Metódy štúdia metabolizmu bielkovín - praktické zručnosti pediatra. Štúdium metabolizmu pečeňových bielkovín Hlavnými príčinami proteinúrie sú

Strana 66 zo 76

Video: Stanovenie reaktívneho proteínu v krvnom sére

Ukazovatele celkového proteínu krvnej plazmy a jeho jednotlivých frakcií sú dôležité v diagnostike mnohých ochorení.
Stanovenie celkového sérového proteínu. Dá sa vyrobiť množstvom metód (nitrometrické, gravimetrické, nefelometrické, refraktometrické, spektrofotometrické atď.). Z kolorimetrických metód je biuretová metóda najšpecifickejšia, pomerne citlivá, presná a prakticky dostupná. Táto metóda je prezentovaná ako jednotná metóda na stanovenie celkového proteínu v krvnom sére. Je založená na nasledujúcom princípe: bielkoviny reagujú v alkalickom prostredí so síranom meďnatým, pričom vznikajú zlúčeniny sfarbené do fialova.
Technika stanovenia celkového proteínu je nasledovná. K 5 ml pracovného roztoku biuretového činidla (4,5 g Rochellovej soli sa rozpustí v 40 ml 0,2 N NaOH, pridá sa 1,5 g C11SO4 5H2O a 0,5 g K1 a pridá sa do 100 ml 0,2 N NaOH) sa pridá 0,1 ml krvného séra. Po 30 minútach sa vzorka kolorimetrizuje na FEC v 10 mm kyvete so zeleným filtrom proti kontrole. Na prípravu kontroly pridajte 0,1 ml 0,9 % NaCl do 5 ml biuretového činidla. Výpočet sa vykonáva podľa kalibračného plánu.
Normálne celkové koncentrácie bielkovín u dospelých sa pohybujú od 62 do 82 g/l. Údaje o deťoch podľa veku sú uvedené v tabuľke. 49.
Tab.g. 49. Obsah bielkovinových frakcií ako percento z celkového množstva bielkovín (priemerné údaje) podľa veku (podľa Yu. E. Veltishchev, 1979)

Najčastejšími príčinami rozvoja hypoproteinémie sú nedostatočný príjem bielkovín do organizmu z potravy (bielkovinové hladovanie), výrazné straty bielkovín a inhibícia procesov biosyntézy krvných bielkovín.
Nedostatočný príjem bielkovín do organizmu sa pozoruje pri poruchách tráviaceho traktu (zúženie pažeráka, pylorospazmus a stenóza pyloru, nádory, zápalové procesy tráviaceho traktu a pod.), nízky obsah bielkovín v potrave alebo nevyvážené amino zloženie kyselín atď.
Ochorenia obličiek vyskytujúce sa s proteinúriou, akútne a chronické krvácanie, rozsiahle exsudáty a výpotky do seróznych dutín, popáleniny atď. vedú k strate bielkovín v tele.
Hypoproteinémia spojená so znížením biosyntézy bielkovín v pečeni sa vyskytuje pri chronickej hepatitíde, intoxikácii, cirhóze, dlhotrvajúcich hnisavých procesoch, malígnych formáciách atď.
Hyperproteinémia je pomerne zriedkavý jav. Pozorované pri exikóze, diabetes insipidus, črevnej obštrukcii, generalizovanej peritonitíde, myelóme (pretrvávajúci do 120 g/l).
Metódy stanovenia proteínových frakcií v krvnom sére. Štúdium kvantitatívnych vzťahov medzi jednotlivými proteínovými frakciami má významnú diagnostickú hodnotu, pretože umožňuje rozlíšiť určité typy hypo- a hyperproteinémie, ako aj množstvo ochorení, ktoré nie sú sprevádzané zmenami v celkovom obsahu bielkovín.
Na frakcionáciu plazmatických proteínov sa používa vysolovanie neutrálnymi soľami, elektroforetická frakcionácia, imunologické a sedimentačné metódy, zrážanie etylalkoholom pri nízkej teplote, chromatografia a gélová filtrácia. Najpoužívanejšie z nich sú elektroforetické metódy, založené na rôznych rýchlostiach pohybu proteínov v elektrickom poli v závislosti od ich elektrického náboja a iných fyzikálnych a chemických vlastností.
Rozšírili sa metódy elektroforézy na papieri a géloch - agar, škrob a iné, najmä na polyakrylamidovom géli, pomocou ktorých možno získať asi 30 proteínových frakcií. Elektroforéza na filmoch z acetátu celulózy sa začala používať častejšie. V klinických diagnostických laboratóriách sa však používa prevažne metóda elektroforézy na papieri (V. G. Kolb, V. S. Kamyshnikov, 1976). Táto metóda je založená na nasledujúcom princípe: pod vplyvom konštantného elektrického poľa sa sérové ​​proteíny, ktoré majú elektrický náboj, pohybujú po papieri navlhčenom tlmivým roztokom rýchlosťou, ktorá závisí od veľkosti náboja a molekulovej hmotnosti. Sérové ​​proteíny sú rozdelené do piatich frakcií: albumín a globulíny a1, a2, b, y.
Normálny pomer albumínu ku globulínu (pomer albumín-globulín) je približne 2:1. Percento jednotlivých proteínových frakcií u dospelých a detí v závislosti od veku je uvedené v tabuľke. 49. Celkové množstvo bielkovín a bielkovinových frakcií v krvi sa mení pri rôznych ochoreniach u detí.
U dospelých a starších detí sa rozlišujú tieto typy elektroferogramov: I) akútny zápalový proces - 2) subakútny chronický zápal - 3) komplex nefrotických symptómov - 4) malígne novotvary - 5) hepatitída - 6) cirhóza pečene - 7) obštrukčná žltačka - 8) - a p-globulínové plazmocytómy.

Pri prvom type dochádza k zníženiu hladiny albumínu a zvýšeniu a1, a2-globulínov a v neskorších štádiách aj γ-globulínov, pri druhom k miernemu poklesu frakcií albumínu a výraznému zvýšeniu a2-. γ-globulínové frakcie; v treťom významný pokles albumínov, zvýšenie a-globulínov s miernym poklesom γ-globulínov; vo štvrtom - pokles albumínov a významný nárast všetkých globulínových frakcií; piaty - mierny pokles albumínov a zvýšenie γ- a (3-globulínov); v šiestom - pokles albumínov so silným zvýšením frakcie γ-globulínov, ktorých základ je rozšírený - v siedmom - a pokles albumínu a mierne zvýšenie CC2-, P- a γ-globulínov; v ôsmom - celkový proteín je prudko zvýšený, albumíny a väčšina globulínov je znížená, v závislosti od typu sú zvýšené γ- alebo γ-glo - bowlines.
U dojčiat je fyziologický nedostatok biosyntézy γ-globulínov. Preto sa pri infekčných ochoreniach ich b- a a2-globulíny zvyšujú výraznejšie ako u starších detí a dospelých. Neustále zvyšovanie γ-globulínov u malých detí môže naznačovať septický stav.

Úloha pečene v metabolizme bielkovín je veľmi veľká: syntetizujú a ukladajú sa v nej proteíny, do krvi vstupujú aminokyseliny, potravinové polypeptidy a produkty rozkladu tkanivových bielkovín.

Tu dochádza k ich katabolizmu, neutralizácii a odstraňovaniu nespotrebovaných produktov rozkladu. Niektoré aminokyseliny podliehajú deaminácii a transaminácii. Uvoľnený amoniak sa v pečeni premieňa na menej toxickú močovinu. Z aminokyselín, prinesených zvonku a syntetizovaných pečeňou, opäť vytvára bielkoviny vlastného tkaniva, ako aj krvné bielkoviny; albumín, globulíny (a a p a do určitej miery y), fibrinogén, protrombín, heparín, niektoré enzýmy. V pečeni sa tvoria zlúčeniny bielkovín s lipidmi (lipoproteíny) a sacharidy (glykoproteíny).

Porušenie bielkovinotvornej funkcie pečene sa zisťuje vyšetrením bielkovín v krvnej plazme alebo sére. Táto porucha neovplyvňuje ani tak celkové množstvo proteínov, ako pomer ich frakcií, čo je zmena, pri ktorej sa pozoruje dysproteinémia u väčšiny pečeňových lézií.

Metóda papierovej elektroforézy, ktorý je v súčasnosti v klinickej praxi najpoužívanejší, je založený na skutočnosti, že v elektrickom poli sa rôzne proteíny v závislosti od veľkosti, tvaru molekuly, jej náboja a ďalších faktorov pohybujú rôznou rýchlosťou smerom ku kladnej elektróde. Počas elektroforézy na papieri sa rôzne proteínové frakcie koncentrujú v rôznych častiach papierového prúžku, kde ich možno identifikovať vhodným farbením. Veľkosť frakcií je určená intenzitou farby každého z nich. Proteíny krvnej plazmy sú rozdelené do piatich hlavných frakcií - albumín; w, a2-, p- a y-globulíny. Elektroforéza v iných médiách (agar, škrobový gél a pod.) umožňuje separovať proteíny do väčšieho počtu frakcií.

Pri ochoreniach pečene sa najčastejšie vyskytuje zníženie pomeru albumín-globulín (A/G), najmä v dôsledku zníženia obsahu albumínu (zhoršená syntéza albumínu). Pri akútnom zápale pečene (akútna hepatitída) sa pozoruje zvýšenie obsahu α2-globulínov v krvnej plazme, pri chronickom zápale najmä γ-globulíny, pravdepodobne v dôsledku akumulácie protilátok pohybujúcich sa pri elektroforéze s γ-globulínmi; zároveň sa často zvyšuje aj celkové množstvo srvátkového proteínu. Pri cirhóze pečene celkový obsah bielkovín v sére výrazne klesá, najmä v dôsledku albumínu; obsah γ-globulínov sa však výrazne zvyšuje.

fibrinogén pri elektroforéze na papieri migruje s γ-globulínmi a samostatne sa nedeteguje. Na kvantitatívne stanovenie sa fibrinogén vyzráža z plazmy pridaním chloridu vápenatého, potom nasleduje odváženie premytého a vysušeného sedimentu alebo stanovenie proteínu v tomto sedimente po jeho rozpustení. Fibrinogén sa syntetizuje v pečeni, preto pri ťažkom poškodení pečene množstvo fibrinogénu v plazme klesá, čo môže ovplyvniť aj zrážanlivosť krvi. Jeho normálny obsah je 2-4 g/l, alebo 8-14 mg/ml (200-400 mg% - hmotnosť zrazeniny; Rutbergova metóda).

Celková plazmatická bielkovina určuje sa najčastejšie refraktometrickou metódou, a v neprítomnosti refraktometra - chemickými metódami: Kjeldahlova, biuretová reakcia, ako aj nefelometrické atď.

Vzorky proteínového sedimentu. Pomer proteínových frakcií sa okrem elektroforézy zisťuje imunoelektroforézou, ultracentrifugáciou atď. Okrem priameho stanovenia pomeru proteínových frakcií sa na zistenie prítomnosti dysproteinémie používa množstvo jednoduchých testov. Ide o takzvané vzorky proteínového sedimentu (flokulácia). Ich podstatou je, že pri dysproteinémii, najmä pri znížení obsahu albumínu, dochádza k narušeniu stability koloidného krvného systému. Táto porucha sa zistí, keď sa do séra pridá elektrolyt v koncentrácii, ktorá nemení normálne sérum, ale pri dysproteinémii spôsobuje zákal alebo flokuláciu – vločkovanie bielkovín. To isté sa pozoruje, keď sa v krvi objavia patologické proteíny - paraproteíny. Táto skupina vzoriek zahŕňa vzorky s chloridom ortutnatým (Takata-Ara reakcia, Grinstead a Gross ortuťové testy), síran zinočnatý, síran kademnatý, Lugolov roztok V ďalšej skupine flokulačných testov je činidlom koloidný roztok, ktorého stabilita je narušená pridaním malého množstva dis- alebo paraproteinemického séra (tymol, koloidné testy zlata a pod.).

Tymolový test je založená na stanovení stupňa zákalu koloidného tymolového činidla, keď sa k nemu pridá 1 až objem séra. Pozitívny je hlavne pri zvýšení obsahu p-lipoproteínov v sére. Ide o jeden z neustále pozitívnych testov na vírusovú hepatitídu a difúzne poškodenie pečene. Je negatívny na obštrukčnú žltačku.

Pri výraznom zvýšení množstva globulínov a najmä fibrinogénu sa tzv formolový test - premena srvátky na želatínovú hmotu (želatinizácia) pridaním formaldehydu.

Všetky sedimentárne testy (bolo ich navrhnutých niekoľko desiatok) sú nešpecifické, ich zmeny sa zisťujú nielen pri ochoreniach pečene, ale aj pri myelóme, kolagenóze atď. Tieto testy odhalia dysproteinémiu, ale oveľa jednoduchším a dostupnejším spôsobom ako elektroforéza.

Protrombín (faktor II zrážania krvi) sa syntetizuje iba v pečeni za účasti vitamínu K. Príčinou hypoprotrombinémie môže byť buď porušenie schopnosti hepatocytov syntetizovať protrombín, alebo nedostatok vitamínu K rozpustného v tukoch vstupujúceho do pečene z čreva. Pri obštrukčnej žltačke, keď je narušené vstrebávanie tukov a s nimi aj vitamínu K, klesá tvorba protrombínu v pečeni a jeho obsah v krvi. Ak chcete zistiť príčinu hypoprotrombinémie, použite test s parenterálnym podaním vitamínu K . Ak sa potom obsah protrombínu v sére zvýši, znamená to, že funkcia pečene tvoriaca protrombín nie je narušená. Tento test pomáha odlíšiť obštrukčnú žltačku od parenchýmovej žltačky. Protrombín je určený rýchlosťou zrážania rekalcifikovanej plazmy v prítomnosti nadbytku tromboplastínu.

Stanovenie obsahu produktov rozkladu bielkovín. Z produktov rozkladu bielkovín majú určitý diagnostický význam aminokyseliny, močovina, zvyškový dusík a amoniak. Celkom aminokyseliny hladina v krvi sa zvyšuje až pri ťažkom poškodení pečene, kedy je narušená jej deaminácia a funkcie tvorby močoviny, ktoré sú vo všeobecnosti dosť stabilné. Podmienka pre zvyšovanie obsahu zvyškový dusík krvi pri ochoreniach pečene je súčasné poškodenie funkcie obličiek. Zvýšenie zvyškového dusíka pri zlyhaní obličiek sa líši od zvýšenia pri hepato-renálnom zlyhaní tým, že v prvom je hlavnou zložkou zvyškového dusíka močovina a v druhom je významný podiel tvorený aminokyselinami. Samostatné stanovenie aminokyselín v krvi pomocou chromatografie neposkytuje dostatočne jasné diagnostické údaje o poškodení pečene, ktoré by odôvodňovali takýto prácne náročný postup. Určitú diagnostickú hodnotu si zachováva metóda stanovenia kryštálov leucínu a tyrozínu v močovom sedimente, ktoré sa v ňom objavujú pri akútnej dystrofii pečene.

Kvantitatívne stanovenie sérových bielkovín. Zmeny v zložení bielkovín v krvi, hoci nie sú úplne špecifickým prejavom poškodenia pečene, odrážajú povahu patologického procesu (zápal, nekróza, novotvar atď.), Ako aj narušenie funkcie tvorby bielkovín pečeň a retikulo-histiocytový systém. Na kvantitatívne stanovenie sérových proteínov existujú rôzne fyzikálno-chemické metódy: refraktometrické metódy, kolorimetrické metódy (biuretové metódy), iefelometrické metódy a elektroforetická frakcionácia. Normálne hodnoty celkového sérového proteínu pri použití metód založených na vysolení sú od 7 do 8 g%, z toho 3,5-5,1 g% albumínu a 2,5-3,5 g% globulínu. Pomer množstva albumínu k množstvu globulínu (pozri Pomer albumín-globulín) je 1,5-2,3. Elektroforetická analýza (pozri Elektroforéza) normálne poskytuje nasledujúce pomery jednotlivých proteínových frakcií (v %): albumín - 55-60; a1-globulíny - 2,1-3,5; a2 -globulíny - 7,2-9,1; β-globulíny - 9,1-12,7; U-globulíny - 16-18 celkový obsah bielkovín. Hyperproteinémia sa pozoruje pri chronickej hepatitíde a postnekrotickej cirhóze pečene. Hypoproteinémia - častejšie s portálnou cirhózou, najmä s ascitom.

Zníženie množstva sérového albumínu v dôsledku porušenia ich syntézy v pečeni sa pozoruje pri ťažkých formách hepatitídy, dlhotrvajúcej obštrukčnej žltačke a najmä u pacientov s cirhózou pečene (v 85% prípadov). Zvýšenie γ-globulínov sa takmer neustále pozoruje pri cirhóze pečene (častejšie s postnekrotickou), chronickej hepatitíde, poškodení extrahepatálnych žlčových ciest sprevádzanom infekciou a pri primárnej rakovine pečene. Typicky je zvýšenie percenta β-globulínov spojené s vysokými hladinami lipidov v sére; zvýšenie množstva α2-globulínov sa pozoruje pri chronickej hepatitíde, zápale žlčových ciest a dlhotrvajúcej obštrukčnej žltačke. Obzvlášť prudké zvýšenie obsahu α2-globulínov naznačuje možnosť zhubných nádorov pečene. Pri ťažkých formách cirhózy pečene sa na elektroferograme pozoruje zvýšenie a fúzia frakcií β- a γ-globulínu.

Sedimentárne vzorky. Z týchto vzoriek možno nepriamo posúdiť stav bielkovinového zloženia krvi a do určitej miery aj funkčný stav pečene. Výsledky vzoriek sedimentov závisia nielen od pomeru a povahy proteínových frakcií krvného séra, ale aj od prítomnosti neproteínových látok (lipidov, elektrolytov atď.) spojených s proteínom.

Sublimačný test je založený na vyzrážaní proteínov krvného séra roztokom sublimátu. Výsledky sú vyjadrené v mililitroch sublimačného roztoku, pridávaného do zakalenia (norma 1,8-2,2 ml). Tento test je častejšie pozitívny pri chronickej hepatitíde, cirhóze pečene a menej často pri akútnej hepatitíde. Pozitívny test na chlorid ortutnatý sa pozoruje aj pri iných zápalových ochoreniach (zápal pľúc, zápal pohrudnice, akútny zápal obličiek atď.).

Veltmanov test (pozri Veltmanovu koagulačnú pásku) sa skracuje (posun doľava) pri akútnych zápalových procesoch a predlžuje (posun doprava) pri chronických procesoch. Poškodenie pečeňového parenchýmu zvyčajne vedie k predĺženiu koagulačného pásma.

Tymolový test je založený na elektrofotometrickom stanovení stupňa zákalu krvného séra v porovnaní so štandardnými roztokmi po 30 minútach. po pridaní tymolového činidla. Indikátory sú uvedené v jednotkách absorpcie svetla (norma 1,5 jednotiek). Tento test odráža skôr zápalovú reakciu ako priame hepatocelulárne poškodenie. Test je pozitívny na anikterickú hepatitídu, stukovatenie pečene a cirhózu pečene. Zvýšenie tymolového testu na konci akútnej hepatitídy môže naznačovať jej prechod na chronickú formu.

Takata-Ara test - tvorba zrazeniny zo srvátkových bielkovín s prídavkom sublimátu, sódy a fuchsínu. Za normálnych podmienok sa pri známych riedeniach séra vytvorí zrazenina. Pri ochoreniach pečene sa tvorí pri širších hraniciach riedenia séra.

Reakcia je pozitívna, keď sa po 24 hodinách vytvorí vločkovitá zrazenina aspoň v troch po sebe nasledujúcich skúmavkách, slabo pozitívna je, keď sa zrazenina vytvorí v dvoch skúmavkách.

Reakcia je pozitívna pri chronickej hepatitíde, jej prechode do cirhózy, cirhózy pečene, menej často pri akútnej hepatitíde. Táto reakcia je pozitívna aj pri iných zápalových ochoreniach (pleuréza, zápal pľúc, tuberkulóza a pod.).

Nešpecifickosť vzoriek sedimentov znižuje ich hodnotu ako funkčných pečeňových testov, odráža však dynamiku vývoja patologického procesu (závažnosť, závažnosť, komplikácie). Je vhodné ich použiť v kombinácii s niekoľkými vzorkami a elektroforetickými štúdiami proteínových frakcií.

Krvný amoniak. Na stanovenie hladiny amoniaku v krvi sa najčastejšie používa metóda Conwayovej izometrickej destilácie. Normálne je obsah amoniaku v žilovej krvi extrémne nízky alebo rovný nule. Hladiny amoniaku sa zvyšujú, keď sú v portálnom systéme kolaterály, čím sa krv s vysokým obsahom amoniaku dodáva z čreva priamo do žilovej siete. Počas pečeňovej kómy sa pozoruje významné zvýšenie amoniaku v krvi.

Krvné glykoproteíny sú vysokomolekulárne komplexy postavené z bielkovín a mukopolysacharidov. Glykoproteíny je možné stanoviť pomocou papierovej elektroforézy. V krvi sa glykoproteíny nachádzajú vo všetkých proteínových frakciách. Ich priemerný obsah v albumíne je 20,8 %; v α1-globulínoch - 18,6 %; v a2-globulínoch - 24,8 %; v β-globulínoch - 22,3 %; v u-globulínoch - 13,7 %. Okrem toho sa môže použiť jednoduchšia difenylamínová reakcia (do filtrátu krvného séra bez obsahu bielkovín sa pridá difenylamínové činidlo).

Pri Botkinovej chorobe a chronických ochoreniach pečene sa v období exacerbácií zvyšuje obsah α-glykoproteínov, γ-glykoproteínov a znižuje sa hladina glykoproteínov v albumínovej frakcii; Rýchlosť difenylamínovej reakcie je tiež zvýšená u významnej časti týchto pacientov. Pri ťažkej cirhóze klesá hladina glykoproteínových frakcií albumínu, ako aj α1 a α2-glykoproteínov, so zvýšením množstva glykoproteínov sa rýchlosť difenylamínovej reakcie prudko znižuje. Najväčšie zvýšenie obsahu α1 a α2-glykoproteínov sa pozoruje pri rakovine pečene.

Stanovenie celkového proteínu v sére\plazme\krvi a iných biologických tekutinách.

Všetky známe metódy na stanovenie koncentrácie celkového proteínu v krvnom sére sú rozdelené do nasledujúcich hlavných skupín:

1.Azotometrická, založená na stanovení množstva bielkovinového dusíka - Kjeldahlova metóda a jej modifikácie.

2.Metódy na stanovenie hustoty séra sú nepresné, pretože hustota závisí nielen od obsahu bielkovín.

3. Váženie - proteíny krvného séra sa vyzrážajú, vysušia sa do konštantnej hmotnosti a odvážia sa na analytických váhach. Metódy sú náročné na prácu a vyžadujú veľké množstvo séra.

4. Refraktometrické – nie dokonalé, lebo časť refrakcie je určená inými zložkami séra.

5.Kolorimetrická – najrozšírenejšia je biuretová metóda, ktorá je jednotná.

6. Iné metódy – nefelometrické, polarimetrické, spektrofotometrické – sa veľmi nepoužívajú.

Domáci priemysel spustil výrobu súprav na štúdium koncentrácie celkového proteínu v krvnom sére pomocou biuretovej reakcie. Rovnaký princíp sa používa na meranie hladiny celkového proteínu v biologických tekutinách pomocou činidiel dodávaných rôznymi spoločnosťami.

Stanovenie celkového proteínu v krvnom sére pomocou biuretovej reakcie.

Činidlá.

1,0,9 % roztok chloridu sodného /0,9 g chloridu sodného na 100 ml destilovanej vody/.

2,0,2N roztok hydroxidu sodného bez oxidu uhličitého /20 ml 1N hydroxidu sodného sa doplní na 100 ml prevarenou destilovanou vodou/.

3. Biuretové činidlo: 4,5 g Rochellovej soli sa rozpustí v 40 ml 0,2 N roztoku hydroxidu sodného, ​​potom sa pridá 1,5 g síranu meďnatého a 0,5 g hydroxidu sodného. Uchovávajte v nádobe z tmavého skla, roztok je stabilný.

4,0,5 % roztok jodidu draselného v 0,2 N roztoku hydroxidu sodného.

5. Pracovný roztok biuretového činidla: 20 ml biuretového činidla sa zmieša s 80 ml roztoku jodidu draselného. Rackové riešenie.

6. Štandardný roztok albumínu z ľudského alebo hovädzieho séra: 10 % roztok albumínu v 0,9 % roztoku chloridu sodného /1 ml roztoku obsahuje 0,1 g bielkovín - 100 g/l/.

Princíp metódy.

Proteíny reagujú v alkalickom prostredí so síranom meďnatým za vzniku zlúčenín sfarbených do fialova (biuretová reakcia).

Postup stanovenia: do 5 ml pracovného roztoku biuretového činidla pridajte 0,1 ml séra a premiešajte tak, aby sa nevytvorila pena. Po 30 minútach \a najneskôr do hodiny\ sa meria na FEC v kyvete s hrúbkou vrstvy 1 cm pri vlnovej dĺžke 540-560 nm \zelený svetelný filter\ proti kontrole.

Kontrola: 0,1 ml 0,9 % roztoku chloridu sodného sa pridá k 5 ml pracovného roztoku biuretového činidla, potom sa spracuje ako experiment.

Výpočet sa vykonáva podľa kalibračného plánu.

Normálne hodnoty celkového proteínu sú 65-85 g/l.

Zostrojenie kalibračného grafu.

Činidlo:štandardný roztok albumínu 10 % v 0,9 % roztoku chloridu sodného, ​​ktorého 1 ml obsahuje 0,1 g bielkovín. Na prípravu činidla môžete použiť lyofilizovaný albumín zo súpravy „Bilirubin-standard“ od spoločnosti Lachem. Pokyny súpravy uvádzajú obsah albumínu v mg. Na základe toho vypočítame, koľko 0,9 % chloridu sodného je potrebné pridať k danému albumínu, aby sme získali 0,1 g bielkovín v 1 ml roztoku.

Napríklad: Pokyny súpravy uvádzajú, že lyofilizovaný albumín obsahuje 160 mg albumínu. Výpočet: štandardný 10 % roztok obsahuje 10 g alebo 10 000 mg na 100 ml

v štandarde 160 mg v X

X = 1,6 ml, t.j. pridajte 1,6 ml 0,9 % chloridu sodného do fľaštičky obsahujúcej albumín a zistite, že 1 ml tohto roztoku obsahuje 0,1 g bielkovín.

Po príprave štandardného roztoku z neho pripravíme sériu pracovných riedení podľa tabuľky:

Výpočet koncentrácie bielkovín vg/l.

1 ml štandardného 10 % roztoku obsahuje 0,1 g bielkovín

V 1 ml roztoku je obsiahnutých 0,04 g bielkovín

X v 1000 ml

Z každého pracovného riedenia zodpovedajúcej koncentrácie odoberte 0,1 ml do 3-4 skúmaviek, t.j. každé stanovenie sa uskutoční v 3 až 4 paralelách a do každej skúmavky sa pridá 5 ml biuretového činidla. Po 30-60 minútach sa kolorimetrizuje na FEC oproti kontrole. Získame 3 až 4 hodnoty optickej hustoty pre každú koncentráciu. Nájdeme z nich aritmetický priemer, keď sme predtým vylúčili výrazne odlišné hodnoty.

Zostavíme kalibračný graf: pozdĺž osi x vynesieme koncentráciu proteínu v g/l, t.j. 40-60-80-100 g\l; a pozdĺž osi y sú hodnoty optickej hustoty získané pri FEC \aritmetický priemer/.

Kalibračná krivka by mala vyzerať ako prima čiara nakreslená cez 3 body. Táto krivka sa testuje na darcovských sérach \najmenej 3-4 stanovenia\. Pri získavaní normálnych hodnôt bielkovín, t.j. v normálnych medziach; V práci je použitá zostrojená kalibračná krivka.

Poznámka.

1. Kalibračná krivka sa musí zostrojiť aspoň raz za rok, ako aj vždy po oprave a na novom fotoelektrickom kolorimetri.

2. Lineárny vzťah medzi optickou hustotou a koncentráciou sa udržiava až do D=0,5. Ak srvátka obsahuje väčšie množstvo bielkovín, potom sa srvátka zriedi chloridom sodným na polovicu.

Stanovenie močoviny v krvi a moči.

Močovina je hlavným produktom katabolizmu proteínov obsahujúcim dusík.

Pri rozklade bielkovín sa hromadí amoniak, toxická látka. Hlavným spôsobom neutralizácie amoniaku je syntéza močoviny v pečeni. Koncentrácia močoviny v krvi závisí od rýchlosti jej tvorby v pečeni a odvádzania z tela cez obličky močom.

U väčšiny pacientov rýchlosť tvorby močoviny odráža rýchlosť využitia a rozpadu bunkových proteínov.

Pri ťažkej patológii pečene je narušená schopnosť hepatocytov syntetizovať močovinu, hromadí sa amoniak a znižuje sa obsah močoviny v krvi.

K odstráneniu vzniknutej močoviny dochádza močom a závisí od vylučovacej funkcie obličiek.

Stanovenie močoviny sa vykonáva pomocou nasledujúcich metód:

1. Chemická metóda farebnej reakcie s diacetylmonooxímom.

2. Enzymatická metóda (ureáza)

3. Metóda „suchej chémie“.

Stanovenie močoviny reakciou s diacetylmonooxímom.

Činidlá.

1. Diacetylmonooxím a tiosemikarbazid alebo činidlo v tabletách.

2. Referenčný alebo štandardný roztok obsahujúci 100 mg močoviny v 100 ml alebo 1 mg v 1 ml.

Príprava roztokov.

Roztok činidla: 1 tabletu rozpustite za zahrievania v 50 ml odmernej banke v 30 ml destilovanej vody. Po ochladení priveďte objem po značku. Roztok je stabilný niekoľko týždňov.

Roztok kyseliny sírovej: do 250 ml odmernej banky pridajte 150 ml destilovanej vody a 25 ml 96 % kyseliny sírovej analytickej čistoty. Po ochladení zahrejte a priveďte objem po značku. Roztok je stabilný.

Pracovný roztok činidla a kyseliny sírovej sa pripraví pred reakciou v pomere 1:1 (pozri diagram).

Princíp metódy.

Močovina tvorí s diacetylmonooxímom za prítomnosti tiosemikarbazidu a solí železa v silne kyslom prostredí červený komplex, intenzita farby je úmerná koncentrácii močoviny.

Pokrok v odhodlaní.

Štandard kontroly skúseností s činidlami

1.sérum 0,02 - -

2.pracovný roztok

a\reagenčný roztok 2,0 2,0 2,0

b\sírový roztok

kyseliny 2,0 2,0 2,0

3.štandardná veľkosť

močovina - - 0,02

Namočte na 10 minút do vriaceho vodného kúpeľa. Ochlaďte 2-3 minúty pod tečúcou studenou vodou. Kolorimeter najneskôr po 15 minútach: zelený filter \pri vlnovej dĺžke 490-540\, kyveta 1 cm, opačná kontrola.

Kalkulácia: Predtým

X= -------- * C st v mmol\l, kde

Do - optická hustota experimentu;

Dst - optická hustota štandardného roztoku močoviny alebo štandardu;

Cst je koncentrácia močoviny v štandardnom roztoku;

X je koncentrácia močoviny vo vzorke séra.

Na prepočet mg% na mmol\l sa použije koeficient 0,1665.

Normálne hodnoty močoviny v krvnom sére sú 2,5 - 8,3 mmol/l.

Poznámky

1. Vyššie uvedený postup stanovenia je možné upraviť zvýšením objemov všetkých meraných roztokov 2-3 krát v závislosti od objemu kyviet.

3. Prepočet hodnôt močoviny na močovinový dusík je možné vykonať vynásobením faktorom 0,466.

4. Tiosemikarbazid je toxické činidlo. Pri práci s ním musíte dodržiavať pravidlá pre prácu s toxickými látkami.

Na posúdenie stavu metabolizmu bielkovín, ako aj funkcií jednotlivých orgánov sa vykonáva stanovenie celkového proteínu a jeho frakcií, močoviny, kreatinínu a ďalších zložiek zvyškového dusíka v krvnom sére.
Na stanovenie celkovej bielkoviny krvného séra sa používajú spaľovacie metódy (kjeldalemetrické), refraktometrické, spektrofotometrické a pod.. V laboratóriách veterinárnej medicíny sa používajú najmä refraktometrické a kolorimetrické (biuretové) metódy. Pri stanovení proteínových frakcií krvného séra sa používajú metódy elektroforetické (na agarovom géli, v polyakrylamidovom géli, na papieri, acetát celulózy), turbidimetrické (vysolenie neutrálnymi soľami), sedimentačné (separácia proteínov na frakcie ultracentrifugáciou) atď. .
V klinickej praxi sa na separáciu proteínov častejšie používajú elektroforetické a turbidimetrické metódy. Elektroforézou na papieri sa získa 5 hlavných frakcií: albumín, ap, (X2, P- a 7-globulíny. Nevýhodou tejto metódy je trvanie analýzy (výsledky výskumu je možné získať len na 2.-3. deň) , nie veľmi zreteľná separácia proteínov frakcií.Elektroforézou na agarovom géli sa získa jasnejšia separácia proteínových frakcií ako na papieri, avšak zložitosť postupu prípravy gélu neumožňuje široké zavedenie tejto metódy do laboratórnej praxe. Pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli možno získať proteínových frakcií okolo 30. Nevýhodou metódy je obtiažnosť kvantitatívneho hodnotenia získaných frakcií.
Metóda elektroforézy na acetáte celulózy sa považuje za jednotnú. Ak v laboratóriu nie je k dispozícii elektroforéza, používajú sa metódy na zrážanie proteínov neutrálnymi soľami, po ktorých nasleduje turbidimetrické meranie stupňa zákalu média na FEC. Pomer albumínov a globulínov v krvnom sére sa stanovuje proteínovo-sedimentárnymi testami (sublimačné, so síranom zinočnatým, tymolom atď.).
Reziduálny dusík označuje množstvo dusíka, ktoré zostáva v krvi po vyzrážaní bielkovín. Patrí sem dusík z močoviny, aminokyseliny, kreatinín, kreatín, kyselina močová, indikán, amoniak, polypeptidy, nukleotidy, biogénne amíny a ďalšie produkty metabolizmu bielkovín. Hlavnou časťou zvyškového dusíka v krvi je močovinový dusík, ktorý tvorí najmenej 1/2 celkového neproteínového dusíka v krvi.
Asi 1/4 zvyškového dusíka tvorí dusík z aminokyselín, kreatínu a kreatinínu. Najväčší klinický význam má stanovenie jednotlivých frakcií zvyškového dusíka, najmä močoviny, amínového dusíka, kreatínu a kreatinínu, kyseliny močovej a indikánu.
Na stanovenie močoviny v krvi, moči a iných biologických tekutinách sa používajú diacetylmonooxím, ureáza, chlórnan, hypobromid, xanthydrol a ďalšie metódy. Najbežnejšia je kolorimetrická metóda, založená na interakcii močoviny s diacetylmonoxímom za vzniku farebných produktov (Fironova reakcia). Metódy na stanovenie močoviny pomocou enzýmu ureáza sú však presnejšie a špecifickejšie.
Na stanovenie bielkovín, albumínu, močoviny, kreatinínu, ako aj ďalších biochemických ukazovateľov je možné použiť reflexné fotometre a diagnostické prúžky systému „suchej chémie“ a biochemické autoanalyzátory. Skúmavky na odber krvi by nemali obsahovať čistiace prostriedky ani iné čistiace prostriedky. Udržujte ich zatvorené.

Viac k téme METÓDY POSUDZOVANIA STAVU METABOLIZMU PROTEÍNOV:

1. METÓDY HODNOTENIA STAVU VODA-ELEKTROLYTU A METABOLIZMU MINERÁLOV
2. CHOROBY BIELKOVINY, SACHARIDOV A METABOLIZMU TUKOV OBEZITA - ADIPOSITAS
3. POSÚDENIE STAVU VEGETAČNÉHO KRYTU PO SILNOM POŽIARE RAŠELINY
4. Stanovenie proteínových frakcií v krvnom sére turbidimetrickou (nefelometrickou) metódou.
5. SKÚSENOSTI S KVANTITATÍVNYM POSUDZOVANÍM DYNAMICKÝCH PODMIENOK A STABILITY BOROVICOVÝCH VÝSADÍ NA HYDROMELIORAČNÝCH OBJEKTOCH