Застосування тандемної мас-спектрометрії (ВЕЖХ-МСМС) в клінічній діагностиці. Застосування тандемної мас-спектрометрії (вежх-мсмс) у клінічній діагностиці Вежх мс що

За даними огляду, надрукованого в Clinical Biochemist Reviews, застосування високоефективної рідинної хроматографії у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією (ВЕРХ-МС/МС) у клінічних лабораторіях надзвичайно зросло протягом останніх 10-12 років. Автори відзначають, що специфічність аналізу ВЕРХ-МС/МС значно перевершує імунологічні методи і класичну високоефективну рідинну хроматографію (ВЕРХ) при аналізі молекул з низькою молекулярною вагою і має значно більшу продуктивність, ніж газова хроматографія-мас-спектрометрія. Популярність цього при рутинних клінічних аналізах нині пояснюється унікальними можливостями методу.

Основними перевагами методу ВЕРХ-МС/МС є:
• Можливість точного кількісного аналізу малих молекул;
• Одночасний аналіз множини цільових сполук;
• Унікальна специфічність;
• Висока швидкість аналізу.

В останні роки багато уваги приділяється часу аналізу і, як наслідок, підвищенню продуктивності лабораторії. Значне скорочення часу аналізу стало можливим завдяки застосуванню коротких аналітичних колонок для ВЕРХ/МС/МС, що одночасно різко збільшило специфічність аналізу. Використання методу іонізації при атмосферному тиску (API), тандемного потрійного квадрупольного мас-спектрометра та вдосконаленої високоефективної рідинної хроматографії, а також відповідних методів підготовки зразків, привели ВЕРХ-МС/МС у перші ряди сучасних аналітичних методів.

Основні сфери застосування ВЕРХ/МС/МС у клінічній медицині:
• Отримання повного профілю метаболізму стероїдів (steroids panels), пуринів та піримідинів та інших сполук,
  скринінг новонароджених на вроджені помилки метаболізму (виявлення кількох десятків захворювань за аналіз);
• Терапевтичний моніторинг лікарських препаратів — імунодепресантів, перотивосудомних, антиретровірусних, антикоагулянтів та будь-яких інших – незалежно від наявності наборів виробника. Не потрібно купувати дорогі набори кожної речовини – можна розробляти власні методики;
• Клінічна токсикологія – аналіз понад 500 наркотичних сполук та їх метаболітів за один аналіз, без підтверджуючого аналізу
  протеоміка та метаболоміка.

Крім того, ВЕРХ-МСМС використовується для скринінгу олігосахаридового в сечі, сульфатиду, довжиноланцюгових жирних кислот, довжиноланцюгових жовчних кислот, метилмалонової кислоти, дослідження порфірій, скринінгу пацієнтів з порушеннями пуринового та піримідинового метаболізму.

Приклади застосування рідинної хроматографії
у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією у клінічних аналізах.

Скринінг новонароджених:Першим прикладом масового застосування ВЕРХ-МС/МС у клінічній діагностиці був скринінг вроджених помилок метаболізму у новонароджених. В даний час в розвинених країнах це рутинний метод і охоплює більше 30 різних захворювань, включаючи ацедемії, аміноацидопатії, дефекти окислення жирних кислот. Слід особливо відзначити дослідження вроджених дефектів, які можуть призвести до серйозних проблем, якщо не вжити негайних заходів (наприклад, збільшені серце або печінка або набряк мозку). Перевагою використання ВЕРХ-МС/МС для скринінгу новонароджених є можливість одночасно аналізу всіх амінокислот та ацилкарнітинів швидким, недорогим та високоспецифічним методом.

Терапевтичний моніторинг лікарських засобів:Розробка та впровадження імунодепресанту сиролімусу (рапаміцин) для запобігання відторгненню органів після трансплантації була одним із основних стимулів впровадження ВЕРХ-МС/МС у клінічні лабораторії. Сучасний метод ВЕРХ-МС/МС дає можливість одночасного визначення такролімусу, сиролімусу, циклоспорину, еверолімусу та мікофенойної кислоти.

ВЕРХ-МС/МС застосовується також для аналізу цитотоксичних, антиретровірусних лікарських речовин, трициклічних антидепресантів, антиконвульсантів та інших препаратів, що потребують індивідуального дозування.

Метод ВЕРХ-МСМС дозволяє розділити та кількісно визначити R- та S-енантіомери варфарину в діапазоні концентрацій 0.1-500 нг/мл.

Наркотичні та болезаспокійливі речовини:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується для аналізу цих сполук завдяки простоті пробопідготовки та малому часу аналізу. В даний час метод використовується в клінічних лабораторіях для скринінгу на наявність широкого спектра наркотичних речовин. Унікальна специфічність та чутливість методу дає можливість одночасного аналізу понад 500 сполук різних класів в одній пробі з мінімальною пробопідготовкою. Так, у разі аналізу сечі досить простого розведення проби в 50-100 разів. При аналізі волосся замість пучка 100-200 волосся для достовірного виявлення фактів споживання наркотичних засобів досить одиничного волосся.

Ендокринологія та аналіз стероїдів:ВЕРХ-МС/МС широко застосовується в багатьох ендокринологічних лабораторіях для аналізу стероїдів – тестостерону, кортизолу, альдестерону, прогестерону, естріолу та багатьох інших.

Дедалі більше лабораторій починають використовувати ВЕРХ-МС/МС визначення рівня у крові вітаміну Д3 і Д2.

I. Визначення стероїдів (steroid profile).

Лабораторії при лікарнях та клініках нині мають можливість проводити за допомогою ВЕРХ/МС/МС одночасне визначення кількох стероїдів. При цьому немає потреби у великому обсязі зразка, що особливо важливо при аналізах дитячих зразків.

Випадки, за яких доцільно проводити визначення кількох (профілювання) стероїдів:
• Природжена гіперплазія надниркових залоз (Congenital adrenal hyperplasia, CAH) є вродженим дефектом біосинтезу стероїдів. Це спадкова група захворювань, викликана неправильною активністю ензимів кори надниркових залоз, що веде до зниження вироблення кортизолу. Для достовірної діагностики САН рекомендується визначати кортизол, андростендіон та 17-оксипрогестерон. ВЕРХ/МС/МС дозволяє проводити точне кількісне визначення всіх трьох стероїдів за один аналіз зі 100% достовірністю.
• Рутинний скринінг новонароджених з використанням імуноаналізів відрізняється високим рівнем лонопозитивних та хибнонегативних результатів. Визначення за допомогою ВЕРХ/МС/МС не тільки кортизолу, а й альдостерону та 11-деоксикортизолу дозволяє відрізнити первинну недостатність кори надниркових залоз від вторинної.
• ВЕРХ/МС/МС дозволяє проводити визначення стероїдів при простатиті та синдромі хронічного тазового болю.
• ВЕРХ-МС/МС дозволяє визначити профіль стероїдів та ідентифікувати причини передчасного статевого дозрівання, пов'язаного з корою надниркових залоз, у маленьких дітей. Було знайдено, що концентрації тестостерону, андростендіону, дегідроепіандростерону (DHEA) та його сульфату у цих дітей були дещо вищими, ніж у старших дітей контрольної групи.
• Сироватка крові активних курців, пасивних курців і некурців, аналізується на присутність 15 стероїдних гормонів і тиреоїдних гормонів для дослідження зв'язку між пацієнтами, схильними до дії диму, і концентраціями гормонів.
• ВЕРХ/МС/МС використовується для профілювання деяких жіночих стероїдних гормонів у сечі.
• За допомогою ВЕРХ/МС/МС було проведено оцінку концентрацій нейроактивних гормонів з метою запобігання діабетичній нейропатії.

ІІ. Визначення тиреоїдних гормонів

Рутинні методи визначення тиреоїдних гормонів зазвичай засновані на радіоімуноаналізі, який є дорогим і дозволяє визначати тільки Т3 та Т4, що може обмежувати можливості визначення та повного регулювання функцій щитовидної залози.

• В даний час при використанні ВЕРХ-МСМС проводиться одночасний аналіз у зразках сироватки крові п'яти тиреоїдних гормонів, включаючи тироксин (Т4), 3,3′,5-трииодотиронин (Т3), 3,3′,5′- (rT3), 3 ,3'- дііодотиронін (3,3'-T2) та 3,5-дііодотиронін (3,5-T2) в діапазоні концентрацій 1 -500 нг/мл.
• Метод ВЕРХ/МС/МС застосовується також для аналізу складу гормонів пацієнтів, які пройшли тиреоїдектомію. Визначаються рівні концентрацій тироксину (Т4), трійодотіроніна (Т3), вільного Т4 і тиреоїд стимулюючого гормону (ТSH) після операції. Встановлено, що ВЕРХ/МС/МС є чудовим способом встановлення взаємозв'язку між ТSH та концентраціями тиреоїдних гормонів.
• Метод ВЕРХ/МС/МС був застосований для визначення тироксину (Т4) у слині та сироватці крові людини. Метод відрізняється високою відтворюваністю, точністю та межею виявлення 25 пкг/мл. Проведені дослідження показали, що існує діагностична залежність у концентраціях Т4 у слині між еутиреоїдними випробуваними та пацієнтами з хворобою Грейвса.

Метод ВЕРХ/МС/МС в даний час має чутливість, специфічність і точність, необхідних для надійного визначення всіх стероїдів в біологічних рідинах і таким чином підвищує діагностичні можливості, особливо у разі визначення наборів стероїдів.

ІІІ. Визначення 25-оксівітаміну Д методом ВЕРХ/МС/МС

25-окси вітамін Д (25ОД) є основною циркулюючою формою вітаміну Д і попередником його активної форми. (1,25-діоксівітамін Д). Зважаючи на тривалий період його напіввиведення, визначення 25ОД важливе для визначення статусу вітаміну Д в організмі пацієнта. Вітамін Д існує у двох формах: вітамін Д3 (холекальциферол) та вітамін Д2 (ергокальциферол). Обидві форми метаболізують у відповідні 25ОД форми. Дуже велике значення для діагностики має наявність аналітичних методів, які можуть визначати з високою точністю обидві форми вітаміну і дозволяють проводити моніторинг пацієнтів з порушеннями вмісту вітаміну Д. Застосовувані методи досі не дозволяли проводити роздільне визначення вітаміну Д2 і Д3. Крім того, при високих концентраціях вітаміну Д2 занижується кількість Д3, що визначається. Іншим недоліком є ​​застосування радіоактивних ізотопів. Застосування методу ВЕРХ/МС/МС дозволило уникнути застосування радіоактивних ізотопів, а й проводити роздільне визначення обох активних форм вітаміну.

Метод застосовний для наступних пацієнтів:
1. При підозрі на зниження вмісту вітаміну Д в організмі;
2. При підозрі на незрозумілий токсичний вплив;
3. При обстеженні пацієнтів, які проходили курс лікування щодо зниженого вмісту вітаміну Д;
4. Використання ВЕРХ/МС/МС дозволило проводити окреме визначення обох форм моніторингу пацієнтів.

IV. Визначення імунодепресантів методом ВЕРХ/МС/МС

Після трансплантації органів необхідно приймати імунодепресанти протягом усього життя, щоб уникнути реакції відторгнення. Маючи дуже вузький терапевтичний діапазон і високу токсичність, імунодепресанти вимагають індивідуального дозування для досягнення максимального ефекту. Тому життєво важливим є моніторинг основних імунодепресантів: циклоспорину А, такролімусу, сиролімусу та еверолімусу для регулювання дози ліків для кожного індивідуального пацієнта залежно від концентрації препарату в крові.

Імуноаналіз все ще використовується для моніторингу перелічених лікарських препаратів, проте ці методи дорогі та їх специфічність, точність та відтворюваність обмежені. Відомі випадки загибелі пацієнтів від неправильного дозування імунодепресантів, що ґрунтуються на результатах, отриманих за допомогою імунологічних методів. Нині імуноаналізи замінюються у клінічних лабораторіях на ВЕРХ/МС/МС. Так, у клініці університету Мюнхена щодня проводиться аналіз близько 70 зразків на вміст сиролімусу та циклоспорину А з використанням ВЕРХ/МС/МС системи. Вся підготовка зразків та керування приладом здійснюється одним співробітником. Лабораторія переключається також аналіз такролімусу цим методом.

• Описано застосування ВЕРХ/МС/МС для одночасного рутинного визначення такролімусу, сиролімусу, аскоміцину, деметиксисиролімусу, циклоспорину А і циклоспорину G в крові. Діапазон обумовлених концентрацією 1.0 - 80.0 нг/мл. Для циклоспорину 25 - 2000 нг/мл. Протягом року у лабораторії було проаналізовано понад 50,000 зразків.
• Оскільки було встановлено, що одночасне застосування такролімусу та сиролімусу дає позитивний терапевтичний ефект, було розроблено простий та ефективний ВЕРХ/МС/МС метод роздільного їх визначення у крові для клінічних аналізів. Аналіз одного зразка займає 2.5 хвилини з точністю від 2.46% - 7.04% для такролімусу і 5.22% - 8.30% для сиролімусу для всієї аналітичної кривої. Нижня межа визначення такролімусу 0.52 нг/мл, сиролімусу - 0.47 нг/мл.

V. Визначення гомоцистеїну методом ВЕРХ/МС/МС

Гомоцистеїн становить інтерес при серцево-судинних захворюваннях (тромбоемболії, хворобах серця, атеросклерозі) та інших клінічних станах (депресії, хвороби Альцхаймера, остеопорозі, ускладненнях при вагітності та ін.). Існуючі методи аналізу гомоцистеїну, включаючи імуноаналіз, є дорогими. Розроблено швидкий ВЕРХ/МС/МС метод аналізу гомоцистеїну для клінічного застосування рутинного при аналізі великої кількості зразків. Іонізація проводилася методом електророзпилення. Метод є відтворюваним, високоспецифічним та точним. Достоїнствами методу є також низька вартість реагентів та простота пробопідготовки. На добу можна проводити аналіз 500 і більше зразків.

Висновок

Слід зазначити, що навіть при тому, що в даний час використовуються значно вдосконалені методи імуноаналізу, в силу технічних принципових обмежень, даний метод ніколи не матиме порівнянну з ВЕРХ-МСМС точність і специфічність до цільової речовини, особливо в присутності метаболітів. Це не тільки призводить до низької точності методу ІФА та високого відсотка хибно-позитивних та хибно-негативних результатів, але й не дозволяє порівнювати результати, отримані у різних клінічних відділеннях при використанні методу ІФА. Застосування ВЕРХ-МС/МС усуває цей недолік, дозволяє проводити високоспецифічний, точний та швидкий аналіз великої кількості зразків з високою достовірністю у присутності метаболітів та відсутності перешкод від супутніх та ендогенних речовин, що перебувають у плазмі та крові пацієнтів.

Незважаючи на дорожнечу приладового комплексу, як показує світова практика, при правильній експлуатації, даний комплекс окупається за 1-2 роки. Це відбувається, перш за все, завдяки низькій собівартості одного аналізу за рахунок одночасного аналізу десятків і сотень сполук та відсутності необхідності придбання дорогих діагностичних наборів. Крім цього, у лабораторії з'являється можливість самостійно розробляти будь-які необхідні методики аналізу та не залежати від виробника наборів.

Вибір правильної конфігурації приладового комплексу

Існує велика кількість різних методів мас-спектрометрії та типів мас-спектрометрів, призначених для вирішення найрізноманітніших завдань – від структурної ідентифікації складних білкових макромолекул масою сотні тисяч Дальтон до рутинного високопродуктивного кількісного аналізу малих молекул.

Для успішного вирішення поставленої задачі однією з основних умов є вибір правильного типу обладнання. Немає універсального приладу, що дозволяє вирішувати весь спектр аналітичних завдань. Так, прилад, призначений на вирішення завдання ідентифікації мікроорганізмів, неспроможний проводити кількісний аналіз малих молекул. І навпаки. Справа в тому, що, незважаючи на загальну назву, це абсолютно різні прилади, що працюють на різних фізичних принципах. У першому випадку це часпрогоновий мас-спектрометр з лазерним джерелом іонізації - MALDI-TOF, а в другому - потрійний квадруполь з іонізацією електроспреєм - ВЕРХ-МСМС.

Другим за значимістю параметром є вибір правильної конфігурації системи. Існує кілька основних виробників мас-спектрометричного обладнання. У приладів кожного виробника є не лише свої сильні, але й слабкі сторони, про які вони зазвичай вважають за краще мовчати. Кожен виробник випускає свою лінійку приладів. Вартість одного аналітичного комплексу знаходиться в інтервалі вартістю від 100 000 до 1 000 000 і більше доларів. Вибір оптимального виробника і правильної конфігурації устаткування дозволить як заощадити значні фінансові ресурси, а й ефективніше вирішувати поставлене завдання. На жаль, існує багато прикладів, коли обладнання лабораторії проводилося без урахування цих факторів. Результат - обладнання, що простоює, даремно витрачені гроші.

Третім чинником, визначальним успішну роботу лабораторії, є персонал. Для роботи на мас-спектрометрах потрібний висококваліфікований персонал. На жаль, в жодному ВНЗ Росії немає курсу сучасної практичної мас-спектрометрії, особливо стосовно клінічних додатків, і завдання навчання персоналу кожної лабораторії доводиться вирішувати самотужки. Звісно, ​​2-3 днів ознайомлювального тренінгу, проведеного виробником після запуску устаткування, цілком замало розуміння основ методу та придбання навичок роботи у приладі.

Четвертим чинником є ​​готових методик аналізу. Кожна лабораторія має свої пріоритетні завдання, для вирішення яких необхідно розробляти свої методики. Робити це може людина, яка має досвід роботи на приладі не менше 2-3 років. Фірми-виробники іноді постачають одну-дві загальні методики рекомендаційного характеру, але адаптують їх під конкретні завдання лабораторії.

У ТОВ «БіоФармЕксперт»працюють фахівці з багаторічним стажем роботи на різних типах мас-спектрометрів, а також розроблення методик та постановка високопродуктивних аналізів. Тому ми надаємо такі послуги:

1. Вибір оптимальної конфігурації пристрою під конкретні завдання клієнта.
2. Закупівля, постачання та запуск обладнання провідних виробників тандемних мас-спектрометрів. Поетапне навчання персоналу протягом року з моменту запуску обладнання.
3. Набір готових методик та баз даних для вирішення основних клінічних завдань.
4. Розробка методик аналізу та вирішення конкретних завдань клієнта у його лабораторії із залученням його персоналу.
5. Методична підтримка всіх стадіях роботи.

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ) – це метод колонкової хроматографії, в якому рухомою фазою (ПФ) служить рідина, що рухається через хроматографічну колонку, заповнену нерухомою фазою (сорбентом). Колонки для ВЕРХ характеризуються високим гідравлічним тиском на вході в колонку, тому ВЕРХ іноді називають «рідинною хроматографією високого тиску».

Залежно від механізму поділу речовин розрізняють такі варіанти ВЕРХ: адсорбційну, розподільчу, іонообмінну, виняткову, хіральну та ін.

В адсорбційній хроматографії поділ речовин відбувається за рахунок їх різної здатності адсорбуватися та десорбуватися з поверхні адсорбенту з розвиненою поверхнею, наприклад, силікагелю.

У розподільчій ВЕРХ поділ відбувається за рахунок відмінності коефіцієнтів розподілу речовин, що розділяються між нерухомою (як правило, хімічно щепленою до поверхні нерухомого носія) і рухомою фазами.

За полярністю ПФ та НФ ВЕРХ поділяють на нормально-фазову та обернено-фазову.

Нормально-фазовим називають варіант хроматографії, у якому використовуються полярний сорбент (наприклад, силікагель або силікагель з щепленими NH 2 - або CN-групами) та неполярна ПФ (наприклад, гексан з різними добавками). У звернено-фазовому варіанті хроматографії використовують неполярні хімічно модифіковані сорбенти (наприклад, алкільний неполярний радикал C 18) і полярні рухливі фази (наприклад, метанол, ацетонітрил).

В іонообмінній хроматографії молекули речовин суміші, що дисоціювали в розчині на катіони та аніони, поділяються під час руху через сорбент (катіоніт або аніоніт) за рахунок їх різної швидкості обміну з іонними групами сорбенту.

В екслюзійній (ситової, гель-проникаючої, гель-фільтраційної) хроматографії молекули речовин поділяються за розміром за рахунок їх різної здатності проникати в пори нерухомої фази. При цьому першими з колонки виходять найбільші молекули (з найбільшою молекулярною масою), здатні проникати в мінімальне число пір нерухомої фази, а останніми виходять речовини з малими розмірами молекул.

часто поділ протікає по одному, а, по декількома механізмами одночасно.

Метод ВЕРХ може застосовуватися для контролю якості будь-яких негазоподібних аналізованих речовин. Для аналізу використовують відповідні прилади – рідинні хроматографи.

До складу рідинного хроматографа зазвичай входять такі основні вузли:

- вузол підготовки ПФ, включаючи ємність з рухомою фазою (або ємності з окремими розчинниками, що входять до складу рухомої фази) та систему дегазації ПФ;

- Насосна система;

- Змішувач рухомої фази (при необхідності);

- Система введення проби (інжектор);

- хроматографічна колонка (може бути встановлена ​​в термостаті);

– детектор;

- Система збору та обробки даних.

Насосна система

Насоси забезпечують подачу ПФ у колонку із заданою постійною швидкістю. Склад рухомої фази може бути постійним або змінним під час аналізу. У першому випадку процес називають изократическим, тоді як у другому – градієнтним. Перед насосною системою іноді встановлюють фільтри з діаметром пір 0,45 мкм для фільтрації рухомої фази. Сучасна насосна система хроматографа рідинного складається з одного або декількох насосів, керованих комп'ютером. Це дозволяє змінювати склад ПФ за певною програмою при градієнтному елююванні. Змішування компонентів ПФ в змішувачі може відбуватися як при низькому тиску (до насосів), так і високому тиску (після насосів). Змішувач можна використовувати для підготовки ПФ та при ізократичному елююванні, проте більш точне співвідношення компонентів досягається при попередньому змішуванні компонентів ПФ для ізократичного процесу. Насоси для аналітичної ВЕРХ дозволяють підтримувати постійну швидкість подачі ПФ колонку в інтервалі від 0,1 до 10 мл/хв при тиску на вході в колонку до 50 МПа. Однак, доцільно, щоб це значення не перевищувало 20 МПа. Пульсації тиску мінімізуються спеціальними демпферними системами, що входять до конструкції насосів. Робочі деталі насосів виготовляються із корозійностійких матеріалів, що дозволяє використовувати у складі ПФ агресивні компоненти.

Для ідентифікації та кількісного визначення нового амінокислотного похідного 1,3,4-тіадіазолу ЛХТ7-09 було розроблено валідований метод ВЕРХ-МС/МС. Максимальної чутливості мас-спектрометричного детектування ЛХТ7-09 було досягнуто в режимі реєстрації позитивних іонів при напрузі електроспрею 5500 В та потенціалі декластеризації 36 В. Виявлені MRM-переходи підтвердили хімічну структуру нового амінокислотного похідного 1,3,4-тіадіа. Для ефективного виділення ЛХТ7-09 з багатокомпонентних сумішей тіадіазоліламідів розроблено градієнтний режим високоефективної рідинної хроматографії з використанням як елюент суміші ацетонітрилу і деіонізованої води в різних співвідношеннях. Для цих умов хроматографії визначено час утримування сполуки ЛХТ7-09 11 хвилин. Для кількісного визначення сполуки ЛХТ7-09 розроблено градуювальне рішення залежності площі хроматографічного піку від концентрації розчину.

ВЕЖХ-МС/МС

хроматографія

мас-спектрометрія

тіадіазол

1. Казаїшвілі Ю.Г., Попов Н.С. Дослідження протизапальної активності нових похідних тіадіазолу при формаліновому набряку лапи у щурів / Ю.Г. Казаїшвілі, Н.С. Попов // Сучасні проблеми науки та освіти. - 2013. - № 3. www..

2. Нові похідні тіадіазолу, які мають протигрибкову активність / О.С. Кошевенко [та ін] // Успіхи медичної мікології. - 2015. - Т. 14. - С. 348-351.

3. Синтез та протипухлинна активність нових фурил-2-заміщених 1,3,4-тіадіазолів, 1,2,4-тріазолів / Т.Р. Овсепян [та ін] / / Хіміко-фармацевтичний журнал. – 2011. – Т. 45. – № 12. – С. 3-7.

4. Попов Н.С., Демідова М.А. Оцінка гострої токсичності нового похідного амінокислотного тіадіазолу при внутрішньочеревному введенні мишам / Н.С. Попов, М.А. Демидова / / Верхньоволзький медичний журнал. - 2016. - Т. 15, вип. 1. - С. 9-12.

5. Попов Н.С., Демідова М.А. Оцінка ульцерогенності нового амінокислотного похідного тіадіазолу при внутрішньошлунковому введенні щурів / Н.С. Попов, М.А. Демідова // Лікар-аспірант. - 2017. - № 1 (80). - С. 71-78.

6. Синтез та протимікробна активність амідів фенілтіо- та бензилсульфонілуцтових кислот на основі 2-аміно-5-алкіл(арилалкіл)-1,3,4-тіадіазолів / С.А. Сєрков [та ін] // Хіміко-фармацевтичний журнал. - 2014. - Т. 48, № 1. - С. 24-25.

7. Arpit K., Basavaraj M., Sarala P., Sujeet K., Satyaprakash K. Synthesis і farmacological activity of imidazothiadiazole derivatives // Acta Poloniae Pharmaceutica, Drug Research. 2016. Vol. 73. No. 4. P. 937-947.

8. Eman M. Flefel, Wael A. El-Sayed, Ashraf M. Mohamed Synthesis and Anticancer Activity of New 1-Thia-4-azaspirodecane, Their Derived Thiazolopyrimidine and 1,3,4-Thiadiazole Thioglycosides // Molecules. 2017. No. 22 (1). P. 170.

9. Jorge R.A. Diaz, Gerardo Enrique Cami. Salts of 5-amino-2-sulfonamide-1,3,4-thiadiazole, структурної та аналогічної acetazolamide, show interesting carbonic anhydrase inhibitory properties, diuretic, and anticonvulsant action // Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 2016. Vol. 12. No. 6. P. 1102-1110.

10. Naiyuan Chen, Wengui D., Guishan L., Luzhi L. Synthesis and antifungal activity dehydroabietic acid-based 1,3,4-thiadiazole-thiazolidinone compounds // Molecular Diversity. 2016. Vol. 20. No. 4. P. 897-905.

11. Yomna, I. El-Gazzar, Hanan H. Georgey, Shahenda M. El-Messery. Синтеза, біологічна оцінка і молекулярне моделювання вивчення нової (1,2,4-triazole або 1,3,4-thiadiazole)-methylthio-derivatives of quinazolin-4(3H)-one є DHFR inhibitors // Bioorganic Chemistry. 2017. Vol. 72. P. 282-292.

Високоефективна рідинна хроматографія з мас-спектрометричним детектуванням є одним із найбільш перспективних методів для ідентифікації та кількісного визначення лікарських речовин у різних біологічних об'єктах. Метод відрізняється високою специфічністю, точністю та можливістю визначення речовин у мінімальних концентраціях, що дозволяє використовувати його для кількісного визначення лікарських речовин під час проведення фармакокінетичних досліджень та лікарського моніторингу, що є значущим для клінічної лабораторної діагностики. З цією метою необхідна розробка та валідація методик кількісного визначення різних лікарських речовин, у тому числі інноваційних, на основі ВЕРХ-МС/МС-методу.

Оригінальною лікарською речовиною з групи нестероїдних протизапальних засобів є ацексазоламід – нове похідне аміду 1,3,4-тіадіазолу та ацексамової кислоти. Істотною перевагою даної сполуки є невисока токсичність та низька ульцерогенність. Для проведення фармакокінетичних досліджень та оцінки біодоступності даної лікарської речовини за різних шляхів введення необхідна розробка надійної методики його кількісного визначення у біологічних рідинах.

Метою цього дослідженняз'явилася розробка методики ідентифікації та кількісного визначення нового нестероїдного протизапального засобу із групи похідних тіадіазолу за допомогою ВЕРХ-МС/МС.

матеріали та методи

Об'єктом дослідження стало нове похідне тіадіазолу з лабораторним шифром ЛХТ 7-09, синтезоване у ВАТ «ВНЦ БАВ» (м. Стара Купавна) проф. С.Я. Скачілової (рис. 1).

2-(5-етил-1,3,4-тіадіазоліл)амід 2-ацетиламіногексанової кислоти

Мал. 1. Хімічна структура ЛХТ 7-09 (брутто формула: З 12 Н 20N 4 Про 2S; молярна маса 284,4г/моль)

З'єднання ЛХТ 7-09 на вигляд являє собою порошок білого кольору, який практично не розчинний у воді, розчинний у спирті, легко розчинний в ацетонітрилі.

Для ідентифікації та кількісного визначення ЛХТ 7-09 використовували валідований метод високоефективної рідинної хроматографії з мас-спектрометричним детектуванням (ВЕРХ-МС/МС).

Хроматографію здійснювали за допомогою високоефективного рідинного хроматографаAgilent 1260 InfinityII(AgilentTechnologies, ФРН). У дослідженні аналітичну колонку використовували AgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм. Для виділення досліджуваного з'єднання було розроблено градієнтний режим хроматографії. В якості елюентів застосовували ацетонітрил, деіонізовану воду і амонію ацетат в різних співвідношеннях.

Для мас-спектрометрії використовували потрійний квадрупольний мас-спектрометр ABSciexQTrap 3200 MD(ABSciex, Сінгапур) з електророзпилювальним джерелом іонів (TurboV із зондом TurboIonSpray). Калібрування мас-спектрометра проводили за допомогою тестового розчину резерпіну в концентрації 6,1×10 -2 мг/л.

Мас-спектрометричний аналіз досліджуваних зразків проводили в режимі електророзпилення при прямому введенні зразка та елюату, що подається хроматографом. Пряме введення досліджуваних зразків мас-хроматограф здійснювали за допомогою шприцевого насоса діаметром 4,61 мм зі швидкістю 10 мкл/хв.

При розробці методики ідентифікації та кількісного визначення нового похідного тіадіазолу підбирали оптимальні умови високоефективної рідинної хроматографії та мас-детектування. Враховували час виходу речовини з хроматографічної колонки та MRM-перехід (здійснювали реєстрацію m/zіона-попередника на першому аналітичному квадрополі Q1 і m/zіонів-продуктів на другому аналітичному квадрополі Q3). Для кількісного визначення ЛХТ 7-09 проводили побудову калібрувального графіка в діапазоні концентрацій від 0397 до 397 нг/мл.

Як програмне забезпечення використовували AnalystMD 1.6.2.Software (ABSciex).

Результати та обговорення

На першому етапі експериментального дослідження здійснювали мас-детектування досліджуваного зразка шляхом його прямого введення мас-детектор за допомогою шприцевого насоса. На етапі пробопідготовки отримували розчин ЛХТ 7-09 (500 нг/мл) у суміші ацетонітрилу та води іонізованої у співвідношенні 2:1 з додаванням амонію ацетату (0,1%).

Попередні експерименти показали, що в режимі реєстрації позитивних іонів чутливість визначення ЛХТ 7-09 була вищою, а мас-спектр інтенсивнішим та інформативнішим, ніж у режимі реєстрації негативних іонів. У зв'язку з цим у подальших дослідженнях використовували лише режим позитивної іонізації.

Для отримання інтенсивного піку було підібрано такі умови мас-детектування : позитивна поляризація, напруга електроспрею 5500,0 В, потенціал декластеризації і потенціал введення - відповідно 36,0 і 6,5 при тиску газу завіси 20,0 psi і газу розпилення 40,0 psi, швидкість 10 мкл/хв. Спектр сканування становив 270-300 Так.

Аналіз отриманого мас-спектрану першому аналітичному квадрополі Q1 показав, що в даних умовах за рахунок приєднання протона водню утворюється протонована молекула дослідженої сполуки + зі значенням m/ z 285,2 Так (рис. 2).

Мал. 2. Мас-спектр протонованої молекули ЛХТ 7-09 (у режимі сканування позитивних іонів +)

На другому аналітичному квадрополі Q3 здійснювали реєстрацію іонів-продуктів для іона-попередника зі значенням m/z 285,2 Так. Аналіз мас-спектру 2 порядку показав наявність безлічі піків, з яких 3 були найінтенсивнішими - m/z 114,2 Так, m/z 130,2 Так і m/z 75,1 Так (рис. 3).

Мал. 3. Мас-спектр іонів-продуктів (у режимі сканування позитивних іонів, іон-попередникm/ z285,2 Так)

Для отримання іонного сигналу високої інтенсивності було підібрано оптимальні значення енергії в комірці зіткнення Q2 (розглянуто діапазон енергій від 0 до 400 В). Для іонів-продуктів зі значеннями m/ z 114,2 Так, 130,2 Так і 75,1 Даоптимальна енергія в соударительной комірці склала відповідно 27 В; 23 і 49 ст.

Передбачається, що іон продукт зі значенням m/ z 114,2 Да є фрагментом 5-аміно-2-етил-1,3,4-тіадіазолу, так як при фрагментації інших похідних 1,3,4-тіадіазолу також виявляється іон-продукт з таким же значенням m/ z. Іон-продукт зі значенням m/ z 130,2 Так, ймовірно, є протонованим фрагментом ацексамової кислоти. Таким чином, результати проведеного мас-детектування досліджуваного зразка підтвердили хімічну структуру нового похідного 1,3,4-тіадіазол.

На наступному етапі експериментального дослідження здійснювали аналіз досліджуваного з'єднання методом ВЕРХ-мас-спектрометрії.

У режимі ВЕРХ-МС/МС використовували такі умови іонізації: напруга електроспрею 5500,0 В, швидкість рухомого потоку фази 400 мкл/хв, температура азоту 400 °С, тиск газу завіси і розпилювального потоку 20,0 і 50,0 psi відповідно. Швидкість реєстрації одиничних мас-спектрів становила 100 спектрів на секунду. Для отримання сумованого мас-спектру на хроматограмі виділяли часовий проміжок 10,5-11,5 хв; за інтенсивністю сигналу іонів-продуктів будували криві тимчасової залежності іонного струму та площі піків окремих сигналів, що відповідають досліджуваному з'єднанню. Об'єм проби, що вводиться, в аналітичну колонку склав 10 мкл.

Для виділення досліджуваного з'єднання було використано градієнтний режим високоефективної рідинної хроматографії, який забезпечувався зміною складу елюентів на вході в аналітичну колонку. В якості елюентів застосовували ацетонітрил, деіонізовану воду і амонію ацетат в різних співвідношеннях. Вибір градієнтного режиму хроматографії був пов'язаний з тим, що в умовах ізократичного режиму елюювання (у тому числі при використанні різних концентрацій ацетонітрилу) не вдалося отримати пік досліджуваної речовини симетричної форми з придатним для аналізу часом утримання. За даними проведеного дослідження оптимальним був такий режим подачі елюентів: з 0 до 4 хв концентрація ацетонітрилу 1%; з 4 по 8 хв. лінійне збільшення концентрації ацетонітрилу до 99 %; з 8 по 12 хвилину – ізократична ділянка (1% ацетонітрилу). Після завершення дослідження здійснювали промивання хроматографічної колонки 30% розчином ацетонітрилу протягом 5 хвилин.

При використанні описаного режиму хроматографії для дослідженої сполуки було отримано симетричний пік достатньої інтенсивності (рис. 4).

Мал. 4. Хроматограма ЛХТ 7-09 (аналітична колонкаAgilentPoroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1 10 мм; градієнтний режим хроматографії)

Аналіз отриманих хроматограм для розчинів ЛХТ 7-09 різної концентрації показав, що час утримування (tR) за даних умов елюювання склало 11 хвилин і не залежало від концентрації досліджуваної речовини. У зв'язку з цим значення часу утримання можна використовувати як додатковий критерій підтвердження справжності ЛХТ 7-09 у складі багатокомпонентних сумішей. Привертає увагу той факт, що дані параметри хроматографії можна використовувати для ідентифікації ЛХТ 7-09 не тільки за допомогою мас-детектора, але і інших детекторів, у тому числі фотометричного.

Для кількісного визначення нового похідного тіадіазолу здійснювали побудову калібрувального графіка в діапазоні концентрацій від 0397 нг/мл до 397 нг/мл (рис. 5).

Мал. 5. Калібрувальний графік для визначення концентрації ЛХТ 7-09 (по осі абсцис - концентрація ЛХТ 7-09 в нг/мл, по осі ординат - площа піку в імпульсах)

Для розробки градуювального рішення використовували розчини ЛХТ 7-09 у концентраціях 0,397; 1,980; 3,970; 19,8; 39,7; 198,0; 397,0 нг/мл. Залежність площі піку від концентрації дослідженої сполуки описувалося наступним рівнянням регресії:

y= 8,9e 5 ·x 0,499 значення коефіцієнта регресії склало r=0,9936.

Слід зазначити, що розроблене градуювальне рішення дозволяє з високою точністю здійснювати кількісне визначення дослідженої сполуки в широкому діапазоні концентрацій, що дозволяє використовувати даний метод для оцінки якості лікарської речовини та проведення фармакокінетичних досліджень.

Таким чином, результатом проведеного дослідження стала розробка методу ідентифікації та кількісного визначення нового амінокислотного похідного тіадіазолу за допомогою ВЕРХ-МС/МС.

Висновки

1. ВЕРХ-МС/МС дозволяє з високою точністю здійснювати ідентифікацію та кількісне визначення нового похідного амінокислотного тіадіазолу.
2. Мас-детектування нового похідного тіадіазолу ЛХТ 7-09 доцільно проводити в режимі сканування позитивних іонів (МRM-перехід – іон-попередник Q1 m/ z 285,2 Так; іони-продукти Q3 m/ z 114,2 Так, m/ z 130,2 Так і m/ z 75,1 Так).
3. Для виділення ЛХТ 7-09 з багатокомпонентних сумішей розроблено методику високоефективної рідинної хроматографії (аналітична колонка Agilent Poroshell 120 EC-C18 2,7 мкм 2,1×10 мм; елюенти ацетонітрил: вода деіонізована: амонію ацетат).

Бібліографічне посилання