Zytosol zurückgeführten) Schicht enthalten, während der Apoptose „springt“ es jedoch in die äußere Schicht. Dieses Molekül dient als „Fress mich“-Signal für nahegelegene Phagozyten. Im Gegensatz zu anderen Arten der Phagozytose führt die durch Phosphatidylserin induzierte Verschlingung apoptotischer Zellen nicht zur Freisetzung von Entzündungsmediatoren. Die beschriebene Veränderung des Plasmalemmas liegt einer weiteren Methode zur Identifizierung von durch Apoptose absterbenden Zellen zugrunde – der Färbung mit Anexin V, das spezifisch an Phosphatidylserin bindet.

3. Caspase – Mediatoren der Apoptose

Die zellulären Systeme, die die Apoptose vermitteln, sind bei allen Tieren ähnlich, wobei die Familie der Caspase-Proteine ​​eine zentrale Rolle einnimmt. Caspasen sind Proteasen, die einen Cysteinrest im aktiven Zentrum haben und ihre Substrate an einem bestimmten Asparaginsäurerest schneiden (daher der Name: C aus Cystein Und asp aus Asparaginsäure). Caspasen werden in der Zelle als inaktive Procaspasen synthetisiert, die Substrate für andere, bereits aktivierte Caspasen werden können, die sie an einer oder zwei Stellen am Aspartatrest schneiden. Zwei gebildete Fragmente – ein größeres und ein kleineres – werden miteinander verbunden und bilden ein Dimer, das sich mit demselben Dimmer verbindet. Das so gebildete Tetramer ist eine aktive Protease, die Substratproteine ​​schneiden kann. Zusätzlich zu den Regionen, die den Haupt- und Nebenuntereinheiten entsprechen, enthalten Procaspasen manchmal auch inhibitorische Prodomänen, die nach der Spaltung abgebaut werden.

Durch die Spaltung und Aktivierung einiger Caspasen durch andere entsteht eine protealytische Kaskade, die das Signal deutlich verstärkt und die Apoptose ab einem bestimmten Punkt zu einem irreversiblen Prozess macht. Die Procaspasen, die diese Kaskade starten, werden Initiator genannt, und ihre Substrate werden Effektor genannt. Sobald Effektor-Caspasen aktiviert sind, können sie andere Effektor-Procaspasen oder Zielproteine ​​spalten. Zu den Zielen von Effektor-Caspasen, die bei der Apoptose zerstört werden, gehören insbesondere Kernlamina-Proteine, deren Abbau zum Zerfall dieser Struktur führt. Das Protein wird auch abgebaut und hemmt unter normalen Bedingungen CAD-Endonukleasen, was zu einer DNA-Fragmentierung führt. Caspasen sowie Zytoskelett- und interzelluläre Adhäsionsproteine ​​werden gespalten, was dazu führt, dass sich apoptotische Zellen zusammenballen und von benachbarten Zellen ablösen und so zu leichteren Zielen für Phagozyten werden.

Der Satz an Caspasen, der für die Apoptose erforderlich ist, hängt von der Art des Gewebes und dem Weg ab, über den der Zelltod aktiviert wird. Wenn beispielsweise bei Mäusen das Gen, das für den Effektor Caspase-3 kodiert, „ausgeschaltet“ ist, kommt es nicht zu Apoptose im Gehirn, sondern normalerweise in anderen Geweben.

Procaspase-Gene sind in gesunden Zellen aktiv und daher sind die Proteine ​​ständig vorhanden, damit Apoptose stattfinden kann; nur ihre Aktivierung ist erforderlich, um Zellselbstmord auszulösen. Initiator-Procaspasen umfassen eine lange Prodomäne, die eine CARD enthält ( Caspase-Rekrutierungsdomäne , Caspase-Rekrutierungsdomäne). CARD ermöglicht es Initiator-Procaspasen, an Adapterproteine ​​zu binden und so Aktivierungskomplexe zu bilden, wenn die Zelle ein Signal empfängt, das die Apoptose stimuliert. In Aktivierungskomplexen befinden sich mehrere Procaspase-Moleküle in unmittelbarer Nähe zueinander, was ausreicht, um in den aktiven Zustand überzugehen und sich anschließend gegenseitig zu schneiden.

Die beiden am besten untersuchten Signalwege zur Aktivierung der Caspase-Kaskade in Säugetierzellen werden extrinsisch und intrinsisch (mitochondrial) genannt, wobei jeder seine eigenen Initiator-Procaspasen verwendet.

4. Wege zur Aktivierung der Apoptose

4.1. Externer Pfad

Die Zelle kann von außen ein Signal erhalten, das die Apoptose auslöst, beispielsweise von zytotoxischen Lymphozyten. In diesem Fall wird der sogenannte externe Pfad aktiviert ( extrinsischer Weg), Beginnend mit Todesrezeptoren. Todesrezeptoren sind Transmembranproteine, die zur Familie der Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptoren gehören, wie der TNF-Rezeptor selbst und der Todesrezeptor Fas. Sie bilden Homotrimere, in denen jedes Monomer eine extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne, eine Transmembrandomäne und eine zytoplasmatische Todesdomäne aufweist und über Adapterproteine ​​Procaspasen anzieht und aktiviert.

Todesrezeptorliganden sind ebenfalls Homotrimere. Sie sind miteinander verwandt und gehören zur Familie der Tumornekrosefaktoren-Signalmoleküle. Zytotoxische Lymphozyten tragen beispielsweise Fas-Liganden auf ihrer Oberfläche, die an Fas-Todesrezeptoren auf dem Plasmalemma von Zielzellen binden können. In diesem Fall sind die intrazellulären Domänen dieser Rezeptoren mit einem Adapterprotein verbunden ( FADD, Fas-assoziierte Todesdomäne ), Und diese wiederum ziehen die Initiator-Procaspasen 8 und/oder 10 an. Als Ergebnis dieser Reihe von Ereignissen wird ein tödlicher Signalkomplex gebildet – DISC ( tödlicher Signalkomplex ). Sobald die Initiator-Caspasen in diesem Komplex aktiviert sind, unterbrechen sie die Effektor-Procaspasen und lösen die apoptotische Kaskade aus.

Viele Zellen synthetisieren Moleküle, die sie bis zu einem gewissen Grad vor der Aktivierung des externen Apoptosewegs schützen. Ein Beispiel für einen solchen Schutz wäre die Expression sogenannter Decoy-Rezeptoren ( Täuschungsrezeptoren), besitzen extrazelluläre Ligandenbindungsdomänen, aber keine zytoplasmatischen Todesdomänen und können daher keine Apoptose auslösen und mit herkömmlichen Todesrezeptoren um Liganden konkurrieren. Zellen können auch Proteine ​​produzieren, die den extrinsischen apoptotischen Weg blockieren, wie z. B. FLIP, das in seiner Struktur den Procaspasen 8 und 10 ähnelt, aber keine proteolytische Aktivität aufweist. Es hemmt die Bindung von Initiator-Procaspasen an den DISC-Komplex.

4.2. Innerer Weg

Apoptosom

Apoptose kann auch aus dem Inneren der Zelle ausgelöst werden, beispielsweise durch Verletzungen, DNA-Schäden, Mangel an Sauerstoff, Nährstoffen oder extrazelluläre Überlebenssignale. Bei Wirbeltieren wird dieser Signalweg als intrinsisch bezeichnet ( intrinsischer Weg) Oder mitochondrial, das Schlüsselereignis dabei ist die Freisetzung bestimmter Moleküle aus dem Intermembranraum der Mitochondrien. Vor solchen Zocrem-Molekülen befindet sich Citchrom C, das in den meisten Fällen zum Elektronentransport-Lanjug der Mitochondrien gelangt, das Protein im Zytoplasma hat eine andere Funktion – es kommt zum Adapterprotein Apaf ( Apoptotischer Protease-aktivierender Faktor-l ), wodurch es zu einer radähnlichen siebengliedrigen Struktur oligomerisiert, die als Apoptosom bezeichnet wird. Das Apoptosom rekrutiert und aktiviert die Initiator-Procaspase-9, die dann die Initiator-Procaspase aktivieren kann.

In einigen Zellen muss der extrinsische Apoptoseweg den intrinsischen Apoptoseweg aktivieren, um die Zelle effektiv abzutöten. Der intrinsische Signalweg wird streng durch Proteine ​​der Bcl-2-Familie reguliert.

4.2.1. Regulierung des intrinsischen Signalwegs durch Proteine ​​der Bcl-2-Familie

Die Bcl-2-Familie umfasst evolutionär konservierte Proteine, deren Hauptfunktion die Regulierung der Freisetzung von Cytochrom c und anderen Molekülen aus dem Intermembranraum der Mitochondrien ist. Darunter gibt es pro-apoptotische und anti-apoptotische Moleküle, die in verschiedenen Kombinationen miteinander interagieren können, sich gegenseitig unterdrücken, das Gleichgewicht zwischen ihren Aktivitäten beeinträchtigen und das Schicksal der Zelle bestimmen.

Mittlerweile sind etwa 20 Proteine ​​aus dieser Familie bekannt, die alle mindestens eine der vier alpha-helikalen Bcl2-Homologiedomänen enthalten, die als BH1-4 bezeichnet werden ( bcl2-Homologie). Antiapoptotische Proteine ​​der Bcl2-Familie enthalten alle vier Domänen, einschließlich Bcl-2 selbst sowie Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 und A1. Proapoptotische Proteine ​​werden in zwei Gruppen eingeteilt, wobei die Mitglieder der ersten drei BH-Domänen (BH1-3) enthalten, insbesondere Bak, Bax und Bok (letzteres wird nur in Geweben der Fortpflanzungsorgane exprimiert). Am zahlreichsten in der Bcl-2-Familie ist die zweite Gruppe proapoptotischer Proteine, die nur die BH3-Domäne enthalten (nur BH3), dazu gehören Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

Unter normalen Bedingungen (d. h. wenn die Zelle keine Apoptose durchläuft) binden anti-apoptotische Proteine ​​wie Bcl-2 und Bcl-XL an die pro-apoptotischen Proteine ​​BH123 (Bax und Bak) und verhindern, dass diese im äußeren Mitochondrium polymerisieren Membran, um Poren zu bilden. Durch die Wirkung eines bestimmten apoptotischen Reizes werden proapoptotische Proteine, die nur die BH3-Domäne enthalten, aktiviert oder beginnen mit der Synthese in der Zelle. Sie wiederum hemmen antiapoptotische Proteine, heben die hemmende Wirkung auf Bak und Bax auf oder interagieren direkt mit letzteren und fördern deren Oligomerisierung und Porenbildung. Aufgrund der Permeabilisierung der Außenmembran gelangen Cytochrom c sowie andere Apoptosemediatoren wie AIF in das Zytosol. Apoptose-induzierender Faktor ).

Fehlen beispielsweise Überlebenssignale in der Zelle, wird durch Vermittlung der MAP-Kinase JNK die Expression des BH3-Proteins Bim aktiviert, das den intrinsischen Apoptoseweg auslöst. Bei einer DNA-Schädigung reichert sich der Tumorsuppressor p53 an, der die Transkription von Genen stimuliert, die für die BH3-Proteine ​​Puma und Noxa kodieren, die auch Apoptose vermitteln. Ein weiteres BH3-Protein, Bid, stellt eine Verbindung zwischen den externen und internen Apoptosewegen her. Nach der Aktivierung der Todesrezeptoren und infolgedessen von Caspase-8 schneidet letzteres Bid, um eine verkürzte Form tBid (truncated Bid) zu bilden, die in die Mitochondrien gelangt und dort Bcl-2 unterdrückt.