Metode za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Metode dijagnosticiranja helmintijaze u sadašnjoj fazi

7.7. Metode za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta

Održivost jaja helminta određena je izgled, bojanjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalnim uvjetima i izvođenjem biološkog uzorka.

Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je poderana ili savijena prema unutra, plazma je mutna i olabavljena. Segmentirana jaja imaju kuglice za drobljenje (blastomere) nejednake veličine, nepravilnog oblika, često pomaknut na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja koja se, unatoč vanjskim deformacijama, normalno razvijaju. U živim ličinkama valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u srednjem dijelu tijela; dok umiru, širi se cijelim tijelom, pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole, takozvane "niske bisera".

Da bi se utvrdila održivost zrelih jajašaca okruglih crva, bičaša, pinworma, aktivni pokreti ličinki trebaju biti uzrokovani blagim zagrijavanjem lijeka (na temperaturu ne veću od 37 ° C). Pogodnije je promatrati vitalnost ličinki valjkastih glista i bičaša nakon što su izolirane iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod ličinki invazivnih valjkastih glista često se vidi ljuštenje ovojnice na kraju glave, a kod ličinki bičaša koje su završile razvoj u jajetu, stilet se nalazi na tom mjestu pri velikom povećanju. U mrtvim ličinkama helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuje se propadanje tijela. U tom slučaju unutarnja struktura ličinke postaje blokovita ili zrnasta, a tijelo postaje mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Sposobnost preživljavanja onkosfera taeniida (goveđa, svinjska trakavica, itd.) određena je kretanjem embrija kada su izloženi probavnim enzimima. Jaja se stavljaju na satno staklo sa želučana kiselina psi ili umjetni duodenalni sok. Sastav potonjeg: pankreatin - 0,5 g, natrijev bikarbonat - 0,09 g, destilirana voda - 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36 - 38 °C 4 sata. U ovom slučaju, živi embriji se oslobađaju svojih membrana. Ljuske živih onkosfera također se otapaju u zakiseljenom pepsinu i u alkalnoj otopini tripsina nakon 6-8 sati u termostatu na 38°C.

Ako jaja teniida stavite u 1% otopinu natrijevog sulfida ili 20% otopinu natrijevog hipoklorida ili u 1% otopinu klorirane vode na 36 - 38°C, zreli i živi embriji se oslobađaju membrana i ne promjena tijekom 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere se smanjuju ili nabubre i naglo se povećavaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta do 2 sata. Živi embriji taeniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36 - 38 °C.

Preživljavanje Adolescaria fascioli sakupljenih na biljkama i drugim objektima vodenih tijela provjerava se ispitivanjem na predmetnom stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom s postoljem za zagrijavanje. Kada se ličinke trematoda zagriju, počinju se kretati.

Da bi se odredila održivost jaja patuljaste trakavice, najjednostavnija je metoda N.S. Ionine: u živim jajima, srednji par embrionalnih kukica je ili paralelan s bočnima, ili potonji tvore kut s medijanom na bazi manji od 45°. U mrtvim jajima, bočni parovi tvore kut s srednjim parom na bazi veći od 45°, ili su kuke nasumično razbacane (njihov raspored parova je izgubljen); Ponekad se embrij smanji i formiraju se granule. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5 - 10 ° do 38 - 40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih jaja nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca glista u 3% otopinu formaldehida pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24 - 30 °C, jajašca glista u 3% otopina klorovodične kiseline na temperaturi od 30 - 35 ° C; jajašaca pinworma u izotoničnoj otopini natrijeva klorida na temperaturi od 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvoriti 1-2 puta tjedno radi boljeg prozračivanja, a filtar papir treba ponovno navlažiti čistom vodom.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2 - 3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su prve faze drobljenja, dijeljenje sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvih dana razvija se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilnog pijeska, drvenog ugljena i izmeta s jajima glista, razrijeđena vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlije na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1 - 2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25 - 30 °C iz jaja se izlegu rabditiformne ličinke, koje nakon 5 - 7 dana postaju filariformne: ličinke pužu uz stijenke cilindra, gdje se nalaze vidljiv čak i golim okom.

Jaja trematoda koje se prirodno razvijaju u vodi, primjerice opisthorchis, diphyllobothriidae, fasciolae i druge, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili drugu posudu, te se prelije malim slojem obične vode. Pri uzgoju jaja Fasciola treba voditi računa da se ona brže razvijaju u mraku, dok se u živim jajima na temperaturi od 22 - 24 °C miracidij stvara za 9 - 12 dana. Pri mikroskopiranju jajašaca trematoda u razvoju jasno su vidljivi pokreti miracidija. Miracidium fasciola izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu.

Fullebornova metoda. Ličinke ankilostoma i strongilida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon držanja u termostatu na temperaturi od 25 - 30 ° C tijekom 5 - 6 sati, ličinke pužu po agaru, ostavljajući iza sebe stazu bakterija.

Harada i Mori metoda. Dodajte 7 ml destilirane vode u epruvete postavljene u stalak. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g izmeta i napraviti razmaz na filtar papiru (15 x 150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira radi zaštite površine laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dospije do dna epruvete. Gornji kraj prekrijte komadom celofana i čvrsto omotajte elastičnom trakom. Na epruvetu se upisuje broj i prezime osobe koja se ispituje. U tom stanju epruvete se čuvaju 8 - 10 dana na temperaturi od 28 °C. Za proučavanje ličinki uklonite celofanski omotač i pincetom uklonite traku filter papira. Pri tome treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stranu cijevi i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stavljaju u vruće vodena kupka na temperaturi od 50 °C 15 minuta, nakon čega se njihov sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu od 15 ml da se ličinke talože. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a sediment prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i ispita mikroskopski pod malim povećanjem.

Za diferencijalnu dijagnozu filariformnih ličinki potrebno je koristiti podatke u tablici 3.

Tablica 3

DIFERENCIJALNA DIJAGNOSTIKA FILARIOIDNIH LARVI A. DUODENALE, N. AMERICANUS, S. STERCORALIS, TRICHOStrONGYLUS SP.

Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u U nekim slučajevima Neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Za razlikovanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Leukobaza metilensko modrilo često se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost pa dobiva boju.

Kriterij za stanje jajeta je bojanje embrija, ali ne i ljuske. Ta je sposobnost povezana s uvjetima pod kojima jajašce umire. U slučajevima kada vlaknasta membrana u mrtvom jajetu ne izgubi svoja polupropusna svojstva, ona neće dopustiti prolaz bojila, pa stoga mrtvi embrij neće biti obojen. Obojeni embrij uvijek ukazuje na smrt jajeta.

Za bojanje jaja okruglih crva možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (0,05 g metilenskog plavog, 0,5 g natrijevog hidroksida, 15 ml mliječne kiseline). Živa jaja ne percipiraju boju; embriji mrtvih jajašaca postaju plavi. Bojanje ličinki glista baznom otopinom briljantkrezil plave boje u koncentraciji 1:10000 provodi se na sljedeći način: kap tekućine s jajima glista i kap bazne otopine boje nanese se na predmetno staklo. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na predmetno stakalce. Broj ličinki u nastajanju i stupanj njihove obojenosti promatraju se pod mikroskopom; nakon čega se nakon 2 - 3 sata ponovo ispituje isti lijek. Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata. Mrtve ličinke ili ne izlaze iz jaja, ili postaju obojene kada se ljuska pukne (djelomično ili potpuno).

Pri određivanju održivosti jaja ptičjih valjkastih glista, moguće je preparate obojiti 5% alkoholnom otopinom joda. Kada se nanese na pripravak, klice mrtvih jaja Ascaridia javljaju se unutar 1 - 3 sekunde. obojeni su narančastom bojom.

Mrtva jajašca opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice otopinom briljantnog krezil modrila (1:10000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja jajašca i onkosfere isperu čistom vodom i dodatno boje safraninom (razrijeđen 1:10 000 u alkoholu 10 °C). Alkohol skida boju s ljuske, a šafranin ju pocrveni. Zbog toga živa jaja postaju crvena; jaja s mrtvim embrijima postaju plava, ali ljuska ostaje crvena. Mrtvi embriji onkosfera goveđe trakavice brzo, unutar nekoliko minuta, poprime jarkocrvenu ili ružičasta boja safranin ili modro briljantno krezil plavo u razrjeđenju 1:4000, ili indigo karmin u razrjeđenju 1:1000 - 1:2000. Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2 - 7 sati.

Za određivanje održivosti jaja patuljaste trakavice preporučuje se korištenje sljedećih boja:

1. Brilliantcreasyl blue (1:8000) - nakon 1 sata, onkosfera mrtvih jajašaca postaje posebno svijetle boje, koja se oštro ističe na blijedoj ili bezbojnoj pozadini ostatka jaja.

2. Safranin (1:8000 pri izlaganju 2 sata i 1:5000 3 - 5 sati).

3. 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1: 2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29 - 30 ° C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

Fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih od mrtvih tijela bez oštećenja jajašca. Za fluorescenciju se ne koriste ultraljubičaste zrake, već plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s uobičajenim mikroskopom i stakalcima; Iluminatoru OI-18 dodan je poseban set filtara u boji.

Živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, patuljaste trakavice, goveđe trakavice, široke trakavice i drugih helminta različito fluoresciraju. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminescencije bez upotrebe boja i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, akrin itd.).

Nebojana, živa, nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima ljuska emitira zeleno svjetlo puno jače od tamnozelenog embrionalnog dijela; U jajima valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, a u mrtvim jajima i ljuska i ličinka svijetlo su žute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljaste trakavice emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; ljuska mrtvih jaja intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase.

Uz sekundarnu luminescenciju (kada se boji akridin narančastom u razrjeđenju 1:10 000 i 1:50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuske živih i mrtvih jaja valjkastih crva, toksokara, pinworma, patuljaste trakavice, štakorske trakavice, bikove trakavice i trakavice obojene su narančasto-crvenom bojom. Embriji živih jajašaca valjkastih crva, toxascarisa, štakorske trakavice, široke trakavice i onkosfere goveđe trakavice fluoresciraju mutno tamnozelenom ili sivozelene boje. Mrtva embrionalna jaja ovih helminta emitiraju "goruću" narančasto-crvenu boju. Žive ličinke pinworma i toxocara (oslobođene ljuske jajeta) emitiraju mutno sivo-zeleno svjetlo; kada uginu, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlozelene, zatim žute, narančaste i konačno svijetlonarančaste.

Kada se boje fluorokromima - korifosfilom, primulinom, mrtva jaja valjkastih glista i glista pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već su obojena u tamnozelenu boju.

Živa jaja trematoda (paragonimus i clonorchis) ne svijetle kada se boje akridin narančastom, ali mrtva jaja daju žućkasto-zelenu boju.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, ličinke strongylata i rhabditatusa fluorokromirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) svijetle: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančastom svjetlošću.

Žive miracidije koje izlaze iz ljuske emitiraju prigušeno plavičasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10 - 15 minuta nakon smrti pojavljuju se sa jarkim "gorućim" svjetlozelenim, a zatim narančasto-crvenim svjetlom.

Na primjer, za određivanje održivosti jaja askarida (svinjske gliste, ljudske gliste, Toxocara, Toxascaris itd.) po životinji (zamorci, miševi) potrebno je najmanje 100 - 300 jaja s razvijenim ličinkama. Jajašca ascarisa u izotoničnoj otopini natrijevog klorida pipetiraju se kroz usta miša ili zamorca. Nakon 6-7 dana životinja se zakolje, otvore joj se jetra i pluća i zasebno pregledaju na prisutnost ličinki askaridata. Da biste to učinili, jetra i pluća se škarama isjeckaju na male komadiće i ispituju metodom Berman ili Supryaga (odjeljak 6.1.2).

Ako su životinje bile zaražene živim invazivnim jajima, tada se nakon autopsije migrirajuće ličinke askarida nalaze u jetri i plućima.

U slučaju infekcije, jajašca Fasciole u izmetu laboratorijskih životinja mogu se otkriti kod kunića nakon 2 mjeseca, u zamorci- nakon 50 dana, kod miševa - nakon 35 - 40 dana.

Radi bržeg dobivanja odgovora, laboratorijske životinje se nakon 20 - 30 dana otvore i pregleda jetra na prisutnost mladih fasciola.

Da bi se utvrdila održivost jaja patuljaste trakavice, preporuča se također dati njima prethodno neinficiranim bijelim miševima, nakon čega se životinje nakon 92-96 sati otvore i identificiraju cisticerkoidi u crijevnim resicama ili cestode u crijevnom lumenu.

Za određivanje održivosti jajašaca opisthorchisa preporučuje se metoda (njemački S.M., Baer S.A., 1984.), koja se temelji na fizikalno-kemijskoj aktivaciji miracidijeve žlijezde za izleganje i stimulaciji motorna aktivnost ličinke, što dovodi do otvaranja poklopca jajeta i aktivnog oslobađanja miracidija u eksperimentalnim uvjetima.

Suspenzija jaja opisthorchisa u vodi prethodno se ohladi na 10 - 12 °C (sve naredne radnje izvode se na sobnoj temperaturi 19 - 20 °C). 1 kap suspenzije koja sadrži 100 - 150 jaja dodaje se u epruvetu centrifuge. Epruveta se stavlja u stalak 5 - 10 minuta. Za to vrijeme sva jaja uspiju potonuti na dno. Zatim se višak vode pažljivo odsisa trakom filter papira i u epruvetu se dodaju 2 kapi posebnog medija. Medij je pripremljen u 0,005 M Tris-HCl puferu; u pufer se dodaje 12 - 13% otopina etanola i boja (fuksin, safranin, eozin, metilensko modrilo itd.). Epruveta se protrese, njen sadržaj se pipetira na predmetno staklo i ostavi 10 minuta uz lagano mućkanje. Zatim dodajte 2 kapi navedenog medija. Preparat je spreman za mikroskopiranje pod konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom pri 20x povećanju.

Tijekom tog vremena otvara se poklopac održivih ličinki, a miracidij aktivno izlazi u navedeno okruženje. Zahvaljujući prisutnosti etanola u njemu, imobiliziraju se nakon 2 - 5 minuta i zatim se boje bojom. Mogu se lako detektirati i prebrojati mikroskopom.

Materijal za istraživanje: izmet, urin, duodenalni sadržaj, sputum, krv, koža, perianalni dendrit, mišićno tkivo.

Mikroskopske metode istraživanja temelje se na otkrivanju jaja i ličinki helminta. Ovisno o ciljevima istraživanja, dijele se na kvalitativne i kvantitativne.

1. Kato metoda debelog razmaza. Princip metode je da se jaja helminta nalaze u debelom razmazu izmeta, očišćenom glicerinom i obojenom malahitno zelenom bojom. Metoda je najučinkovitija za ascariasis, trichocephalosis, diphyllobothriasis, taeniasis i, u manjoj mjeri, za ankilostomidozu i patuljastu trakavicu.

3. Metoda obogaćivanja(Kofoida - Barbera) temelji se na principu plutanja jaja u zasićenoj otopini stolna sol. Možete pronaći jajašca trematoda, trakavica, onkosfera, tenida i neoplođena jajašca valjkastih glista.

4. Kalantaryan metoda- princip je isti kao i prethodni, ali se kao flotacijska otopina koristi zasićena otopina dušikovog nitrata.

5. Postoje posebne metode ispitivanje izmeta na prisutnost fasciliaze, strongiloidijaze, ankilostomidoze.

6. Prianalna i perianalno-rektalna metoda dijagnoza enterobiasis. Struganje se radi ujutro (prije odlaska na toalet i defekacije) ili navečer tijekom spavanja.

Vrlo važno znati

Helmintološke metode istraživanja. Metode za dijagnosticiranje helmintoza dijele se na izravne, koje se temelje na izravnoj detekciji samih helminta ili njihovih fragmenata, kao i ličinki i jajašca helminta (metode ispitivanja izmeta, urina, žuči i duodenalnog sadržaja, sputuma, krvi i tkiva, materijala dobiven struganjem s perianalnog područja i subunguvalnih prostora), i neizravni, uz pomoć kojih se otkrivaju sekundarne promjene koje nastaju u ljudskom tijelu kao posljedica aktivnosti helminta (istraživanja morfološki sastav krv, imunološke metode za dijagnosticiranje helmintijaza, rendgenske studije itd.). Od izravnih metoda najčešće su skatološke, koje se dijele na makro- i mikrohelmintoskopske. U nekim slučajevima koriste se posebne metode.

Makrohelmitoskopske metode istraživanja usmjerene su na traženje helminta ili njihovih fragmenata (skoleks, segmenti, dijelovi strobila cestoda). Koriste se za dijagnosticiranje onih helmintijaza u kojima se jajašca ne izlučuju u izlučevine pacijenta ili se izlučuju u malim količinama, a ne uvijek (na primjer, kod enterobiaze, pinwormi se nalaze u izmetu, kod taeniasis - segmenti). Da bi se otkrili pinwormi ili segmenti cestoda u izmetu, izmet se ispituje golim okom. Za diferencijalnu dijagnozu taeniaze, preporuča se pregledati izmet razrijeđen vodom u odvojenim malim obrocima u crnim fotografskim kivetama ili u Petrijevim zdjelicama na tamnoj pozadini. Velike formacije sumnjive na fragmente helminta ispituju se pod povećalom između dva stakalca. Ako se prema kliničkim indikacijama nakon tretmana očekuje otkrivanje malih helminta ili glavica cestoda, tada se sumnjive čestice ispituju pod povećalom u kapi glicerina, a po potrebi i pod mikroskopom.

Mikrohelmintoskopske metode istraživanja (kvalitativne) usmjerene su na identifikaciju jaja i ličinki helminta. Koristi se metoda debelog razmaza s celofanskom pokrovnom pločom po Katu. Kato mješavina sastoji se od 6 ml 3% vodene otopine malahitnog zelenila, 500 ml glicerina i 500 ml 6% otopine fenola. Kato ploče (hidrofilni celofan se reže na komade veličine 20-40 mm) urone se 24 sata u Kato smjesu tako da budu jedna uz drugu (3-5 ml Kato otopine na 100 ploča). 100 mg fecesa nanese se na predmetno stakalce, pokrije celofanskom pokrovnom pločom po Katu i pritisne tako da se feces razmaže po stakalcu unutar granica celofanske ploče.

Bris se ostavi na sobnoj temperaturi da se izbistri 40-50 minuta, nakon čega se pregleda pod mikroskopom. U vrućoj sezoni, kako biste spriječili isušivanje pripravka, stavite vlažnu spužvu na tanjur pripremljenog pripravka. Za potpunu detekciju helminta svih vrsta potrebno je koristiti Kato metodu debelog razmaza s celofanskom pokrovnom pločom u kombinaciji s jednom od metoda obogaćivanja. Najčešće od njih su Kalantaryan metoda i Fulleborn metoda. Kalantaryanova metoda: u tikvicama od 100 ml sa širokim grlom staklenim štapićem temeljito promiješajte 5 g izmeta, postupno dodajući zasićenu otopinu natrijevog nitrata (1 kg natrijevog nitrata na 1 litru kipuće vode) do ruba čaše. Velike čestice koje isplivaju na površinu uklanjaju se papirnatom lopaticom. Staklo se nanosi na površinu slane otopine ( slana otopina dodajte dok smjesa ne dođe u potpuni dodir s predmetnim staklom). Nakon 20-30 minuta predmetno stakalce se izvadi i film se pregleda pod mikroskopom. U nedostatku ove soli, možete koristiti zasićenu otopinu kuhinjske soli po Fhollebornu (400 g soli u 1 litri prokuhane vode).

S obzirom da jajašca velike specifične težine (neoplođena jajašca valjkastih glista, jajašca trematoda i velikih cestoda) ne plutaju, uz ispitivanje površinskog sloja tekućine, primjenom Fulleborn metode potrebno je ispitati 2-4 preparata iz sedimenta pod mikroskopom. Posebne laboratorijske metode za ispitivanje raznih helmintijaza. Istraživanje enterobiaze. Ispitivanje na enterobiazu provodi se nakon spavanja bez prethodnog pranja perianalnog područja. Najjednostavniji način je otkriti jajašca pinworma u perianalnom strugotini pomoću drvene lopatice (šibice). Struganje se provodi s površine perianalnih nabora drvenom lopaticom (naoštrenom u obliku lopatice sa šibicom), navlaženom u 50% otopini glicerina ili 1% otopini natrijevog hidrogenkarbonata. Dobiveni materijal pažljivo se sastruže sa lopatice rubom stakalca na drugo staklo u kap 50% otopine glicerola i pregleda pod mikroskopom. Prilikom pregleda radnika Ugostiteljstvo prikladnije je materijal iz subungualnih prostora pregledati mješavinom jednakih količina 50% vodene otopine glicerina i Lugolove otopine.

Učinkovitija metoda je korištenje prozirne polietilenske trake s ljepljivim slojem otiskivanjem perianalnih nabora ispitanika. U laboratoriju se trake ljepljive trake duljine 9 cm prethodno izrežu i zalijepe ljepljivim slojem na stakalce tako da jedan kraj viri izvan ruba stakla za 1 cm. Bijeli papir se zalijepi na ljepljivu stranu izbočenog stakla. kraj vrpce na kojem je zapisan serijski broj studije. Tijekom pregleda prstima uhvatite slobodni kraj trake, odlijepite je sa predmetnog stakla do drugog kraja i nanesite ljepljivi sloj na perianalne nabore. Kako bi se osigurao potpuni kontakt s kožom, traka se zaglađuje drvenom lopaticom. Traka se zatim odlijepi od kože i lijepi na predmetno staklo. Traka se dobro zagladi kako bi se uklonili mjehurići zraka i druge nepravilnosti.

Lijek se ispituje pod mikroskopom. Testovi za tenijazu. Glavna metoda za dijagnosticiranje taeniarinchiasis je istraživanje za utvrđivanje izolacije taeniidnih segmenata u izmetu. Također možete koristiti metodu perianalnog struganja i metodu debelog razmaza s celofanskom pokrovnom pločom po Katu. Dijagnoza taeniasis je teška, jer segmenti svinjske trakavice se aktivno ne izlučuju. Ako se sumnja na tenijazu, potrebno je provesti dijagnostičku dehelmintizaciju malim dozama muške paprati ili sjemenki bundeve. Testovi na strongiloidijazu. Dijagnoza strongiloidijaze postavlja se kada se u izmetu nađu ličinke helminta. Najučinkovitija je Behrmannova metoda. Gumena cijev sa stezaljkom postavlja se na uski kraj staklenog lijevka i pričvršćuje na metalni stalak. U lijevak se stavi metalna mrežica koja sadrži 5-10 g fecesa. Podižući mrežicu, napuniti lijevak vodom zagrijanom na 40-45° tako da donji dio mrežice s izmetom bude uronjen u vodu. Larve iz izmeta aktivno se kreću u toplu vodu i nakupljaju se u donjem dijelu gumene cijevi postavljene na lijevak. Nakon 4 sata stezaljka na epruveti se otvori i tekućina se ispusti u 1-2 epruvete za centrifugiranje. Nakon centrifugiranja od 2-3 minute, supernatant se brzo iscijedi, a sediment prenese na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom.

Najjednostavniju metodu za identifikaciju ličinki strongiloida u izmetu, koja se može koristiti tijekom masovnih istraživanja u žarištima infestacije, predložio je E.S. Shulman, V.G. Supryagoy, G.L. Ivyushcheva i dr. Izmet (5 g) skuplja se u čašu i puni običnom (iz slavine) vodom na sobnoj temperaturi (10-15 ml). Nakon 20 minuta voda se ulije u Petrijevu zdjelicu i pregleda pod mikroskopom. Ako sumnjate na stroigiloidozu u slučaju negativan rezultat Nakon jedne studije, potrebno je ponoviti testove u intervalima od 5-7 dana, kombinirajući ih s studijama duodenalnog sadržaja i žuči. Duodenalni sadržaj i žuč (porcije A, B, C) uzimaju se na uobičajeni način intubacijom. Iz tekućine koja se proučava najprije se izaberu pahuljice koje plutaju u njoj i pregledaju pod mikroskopom, a zatim se pomiješaju s jednakom količinom etilnog etera. Smjesa se temeljito protrese i centrifugira 10-15 minuta na 1500 okretaja u minuti. Supernatant se baci, a cijeli sediment pregleda pod mikroskopom.

Prilikom ispitivanja duodenalnog sadržaja moguće je identificirati helmintiju s lokalizacijom patogena u jetri, žučnom mjehuru, duodenum(na primjer, s opisthorchiasis, fascioliasis, clonorchiasis, dicroceliosis, trichostrongylosis). Istraživanje bolesti ankilostomatozoida. Za dijagnosticiranje ankilostomidoze koriste se metode obogaćivanja prema Kalantaryanu ili Fullebornu. Za diferencijalnu dijagnozu ankilostomostoze i nekatoriaze preporučuje se metoda uzgoja ličinki po Harada - Mori, modificirana od strane Maruashvili i sur. Na filter papir dimenzija 16 x 3,5 nanosi se tanak sloj fecesa tako da rubovi papira ostanu slobodni. Papir s izmetom stavi se u staklenku od 0,8 l i napuni vodom tako da donji rub papira bez izmeta bude uronjen u vodu. Staklenka se stavi u termostat na t° 28° 5-6 dana. Filariformne ličinke, koje su se za to vrijeme razvile iz jaja, spuštaju se duž filter papira i talože se na dnu staklenke. Na kraju inkubacije filtar papir se ukloni iz staklenke, a tekućina se pregleda pod povećalom. U sumnjivim slučajevima, tekućina se centrifugira, a sediment se pregleda pod mikroskopom. Testovi za plućne helmintije.

Za otkrivanje jaja helminta u izmetu koristi se metoda uzastopnih ispiranja. Mali dio izmeta pomiješa se s vodom u Petrijevoj zdjelici i ostavi dok se suspendirane čestice ne slegnu. Sloj supernatanta se iscijedi i zamijeni čistom vodom. Postupak se ponavlja nekoliko puta dok se ne dobije bistri supernatant, a isprani sediment pregledava se pod mikroskopom. Koristi se nekoliko uzoraka izmeta. Testovi na trihinelozu (otkrivanje larvi trihinele). Metodom kompresije komadić bicepsa ili gastrocnemius mišića (u blizini tetiva), uzet kirurški aseptičkom metodom, iglama za seciranje se razdvoji u zasebna tanka vlakna, stisne se između dva stakalca u kapi 50% otopine glicerina tako da se preparat je tanak i proziran. Pod mikroskopom s tamnim vidnim poljem jasno su vidljive ličinke trihinele. Učinkovito je pregledati nekoliko dijelova mišića u kompresorijima koji se koriste u veterinarskoj i sanitarnoj praksi ili u posebnim trihineloskopima.

Bechmanova metoda probave: 1 g zdrobljenih mišića ulije se u 60 ml umjetnog želučanog soka (0,5 g pepsina; 0,7 ml koncentrirane klorovodične kiseline; 100 ml vode) i drži 18 sati u termostatu na t° 37°, gornji sloj tekućine se ocijedi, Topla voda (37-45°) se doda talogu i ulije u Behrmannov aparat. Nakon sat vremena tekućina se ispusti u epruvetu, centrifugira i ispita sediment. Ako su ličinke zatvorene u ovapnjele kapsule, najprije se dekalcificiraju u otopini klorovodične, dušične ili sumporne kiseline. Biotest: komadići mišića koji se proučavaju daju se bijelim miševima ili štakorima, kod kojih se nakon 2-3 dana mogu otkriti zrele trihinele u duodenalnom sadržaju, a nakon 2-3 tjedna. - ličinke u mišićima dijafragme i jezika. Kod helmintoloških rezova komadići mišića se fiksiraju u Bouinovoj, Zenkerovoj ili dr. tekućini.Na uobičajeni način rezovi se pripremaju na mikrotomu i boje Delafieldovim hematoksilinom.

Testovi na cisticerkozu. Golim okom pregleda se komadić mišića, vezivnog tkiva, potkožne kvržice i sl., pažljivo se izdvoji cisticerk (bjelkasta prozirna vezikula veličine 1-2 cm), zgnječi se između dva stakalca u kapi glicerina i pregleda. pod mikroskopom. Da bi se odredila održivost cisticerka izoliranih iz tkiva, oni se drže u 50% otopini žuči u izotoničnoj otopini natrijevog klorida u termostagu na t ° 37 °; nakon 10-60 minuta, glava održivog cisticerka se okreće prema van.Kalcificirani cisticerk se prethodno dekalcificira s 4% otopinom dušične kiseline tijekom jednog sata. Testovi za shistosomijazu. Pregled urina: najmanje 5 ml urina sakupljenog sredinom dana stavi se u stožastu čašu na 30 minuta, zatim se ocijedi.

Pipetom se kap sedimenta urina nanese na predmetno staklo, pripremi se razmaz i pregleda pod malim povećanjem mikroskopa. Dodavanje 1-2 kapi 50% otopine glicerola u sediment značajno bistri sediment i olakšava njegovo ispitivanje. Može se koristiti centrifugiranje (osobito s niskim intenzitetom invazije). Uzorak svježeg urina stavi se u 2 centrifugalne epruvete od po 10 ml i centrifugira na 1000-1500 okretaja u minuti 5-10 minuta. Preparati se pripremaju iz sedimenta i ispituju pod malim povećanjem mikroskopa. U pripravke možete dodati 1-2 kapi boje (Lugolova otopina ili 1-2% vodena otopina metilenskog modrila). To stvara pozadinu u boji koja olakšava prepoznavanje jajašca šistosoma. Prilikom proučavanja izmeta metodom sedimentacije, u konusnoj čaši s kapacitetom od 200 ml, pomiješajte 1 g izmeta s 1-2 ml otapala (50% otopina glicerina i izotonična otopina natrijevog klorida u omjeru 1: 1). Razrijediti sadržaj otapalom do volumena posude i ostaviti da se slegne 20-30 minuta. Supernatant se baci, a talog se pregleda pod mikroskopom.

Kako bi se postigla najbolja koncentracija, talog treba resuspendirati u otapalu kako bi se dobila suspenzija i ostaviti da stoji u stožastoj čaši 10 minuta. Sediment iz donjeg sloja uzme se Pasteur pipetom, 2 kapi se stave na predmetno stakalce, pokriju pokrovnim stakalcem i pregledaju pod mikroskopom. Kada se koristi Ritchiejeva sedimentacijska metoda, približno 2 g fecesa pomiješa se u posudi s 10 ml izotonične otopine natrijevog klorida i stavi u epruvetu za centrifugu od 15 ml. Epruveta se zatvori i mućka 30 s. Čep se ukloni i sadržaj centrifugira 2 minute na 2000 okretaja u minuti. Nakon centrifugiranja, supernatant se iscijedi, 10 ml 10% otopine formaldehida se doda sedimentu, dobro promiješa i smjesa se ostavi stajati 5 minuta. U to dodati 3-4 ml etera, zatvoriti epruvetu čepom, protresti, ukloniti čep i centrifugirati 2 minute.

Detritus se ukloni aplikatorom, smjesa supernatanta formalina i etera se odlije, sediment iz donjeg sloja uzme Pasteur-ovom pipetom i pregleda pod malim povećanjem mikroskopa. Kvantitativne metode za dijagnosticiranje helmintijaza koriste se kada je potrebno odrediti intenzitet invazije. Ove metode omogućuju procjenu učinkovitosti dehelmintizacije, procjenu učinka različitih anthelmintika, a također mogu poslužiti kao kontrola za tekuće masovno liječenje i preventivne mjere. Rad s izmetom u laboratoriju. Za istraživanje, izmet se uzima s različitih mjesta u dijelovima u staklene ili plastične posude, parafinske čaše, na koje se stavlja naljepnica s prezimenom, imenom, patronimom, dobi i adresom osobe koja se ispituje. Količina izmeta treba biti najmanje 1/4 šalice, jer... mali dijelovi izmeta brzo se suše i jaja u njima se deformiraju. Osim toga, možda će biti potrebno ponoviti studiju drugim metodama. Izmet za istraživanje treba dostaviti u laboratorij u roku od 1 dana. nakon defekacije, a kod pretrage na strongiloidijazu neposredno nakon defekacije.

Ako je potrebno materijal skladištiti duže vrijeme i za transport, tekućina Barbagallo (8,5 g kuhinjske soli i 30 ml formalina otopi se u 1000 ml vode) ili tekućina Shurenkova (1900 ml 0,2% vodene otopine natrijev nitrat, 250 ml jake Lugolove otopine, 300 ml nerazrijeđenog formalina, 25 ml glicerina); ili otopine praška za pranje rublja: 1% Lotus otopina ili 1,5% Extra otopina (u težinskom omjeru izmeta i otopine praška za pranje rublja 1:5). Nakon ispitivanja posuđe se dezinficira: kuha ili drži 5 sati u 5% otopini fenola, lizola, 2% otopine krezola. Prilikom registracije rezultata ispitivanja, nazivi helminta označavaju se prema suvremenoj nomenklaturi ( latinski naziv). Imunološke dijagnostičke metode su najučinkovitije za helmintijaze, čiji uzročnici žive izravno u tkivima ili migriraju kroz krvotok u ranoj fazi svog razvoja i unutarnji organi vlasnik.

Koristiti alergijske reakcije(kožni i intradermalni test) i imunološke reakcije: reakcija prstenaste precipitacije (RCR) za dijagnozu trihineloze; lateks aglutinacija (RLA) s dugotrajnim skladištenjem dijagnostikuma za dijagnozu ehinokokoze i alveokokoze; neizravna hemaglutinacija(RNGA) za dijagnostiku ehinokokoze, cerebralne cisticerkoze i preimaginalne faze ascariasisa; imunofluorescentna antitijela (RIFA) za dijagnostiku cisticerka i trihineloze; mikroprecipitacija na ličinkama (MPL) za dijagnostiku nematoda (preimaginalna faza ascariasis; ankilostomistoza, trihineloza); enzimska imunološka reakcija (IFR) za dijagnozu ehinokokoze, alveokokoze, opistorhijaze, trihineloze; reakcija vezanja komplementa (CFR) za dijagnozu trihineloze i cisticerkoze. Koriste se i reakcije imunoelektroforeze (RIEF) i dvostruke difuzije u gelu (DGD).

Bibliografija: Berezantsev Yu.A. i Avtušenko E.G. Helmintološka skatološka dijagnostika, L., 1976; Leikina E.S. Najvažnije helmintoze ljudi, str. 335, M., 1967; Objedinjene kliničke metode laboratorijska istraživanja, ur. V.V. Menshikova, sv. 4, str. 275, M., 1972.

Kada se otkriju jajašca helminta na različitim objektima okoliša (tlo, voda, povrće itd.), uvijek je potrebno utvrditi njihovu održivost izgledom, bojanjem vitalnim bojama, uzgojem u optimalnim uvjetima i provođenjem biološkog testa, tj.

Hranjenje laboratorijskih životinja.

Određivanje održivosti jaja ili ličinki helminta po izgledu. Jaja helminta se mikroskopiraju prvo pri malom, a zatim pri velikom povećanju. U deformiranim i mrtvim jajima helminta, ljuska je poderana ili savijena prema unutra, plazma je mutna i olabavljena. U segmentiranim jajima, kuglice za drobljenje (blastomere) su nejednake veličine, nepravilnog oblika i često pomaknute na jedan pol. Ponekad postoje abnormalna jaja koja se, unatoč vanjskim deformacijama, normalno razvijaju. Kod živih ličinki valjkastih crva fina zrnatost prisutna je samo u središnjem dijelu tijela, dok umiru zrnatost se širi po cijelom tijelu, a pojavljuju se velike sjajne hijaline vakuole - takozvane niske bisera.

Da bi se utvrdila održivost zrelih jajašaca okruglih crva, bičaša, pinworma, aktivni pokreti ličinki trebaju biti uzrokovani blagim zagrijavanjem lijeka (na temperaturu ne veću od 37 ° C). Pogodnije je promatrati vitalnost ličinki valjkastih glista i bičaša nakon što su izolirane iz ljuske jajeta pritiskom na pokrovno staklo preparata iglom za seciranje ili pincetom.

Kod ličinki invazivnih valjkastih glista često se vidi ljuštenje ovojnice na kraju glave, a kod ličinki bičaša koje su završile razvoj u jajetu, stilet se nalazi na tom mjestu pri velikom povećanju. U mrtvim ličinkama helminta, bez obzira na njihovu lokaciju (u jajetu ili izvan njega), primjećuje se propadanje tijela. U tom slučaju unutarnja struktura ličinke postaje blokovita ili zrnasta, a tijelo postaje mutno i neprozirno. Vakuole se nalaze u tijelu, a prijelomi se nalaze na kutikuli.

Sposobnost preživljavanja onkosfera taeniida (goveđa, svinjska trakavica, itd.) određena je kretanjem embrija kada su izloženi probavnim enzimima. Jaja se stavljaju na satno staklo sa želučanim sokom psa ili umjetnim duodenalnim sokom. Sastav potonjeg: pankreatin 0,5 g, natrijev bikarbonat 0,09 g, destilirana voda 5 ml. Satna stakla s jajima stavljaju se u termostat na 36-38 "C 4 sata. U isto vrijeme, živi embriji se oslobađaju svojih ljuski. I ljuske živih onkosfera otapaju se u zakiseljenom pepsinu i u alkalnoj otopini tripsina nakon 6-8 sati u termostatu na 38 °C.

Ako jaja taeniida stavite u 1% otopinu natrijevog sulfida, ili 20% otopinu natrijevog hipoklorida, ili u 1% otopinu klorirane vode na 36-38 °C, zreli i živi embriji se oslobađaju membrana i rade ne mijenja se unutar 1 dana. Nezrele i mrtve onkosfere se smanjuju ili bubre i naglo se povećavaju, a zatim se "otapaju" unutar 10 minuta - 2 sata. Živi embriji taeniida također se aktivno kreću u mješavini 1% otopine natrijevog klorida, 0,5% otopine natrijevog bikarbonata i žuči na 36-38. °C.

Preživljavanje skoleksa ehinokoka određuje se niskim zagrijavanjem. Da bi se to učinilo, skoleks ili rasplodne čahure oprane u vodi stave se u kap vode na predmetno staklo s rupom, pokriju pokrovnim stakalcem i pregledaju pod mikroskopom uz zagrijavanje na temperaturi od 38-39 °C. Ako nema grijaćeg stola, lijek se zagrijava pomoću bilo kojeg izvora topline. U isto vrijeme, održivi skoleks se aktivno kreće, skupljajući ili opuštajući sisaljke, produžujući i skraćujući proboscis. Ako postavite skoleks na 0,5-1% vodena otopina filicilena na sobnoj temperaturi, tada će svi živi skoleksi brzo ispasti i umrijeti. Skoleksi koji nisu održivi nisu evertirani.

Preživljavanje Adolescaria fascioli sakupljenih na biljkama i drugim objektima vodenih tijela provjerava se ispitivanjem na predmetnom stakalcu u fiziološkoj otopini pod mikroskopom s postoljem za zagrijavanje. Kada se ličinke trematoda zagriju, počinju se kretati.

Održivost jaja patuljaste trakavice određena je položajem kukica na embriju.

U živim jajima patuljaste trakavice dolazi do sporih klatnih pokreta protoplazme i gotovo neprimjetnog razmicanja i pomicanja šiljastih krajeva bočnog para kukica u stranu od srednjeg para.

Kontrakcije protoplazme embrija i embrionalne kuke pomažu embriju da se prvo oslobodi membrane onkosfere, a zatim i vanjske ljuske jajeta.

U živom jajetu, srednji par i bočni parovi kukica nalaze se paralelno; u nekim su jajima oštrice bočnih parova blizu jedna uz drugu i smještene pod kutom manjim od 45° u odnosu na srednji par kukica.

Umirući embrij grčevito se skuplja i tromo odvaja kukice. Kod mrtvog embrija, kretanje kukica se zaustavlja i one su smještene u neredu; ponekad su kukice bočno od susjednog para razmaknute pod pravim, tupim ili oštrim kutom.

Ponekad se opaža naboranje embrija i stvaranje granulacija. Točnija metoda temelji se na pojavi kretanja onkosfere tijekom oštre promjene temperature: od 5-10 do 38-40 ° C.

Određivanje održivosti nezrelih nematoda treba proučavati u vlažnoj komori (Petrijeve zdjelice), stavljajući jajašca glista u 3% otopinu formaldehida pripremljenu u izotoničnoj otopini natrijevog klorida na temperaturi od 24-30 °C, jajašca glista u 3 % otopine klorovodične kiseline na temperaturi od 30-35 °C, jaja pinworma u izotoničnoj otopini natrijeva klorida na temperaturi od 37 °C. Petrijeve zdjelice treba otvarati 1-3 puta tjedno radi boljeg prozračivanja, a filtar papir treba ponovno navlažiti čistom vodom.

Promatranja razvoja jaja helminta provode se najmanje 2 puta tjedno. Odsutnost znakova razvoja unutar 2-3 mjeseca ukazuje na njihovu nesposobnost za život. Znakovi razvoja jaja helminta su prve faze drobljenja, dijeljenje sadržaja jaja u zasebne blastomere. Tijekom prvog dana razvije se do 16 blastomera koji prelaze u drugi stadij - morula itd.

Jaja ankilostoma se uzgajaju u staklenom cilindru (50 cm visine i 7 cm u promjeru) zatvorenom čepom. Mješavina jednakih volumena sterilnog pijeska, drvenog ugljena i izmeta s jajima glista, razrijeđena vodom do polutekuće konzistencije, pažljivo se izlije na dno cilindra pomoću staklene cijevi. Tijekom 1-2 dana taloženja u mraku na temperaturi od 25-30 °C iz jaja se izlegu rabditiformne ličinke, koje nakon 5-7 dana postaju filariformne: ličinke pužu uz stijenke cilindra, gdje se nalaze vidljiv čak i golim okom. Jaja trematoda, kao što su opisthorchiids, diphyllobothriids, fasciolae i dr., koja se prirodno razvijaju u vodi, stave se na satno staklo, Petrijevu zdjelicu ili u drugu posudu, te se prelije malim slojem obične vode. Kod uzgoja jaja Fasciola treba voditi računa da se ona brže razvijaju u mraku, dok se miracidij stvara u živim jajima na temperaturi od 22-24 °C nakon 9-12 dana. Pri mikroskopiranju jajašaca trematoda u razvoju jasno su vidljivi pokreti miracidija. Miracidium fasciola izlazi iz ljuske jajeta samo na svjetlu. Tijekom uzgoja voda se mijenja nakon 2-3 dana.

Ličinke ankilostoma i strongiloida uzgajaju se na agaru u Petrijevoj zdjelici sa životinjskim ugljenom. Nakon što su 5-6 dana bile u termostatu na temperaturi od 26-30 °C, ličinke pužu po agaru ostavljajući za sobom stazu bakterija (Fullebornova metoda).

Metoda Harade i Morija (1955). Dodajte 7 ml destilirane vode u epruvete postavljene u stalak. Drvenim štapićem uzeti 0,5 g izmeta i napraviti razmaz na filtar papiru (15X150 mm) 5 cm od lijevog ruba (ovo se radi na listu papira radi zaštite površine laboratorijskog stola). Zatim se traka s razmazom umetne u epruvetu tako da lijevi kraj bez razmaza dospije do dna epruvete. Gornji kraj je prekriven komadom celofana i čvrsto omotan elastičnom trakom. Na epruvetu se upisuje broj i prezime osobe koja se ispituje. U tom stanju epruvete se čuvaju 8-10 dana na temperaturi od 28 °C. Za proučavanje kulture uklonite celofanski poklopac i pincetom uklonite traku filter papira. Pri tome treba biti oprezan jer se mali broj infektivnih ličinki može pomaknuti na gornji kraj filter papira ili na stranu cijevi i prodrijeti ispod površine celofana.

Epruvete se stave u vruću vodenu kupelj na temperaturi od 50 °C na 15 minuta, nakon čega se njihov sadržaj protrese i brzo izlije u epruvetu od 15 ml da se ličinke talože. Nakon centrifugiranja, supernatant se ukloni, a sediment prenese na predmetno stakalce, prekrije pokrovnim stakalcem i ispita mikroskopski pod malim povećanjem.

Za diferencijalnu dijagnozu filariformnih ličinki potrebno je koristiti podatke prikazane u tablici. 13.

Metode bojenja jaja i ličinki helminta. Mrtva tkiva u većini slučajeva percipiraju boje brže od živih. Ove se značajke koriste u helmintologiji za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta. Međutim, u nekim slučajevima, neke boje bolje percipiraju živa tkiva nego mrtva.

Tablica 13. Diferencijalna dijagnoza filarolikih ličinki A. duodenale, N. americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Za diferencijalno prepoznavanje živih i mrtvih jaja i ličinki koriste se sljedeće boje i metode.

Leukobaza metilensko plavo se koristi za bojenje živih i mrtvih tkiva. Živa stanica ili tkivo reducira metilensko modrilo u bezbojnu leukobazu, mrtvo tkivo nema tu sposobnost pa dobiva boju.

Za bojanje jaja okruglih crva možete koristiti metilensko plavo u otopini mliječne kiseline s kaustičnim alkalijama (0,05 g metilenskog plavog, 0,5 g natrijevog hidroksida, 15 ml mliječne kiseline). Živa jaja ne percipiraju boju; embriji mrtvih jaja postaju plavi.

Metoda bojenja nije primjenjiva na nezrela jaja valjkastih glista i bičaša; pigmentirana ljuska je obojena, pa se stoga ne vidi da li je spolna stanica unutar jajeta obojena.

Bojanje ličinki glista baznom otopinom briljantkrezil plave boje u koncentraciji 1:10 000 provodi se na sljedeći način: na predmetno staklo se nanese kap tekućine s jajima glista i kap osnovne otopine boje. Preparat se prekrije pokrovnim stakalcem koje se uz lagano lupkanje disekcijskom iglom čvrsto pritisne na preparat. Broj izniklih ličinki i stupanj njihove obojenosti promatra se pod mikroskopom, nakon čega se nakon 2-3 sata ponovo pregleda isti preparat.Živima se smatraju samo nedeformirane ličinke koje nisu obojane 2 sata.Uginule ličinke se boje kada ljuska pukne (djelomično ili potpuno).

Mogućnost bojenja pripravaka otopinom joda naznačena je pri određivanju održivosti jajašaca ptičjih glista. U ovom slučaju, 5% se koristi kao boja. otopina alkohola Yoda. Kada se nanese na pripravak, embriji mrtvih jaja Ascaridia postaju narančasti unutar 1-3 s. Mrtva jaja opistorhisa i onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom toluidin modrila (1:1000), a mrtve onkosfere goveđe trakavice boje se otopinom briljantnog krezil modrila (1:10 000). U isto vrijeme zameci i ljuske i mrtvih i živih jaja dobivaju boju. Stoga se nakon bojenja jajašca i onkosfere isperu u čistoj vodi i dodatno boje safraninom (razrijeđen 1:10 000 u 10% alkoholnoj otopini). Alkohol skida boju s ljuski, a safranin im daje crvenu boju. Zbog toga živa jaja postaju crvena, embrij mrtvih postaje plav, a ljuska ostaje crvena. Uginuli embriji onkosfera goveđe trakavice brzo se, u roku od nekoliko minuta, boje jarko crveno ili ružičasto safraninom ili plavo briljantnim krezil plavim u razrjeđenju 1:4000 ili indigokarminom u razrjeđenju 1:1000-1:2000.

Živi embriji ne mijenjaju se pod utjecajem ovih boja ni nakon 2-7 sati.

Da bi se odredila održivost jaja patuljaste trakavice, preporuča se korištenje sljedećih boja: 1) briljantno krezilno plavo (1: 8000) - nakon 1 sata onkosfera mrtvih jajašaca postaje posebno svijetlo obojena, što se oštro ističe na blijedoj boji. ili bezbojna pozadina ostatka jajeta; 2) safranin: razrijeđen 1:8000 uz izlaganje 2 sata i 1:5000 3-5 sati; 3) 50% otopina pirogalne kiseline u razrjeđenju 1:2 - kada je izložena 1 sat na temperaturi od 29-30 “C (što je niža temperatura, to je duži proces bojenja).

Živi plerocerkoidi trakavice vrlo se dobro boje vodenom otopinom (1:1000) neutralrota 5-20 minuta. Za postizanje postojane ružičaste boje koja ne nestaje unutar 5 dana i ne utječe na pokretljivost plerocerkoida obično je dovoljno 10 minuta. Stupanj obojenosti kontrolira se promatranjem ličinki u čistoj izotoničnoj otopini natrijevog klorida, u tu svrhu se plerocerkoidi povremeno uklanjaju iz boje. Preporučljivo je koristiti metilensko modrilo za bojenje mrtvih plerocerkoida.

R. E. Chobanov i suradnici (1986.) predložili su metodu za određivanje održivosti jaja i ličinki helminta korištenjem "rubrin" pigmenta, dobivenog uzgojem plijesni Penicilium rubrum, kao boje. Da biste to učinili, upotrijebite 3% vodenu otopinu boje.

Proces bojenja jaja i ličinki je završen nakon 1,5 h.Neživa jaja pinworma, goveđe i patuljaste trakavice, ankilostoma, trihostrongilida poprimaju intenzivno ružičastu boju, a ličinke ankilostoma i trihostrongilida postaju crvene. Manje svijetla boja uočena je u jajima valjkastih crva i bičaša, budući da, kada se oslobode iz crijeva, već imaju tamnosmeđu boju: održiva jaja i ličinke nisu obojeni.

Fizikalno-kemijske metode za poticanje oslobađanja mirakulida iz jaja trematoda. Metode su razvili S.M. German i S.A. Beer (1984.) za određivanje održivosti jajašaca opisthorhida i dikrocelija izlaganjem jajašaca reakcijskom mediju. Ako su živi, ​​miracidij se oslobađa. Metode se temelje na fizikalno-kemijskoj aktivaciji miracidijeve žlijezde za izleganje i stimulaciji motoričke aktivnosti ličinke. Stimulacija se postiže izlaganjem jaja trematoda posebnom reakcijskom mediju u kombinaciji sa sekvencijalnim tehnikama - stvaranjem temperaturne razlike, sušenjem suspenzije jaja, izlaganjem slabom protoku tekućine u testnoj kapi, što doprinosi masovnom oslobađanju miracidija iz jaja.

Određivanje održivosti jajašaca opisthorhida metodom Hermana i Beera. Suspenzija jaja u vodi (vodovodnoj, taloženoj) prethodno se ohladi na 10-12 °C. Sve naredne radnje izvode se na sobnoj temperaturi (18-22 °C). U epruvetu centrifuge doda se jedna kap (oko 0,05 ml) suspenzije koja sadrži 100-400 jaja. Epruvete se stave u stalak na 5-10 minuta da se jaja talože. Zatim upotrijebite usku traku filtar papira kako biste pažljivo usisavali višak vode dok se potpuno ne ukloni. Dodajte 2 kapi medija u epruvetu, protresite, prenesite sadržaj pipetom na predmetno staklo i ostavite 5-10 minuta, lagano protresite (ili stavite pod sušilo za kosu) kako biste stvorili slaba strujanja tekućine u ispitnoj kapi suspenzije . Ova operacija, koja oponaša peristaltiku crijeva mekušaca, omogućuje aktiviranje oslobađanja miracidija. Nakon toga se u suspenziju dodaju još 2 kapi medija i zatim se preparat mikroskopira konvencionalnim svjetlosnim mikroskopom (X200). Tijekom tog vremena, poklopac jaja s održivim miracidijem trebao bi se otvoriti, a ličinka aktivno izlazi u okoliš. Zahvaljujući prisutnosti etanola u njemu, miracidij se imobilizira nakon 3-5 minuta, a zatim se boji bojom koja se nalazi u mediju. Kao rezultat toga, miracidije se lako otkrivaju i broje.

Priprema reakcijskog medija. Medij se priprema u 0,05 M Tris-HCi puferu pri optimalnim pH uvjetima od 8,0-9,5. Etanol do 10-13% i bojilo (safranin, metilensko modrilo i drugi koji djeluju unutar pH raspona) dodaju se u pufer dok se tekućina blago ne oboji (na primjer, za safranin njegova konačna koncentracija bit će 1:50 000). Možete koristiti drugi pufer koji radi u alkalnim pH granicama, na primjer 0,05 M fosfata (pH 8,5). Dakle, medij sadrži 96% etanola - 12 dijelova; boja (matična otopina) - 1-10 dijelova; 0,05 M Tris-NS! pufer (pH 8,5-9,5) - do 100 dijelova. Primjer medija: 12 dijelova 96% etanola, 1 dio zasićene otopine safranina, ostatak do 100 dijelova - 0,05 M Tris-HCl pufer, pH 9,5.

Određivanje održivosti jaja dikrocelija metodom Herman, Beer, Stratan. Kap suspenzije koja sadrži 100-150 jaja trematoda stavi se u epruvetu centrifuge na 1-2 minute da se jajašca talože. Tekućina se zatim pažljivo osuši pomoću trake filter papira. Dodajte 1-2 kapi reakcijskog medija pomoću Pasteurove pipete i inkubirajte u vodenoj kupelji na 28-30 °C 2-3 minute. Sastav medija: 6 dijelova butanola, 94 dijela 0,4% otopine natrijevog klorida ili 0,3% otopine kalijevog klorida u destiliranoj vodi. Jaja u mediju se pipetom prenesu na predmetno staklo i ostave 1,5-2 sata na sobnoj temperaturi (18-22 °C), uz dodavanje 1-2 kapi (0,05) svakih 25-30 minuta (kako se suše ). ml) otopine butanola u destiliranoj vodi. Nakon toga preparat se pregleda pod mikroskopom pri povećanju od 100-200x. Preživljavanje se određuje brojem otvorenih jaja s oslobođenim miracidijama. Butanol prodire kroz pore ljuske jajeta, dolazi do miracidija i aktivira ih. Inkubacija na navedenoj temperaturi pospješuje ovaj proces. Butanol u koncentraciji od 3-7% je štetan za miracidij koji izlazi iz jaja. Prijenos suspenzije jajašaca iz epruvete na predmetno staklo omogućuje da se do trenutka otpuštanja miracidija (nakon 30-40 minuta) koncentracija butanola zbog isparavanja smanji na sigurnu razinu (1,5-0,5%). Prisutnost natrijevog klorida u mediju u koncentraciji od 0,1-0,5% (ili kalijevog klorida u koncentraciji od 0,05-0,4%) određuje aktivnost oslobođenog miracidija. Za razliku od malih prozirnih jaja opistorha, jaja dikrocelija imaju ljusku tamne boje, imaju jasno vidljivu kapicu koja se otvara nakon izlaska miracidija. Stoga je prikladnije procijeniti održivost jaja dikrocelija brojanjem otvorenih jajašaca nego bojanjem i brojanjem miracidija.

Luminescentna metoda za proučavanje jaja i ličinki helminta.

Po prvi put u helmintološkoj praksi metode fluorescentne mikroskopije korištene su 1955. godine. Objavljeno je da fluorescentna mikroskopija omogućuje razlikovanje živih i mrtvih objekata bez oštećenja jajeta. Za fluorescenciju nisu korištene UV zrake, već plavo-ljubičasti dio vidljive svjetlosti, s konvencionalnim mikroskopom i stakalcima; Za iluminator OI-18 korišten je poseban set filtara u boji.

Utvrđeno je da živa i mrtva jajašca valjkastih glista, pinworma, patuljaste trakavice, goveđe trakavice, široke trakavice i drugih helminta različito fluoresciraju. Ovaj fenomen se opaža i tijekom primarne luminiscencije bez upotrebe boja, i kada se boje fluorokromima (akridin narančasta, korifosfin, primulin, aurolin, berlerin sulfat, tripaflavin, rivanol, kinin itd.).

Nebojana, živa, nesegmentirana jaja valjkastih crva svijetle svijetlo zeleno sa žućkastom nijansom; u mrtvim jajima, ljuska emitira zeleno svjetlo puno jače od tamnozelene embrionalne ljuske; U jajima valjkastih glista s ličinkom pojavljuje se samo ljuska, a u mrtvim jajima i ljuska i ličinka svijetlo su žute boje.

Nepigmentirana i nesegmentirana živa jaja pinworma i patuljaste trakavice emitiraju zelenkasto-žuto svjetlo; U mrtvim jajima ljuska intenzivno svijetli na pozadini tamnozelene embrionalne mase. Uz sekundarnu luminescenciju (kada se boji akridin narančastom u razrjeđenju 1:10 000 i 1:50 000 od 30 minuta do 2 sata), ljuska živih i mrtvih nematoda, trematoda i cestoda različito svijetli.

Ljuska živih i mrtvih Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum obojena je narančasto-crvenom bojom. Embriji živih Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum i onkosfere goveđe trakavice fluoresciraju mutno tamnozelenom ili sivozelenom bojom. Mrtvi embriji ovih jajašaca helminta emitiraju "goruće" narančasto-crveno svjetlo. Žive ličinke pinworma i toxocara (oslobođene ljuske jajeta) emitiraju prigušeno sivo-zeleno svjetlo; kada umru, boja se mijenja od vrha glave do "goruće" svijetlozelene, zatim žute, narančaste i na kraju svijetlo narančaste.

Obojana fluorokromima - korifosfilusom, primulinom - mrtva jaja valjkastih glista i bičaša pokazuju sjaj od lila-žute do bakreno-crvene. Jaja sposobna za život ne svijetle, već su obojena u tamnozelenu boju. Živa jajašca trematoda Paragonimus westermani i Clonorchis sinensis ne svijetle kada se boje akridin narančastom, ali mrtva jaja emitiraju žućkasto-zelenu svjetlost.

Metoda luminiscencije također se može koristiti za određivanje održivosti ličinki helminta. Dakle, ličinke strongylata i rhabditatusa fluorokromirane otopinom akridin narančaste (1: 2000) svijetle: žive - zelene (s nijansom), mrtve - jarko narančastom svjetlošću. Žive ličinke trihinele ne svijetle ili daju slab sjaj kada se 10 minuta tretiraju otopinama fluorescein izotiocijanata, auramina itd. Fluorokromirane mrtve ličinke (u koncentraciji 1:5000) daju jarko sjaj.

Žive miracidije koje izlaze iz ljuske emitiraju prigušeno plavkasto svjetlo s jedva primjetnim svijetložutim vjenčićem cilija, ali 10-15 minuta nakon smrti pojavljuju se sa jarkim "gorućim" svjetlozelenim, a zatim narančasto-crvenim svjetlom.

Prije provođenja liječenja i preventivnih mjera za pojedine helmintoze poljoprivrednih i komercijalnih životinja, potrebno je pravovremeno postaviti točnu dijagnozu bolesti. Postoje dvije skupine metoda za dijagnosticiranje helmintijaze - intravitalne i postmortalne. Osim toga, potrebno je znati razlikovati helmintoze od drugih invazivnih i zaraznih bolesti.

Intravitalna dijagnostika helmintijaza

Na temelju rezultata postavlja se dijagnoza helmintijaza tijekom života životinja laboratorijske metode istraživačka i dijagnostička dehelmintizacija (izravne metode), kao i imunobiološke reakcije (neizravne metode). Pomoćnu ulogu u dijagnozi helmintijaza igraju podaci iz studija posrednih domaćina (za biohelmintiju), klinička i epizootološka opažanja. Glavne dijagnostičke metode su laboratorijske pretrage koje često omogućuju otkrivanje uzročnika helmintijaze ili njihovih jaja i ličinki u izlučevinama (feces, urin, sputum), sekretima (žuč), tkivima (krv, mišići), organima (komadići kože), u sadržaj punktata i apscesa .

Laboratorijske metode za dijagnosticiranje infekcija helmintima kod životinja su jednostavne za izvođenje i prilično točne, pa se široko koriste u uvjeti proizvodnje(u veterinarskim laboratorijima i drugim veterinarskim ustanovama). Ovisno o namjeni, laboratorijska istraživanja dijele se na helmintooskopske, helmintolarvoskopske i helmintoskopske metode istraživanja.

Helmintolarvoskopske metode istraživanje se koristi za otkrivanje ličinki helminta (dictyocaulus, mulleria, itd.). Iz ove skupine često se koristi proučavanje izmeta metodama Berman-Orlov i Vaid.

Helmintoskopski ili makrohelmintoskopski studije se koriste u dijagnostičke svrhe za otkrivanje helminta ili njihovih fragmenata (segmenata gnijezda) puštenih van. U praktične uvjete Ovom metodom postavlja se dijagnoza ascariasis u svinja, drepanidoteniasis u gusaka i drugih helmintijaza.

Od laboratorijskih metoda za dijagnosticiranje helmintijaza kod životinja najviše praktični značaj imati: a) helmintokoprološke studije (pregled izmeta); b) proučavanje sekreta iz drugih organa; c) pregled tkiva.

Helmintokoprološke studije

Za iste svrhe predložen je poseban uređaj koji se sastoji od čeličnih čeljusti, prijelaznih grana i dvije polukuglaste površine pričvršćene na grane. Uzimanje fecesa iz rektuma životinja ovim uređajem olakšava rad veterinarskih djelatnika i poboljšava proizvodni standard ove manipulacije.

Kod kunića se izmet u količini od nekoliko kuglica odstranjuje pritiskom na trbušnu stijenku u rektalnom području. Ponekad je prihvatljivo uzeti uzorke izmeta s poda ako su svježi i znate od koje su životinje. Od jedne životinje uzima se najmanje 10-20 g izmeta. Od ptica, krznašica, pasa, mačaka i divljih grabežljivaca (u zoološkim vrtovima) izmet se prikuplja s čistog poda kaveza (skupni uzorci).

Svi uzorci izmeta su označeni: uz rub vrećice ili lista papira (gdje neće doći u dodir s izmetom) olovkom je napisan broj uzorka (ponekad i ime krave). Uz uzorke izmeta prilaže se popis u kojem se navodi naziv farme, tim, vrsta, spol i dob životinja (za odrasle - ime ili inventarni broj) te datum uzorkovanja. Preporučljivo je u popratnom dokumentu navesti svrhu fekalnog istraživanja (na primjer, za praćenje izvršene dehelmintizacije). Potrebno je nastojati brzo dostaviti uzorke izmeta u veterinarski laboratorij i pregledati ih bez odlaganja, jer na sobnoj temperaturi, nakon 16-20 sati, iz jajašca crijevnih jaknica izlaze ličinke, što otežava dijagnostiku diktiokauloze i protostrongilidoze, tj. kao i druge infekcije helmintima.

Ako se uzorci izmeta ne pregledaju na dan uzimanja, stavljaju se u hladnjak ili podrum na temperaturu ne veću od 10°. Sredstva za dezinfekciju nemojte zaustaviti razvoj ličinki unutar jaja helminta. Rezultati fekalnog pregleda bilježe se u posebnom dnevniku.

Oprema za helmintokoprološka istraživanja. Pouzdanost helminto-koproloških studija uvelike ovisi o kvaliteti laboratorijske opreme. Godine 1968. u Ukrajini je razvijen skup standardne opreme za masovno testiranje izmeta na infekcije helmintima. Sastoji se od predmeta izrađenih prvenstveno od stiropora otpornog na udarce u dvije boje, koji se lako peru i neutraliziraju (podnose iskuhavanje), a također su praktični za transport. Set uključuje šalice raznih kapaciteta, lijevci, stožaste epruvete, cjedila različitih veličina, stalak s pet letvica (svaka za šest lijevaka), kivete (prema veličini stalka), kutije za odlaganje posuđa, kao i gumene žarulje, staklene i metalne šipke. petlje (slika 1).

Za razliku od prethodno korištene heterogene opreme, novi set povećava učinkovitost laboratorijskih ispitivanja izmeta i produktivnost rada veterinarskih radnika, omogućuje širi raspon kvantitativnih helminto-koproloških studija korištenjem standardiziranih metoda (kontrola dehelmintizacije), a također poboljšava estetska strana ovaj posao.

Postoje kvalitetni i kvantitativne metode fekalne studije.

Kvalitativne helmintokoprološke studije

Kvalitativne metode istraživanja omogućuju određivanje kojim su helmintima životinje zaražene.

Helmintoovoskopske metode. Za intravitalnu dijagnozu helmintičkih infekcija predložen je veliki broj metoda helminto-ovoskopije, od kojih ćemo razmotriti samo one koje se češće koriste u veterinarskoj praksi.

Većina helmintokoproloških dijagnostičkih metoda temelji se na razlici u specifičnoj težini jaja, ličinki helminta ili njihovih fragmenata, s jedne strane, i tekućine u kojoj je suspendiran izmet koji se proučava, s druge strane. Ovisno o omjeru specifične težine ovih komponenti, razlikuju se metode flotacije, sedimentacije i kombinirane metode.

Metode flotacije. Kod flotacijskih (plutajućih) metoda koriste se tekućine (zasićene otopine soli) čija je specifična težina veća od težine jaja helminta. U laboratorijskoj praksi najraširenija otopina je zasićena otopina kuhinjske soli (specifične težine 1,18). Za pripremu takve otopine, natrijev klorid se postupno dodaje u posudu s kipućom vodom uz miješanje dok se na dnu ne stvori mali talog (oko 400 g kuhinjske soli na 1 litru vode). Vruća otopina se filtrira u bocu kroz nekoliko slojeva gaze ili vate i koristi se nakon hlađenja (na dnu boce trebao bi se stvoriti kristalni talog).

Rjeđe, veterinarski laboratoriji koriste zasićene otopine magnezijevog sulfata specifične težine 1,35 (920 g na 1 l Vruća voda), natrijev hiposulfit specifične težine od 1,37 do 1,41, ovisno o temperaturi okoliš(1750 g na 1 litru tople vode) i natrijev nitrat specifične težine 1,4 (omjer nitrata i tople vode 1:1).

Fullebornova metoda karakterizira jednostavnost provedbe i visoka efikasnost za većinu nematoda i cestodijaza životinja, stoga je na prvom mjestu među ostalim helmintokoprološkim dijagnostičkim metodama. U staklenu, polistirensku ili plastičnu čašu zapremine 50-100 ml stavite 3-5 g fecesa i uz miješanje staklenim štapićem postupno dodajte zasićenu otopinu kuhinjske soli (natrijevog klorida) brzinom od 15 20 dijelova flotacijske tekućine na jedan dio izmeta. Gusti ovčji izmet može se najprije samljeti mala količina otopine soli u porculanskom tarioniku, nakon čega se suspenzija izlije u čašu, dodajući potreban iznos otopina natrijeva klorida. Velike čestice koje isplivaju odmah se uklanjaju štapićem, a preporučljivo je fekalnu suspenziju filtrirati u drugu čašu kroz sito (ponekad se koriste cjedila za mlijeko). Nakon taloženja napunjenog uzorka tijekom 45-60 minuta, tri kapi površinskog filma se uklone metalnom omčom, stave na predmetno stakalce i pregledaju mikroskopski bez pokrovnog stakla. Nakon svakog testa petlje se isperu u čaši vode (umjesto spaljivanja u alkoholnoj lampi kako se preporučuje u nekim priručnicima).

Kalantaryan metoda- modificirana Fullebornova metoda. Kao tekućina za flotaciju koristi se zasićena otopina natrijeva nitrata. Vrijeme taloženja suspenzije je 15-30 minuta. Koristi se za dijagnozu akantocefaloze.

Metode taloženja. Metode sedimentacije koriste tekućine s manjom specifičnom težinom od specifične težine jaja.

Metoda sekvencijalnog pranja. Mala količina fecesa (5 g) razmuti se u čaši s 10 puta većom količinom vode. Smjesa se filtrira u veliku čašu i doda se voda, nakon čega se filtrat ostavi stajati 5 minuta. Zatim se gornji sloj tekućine isuši ili usisava štrcaljkom dok se ne stvori talog; talogu dodati istu količinu vode, promiješati i ponovno ostaviti 5 minuta. Ove se manipulacije ponavljaju sve dok se gornji sloj tekućine u staklu ne razbistri. Tekućina se posljednji put ocijedi, a talog se nanese na staklo ili u bakteriološku posudu i pregleda pod mikroskopom. Ova metoda se često koristi za dijagnosticiranje većine trematoda i akantocefaloze.

Gorškova metoda temelji se na principu sedimentacije praćene koncentracijom jajašaca helminta. 150-300 g konjskog izmeta stavi se na metalno sito ili gazu u veliki stakleni lijevak promjera na vrhu 15-20 cm, na koji se stavi gumena cijev duljine 10-15 cm sa stezaljkom na kraju. donji kraj lijevka. Izmet se olabavi i izlije do vrha Topla voda. Izmet se drži u lijevku od 4 sata do jednog dana, nakon čega se stezaljka pažljivo otvori, dio tekućine pusti u epruvete za centrifugiranje i centrifugira 3 minute. Zatim se tekućina iscijedi, a sediment pregleda pod mikroskopom. Ova metoda se koristi za dijagnosticiranje drageioze i habronematoze u konja.

Kombinirane metode. Temelje se na principu sedimentacije i flotacije jaja helminta, stoga su učinkovitiji u usporedbi s prethodnim metodama istraživanja. Zbog svoje složenosti, ove metode imaju relativno ograničenu primjenu u industrijskim okruženjima.

Draga metoda. Mala količina fecesa (3-5 g) promiješa se u čaši s 20-30 ml vode, smjesa se filtrira u epruvete za centrifugiranje i centrifugira 1-2 minute, nakon čega se gornji sloj tekućine iscijedi i u talog se doda mješavina jednakih dijelova glicerina i kuhinjske soli. Smjesa u epruvetama se protrese i drugi put centrifugira. Jajašca koja isplivaju na površinu uklanjaju se zajedno s filmom suspenzije pomoću žičane omče, istresaju na stakalce i ispituju pod mikroskopom. U nedostatku glicerina, izmet se može pomiješati sa zasićenom otopinom natrijeva klorida prije sekundarnog centrifugiranja.

Shcherbovicheva metoda. Tehnika ispitivanja izmeta slična je prethodnoj metodi. Od nje se razlikuje po tome što se prije sekundarnog centrifugiranja talogu dodaje zasićena otopina natrijevog hiposulfita (za makrakantorinhozu svinja) ili magnezijev sulfat(). U usporedbi s metodom Darling, ova metoda je učinkovitija.

Flotacijsko-sedimentacijska metoda Demidova preporučuje se za dijagnostiku fascioliaze, kao i drugih trematoda preživača. Uzorak izmeta (3 g od ovaca i 5 g od goveda goveda) stavi se u čašu zapremine 200 ml i u nju se do vrha ulije zasićena otopina kuhinjske soli i dobro promiješa staklenim štapićem, nakon čega se suspenzija ostavi da odstoji 15-20 minuta. Grube čestice koje isplivaju na površinu uklanjaju se papirnatom lopaticom, a tekućina iz supernatanta se usisava štrcaljkom (prilikom pregleda velika količina tekućina uzorka može se ocijediti), ostavljajući 20-30 ml sedimenta na dnu. Dodajte vodu u talog do pune zapremine čaše i dobro promiješajte. Smjesa se filtrira u običnu čašu kroz gazu ili metalno sito i ostavi 5 minuta. Tekućina iz supernatanta se odsisa, a na dnu ostane 15-20 ml taloga, koji se prenese u stožastu čašu, ispere u običnu čašu i ulije u malu. Suspenzija se ostavi 3-5 minuta da se taloži u konusnoj posudi, a tekućina se naknadno odsisa (ovaj postupak se ponavlja). Očišćeni sediment prenese se na predmetno staklo i pregleda pod mikroskopom. Ova metoda učinkovitiji od metode sekvencijalno pranje.

Helmintolarvoskopske metode. Berman-Orlov metoda. Za pregled fecesa koristite aparat koji se sastoji od srednjeg lijevka (plastičnog, polistirenskog ili staklenog), gumene cijevi (dužine 10-15 cm) spojene na gornjem kraju na lijevak, stezaljke pričvršćene na donji kraj gumene cijevi. , metalno sito ili komad gaze i tronožac (za jedan ili više uređaja). Montirani aparat se napuni toplom vodom (35-38°). 10-15 g svježeg izmeta stavi se na sito ili umota u gazu i pažljivo spusti u lijevak. Izmet ovaca drži se u aparatu 2-4 sata, a teladi najmanje 6-7 sati. Zatim se stezaljka na epruveti olabavi, a tekuća tekućina se skupi u epruvetu i centrifugira 2-3 minute. Nakon toga se gornji sloj tekućine iscijedi brzim okretanjem epruvete, a tekućina koja ostane na dnu se prenese na predmetno stakalce i pregleda pod mikroskopom. Upotreba stezaljki na gumenoj cijevi u Baermannovom aparatu povezana je s neugodnostima, stoga su u mnogim veterinarskim laboratorijima donji krajevi gumenih cijevi izravno povezani s malim epruvetama. Prije pregleda sedimenta pod mikroskopom, tekućina se ne centrifugira.

Izmet preživača može se pregledati na plućne nematode (osobito u ekspedicijskim uvjetima) pojednostavljenom metodom larvoskopije helminta (bez upotrebe lijevka). U tu svrhu koriste se male polukonusne šalice (50 ml). Uzorci izmeta stavljaju se u cjedila ili se umotaju u gazu i stavljaju u čaše s vodom. Nakon nekoliko sati izmet se odstrani, tekućina iz čašice se isiše ili ocijedi, a talog se pregleda pod mikroskopom.

Vaidova metoda. Nekoliko kuglica izmeta malih preživača stavi se u bakteriološku posudu ili na satno staklo i navlaži malom količinom Topla voda. Nakon 10-20 minuta uklanja se izmet, a preostala tekućina se pregledava pod mikroskopom s malim povećanjem. Učinkovitost ove metode znatno je manja u odnosu na prethodnu, pa se rjeđe koristi za dijagnosticiranje diktiokauloze i protostrongilidoze ovaca.

Metoda diferencijalne dijagnoze strongilatoze na temelju infektivnih ličinki. Uzročnici većine crijevnih strongilatoza imaju gotovo istu strukturu jaja, stoga se s helmintoovoskopijom može postaviti samo grupna dijagnoza (na primjer, strongilatoza).

Za uspostavljanje više točna dijagnoza(generički) veterinarski laboratoriji ponekad dobiju kulturu invazivnih ličinki strongilata. Oko 5 g izmeta stavi se u bakteriološku posudu, zatvori poklopcem i stavi u termostat na temperaturu od 25-30° tjedan dana. Zatim se izmet s ličinkama ispituje metodom Berman-Orlov (za izolaciju infektivnih ličinki iz izmeta).

Infektivne ličinke različitih rodova intestinalnog strongilata razlikuju se po veličini tijela, građi kaudalnog kraja klobuka i po broju crijevnih stanica. Na primjer, ličinke esophagostoma su veće (do 1 mm duljine), končasti repni kraj kapice je dugačak, a crijevo ima 20-32 stanice; Ličinke hemoncha su srednje duljine (oko 0,8 mm), s končastim repnim krajem kapice, crijevo ima 16 stanica.

Periodično pranje i taloženje izmeta se ponavlja sve dok se gornji sloj ne očisti. Gornji sloj tekućine se posljednji put iscijedi, a sediment se ispituje u malim obrocima u kivetama s crno-bijelim dnom. Otkriveni helminti se skupljaju pomoću pinceta, igala za seciranje i četkica, ispituju se pod mikroskopom, a zatim prenose u tekućinu za konzerviranje. Da bi se identificirale male nematode, sediment se dalje ispituje u dijelovima pomoću dalekozora ili tronošnog povećala s povećanjem od 10-20x.

Kvantitativne helminto-koprološke studije

Standardizirana Fullebornova metoda manje precizna u usporedbi sa Stoll metodom, ali zbog jednostavnosti primjene ima široku primjenu u veterinarskoj praksi za praćenje učinkovitosti dehelmintizacije životinja. Što se tiče tehnike, standardizirana metoda nalikuje drugim metodama kvalitativnih helminto-ovoskopskih studija. Međutim, ima niz značajki, od kojih su glavne sljedeće: 1) količina izmeta mora biti jednaka; 2) posude istog volumena; 3) vrijeme taloženja vodene suspenzije izmeta je isto; 4) petlje istog promjera, proučavanje jednakog broja kapi.

Za aproksimaciju intenziteta invazije diktiokauloze i progostrongilidoze u preživača može se koristiti standardizirana Berman-Orlov metoda. Pouzdanost rezultata raste s povećanjem broja i učestalosti istraživanja.

Proučavanje sekreta iz drugih organa

Pregledom sadržaja konjunktivalnih šupljina dijagnosticira se telazioza goveda (uzročnik: Thelazia rhodesi). Koristeći špricu, konjunktivne šupljine se navodnjavaju vodenom otopinom joda; tekućina koja curi skuplja se u kivetu ili bubrežasti bazen i pregledava na prisutnost tetelija. U ovom slučaju, vodena otopina joda također ima ljekoviti učinak.

Proučavanje iscjetka iz kloake provodi se za intravitalnu dijagnozu. Sluz koja curi stavlja se na predmetno staklo i ispituje pod mikroskopom kako bi se otkrila jaja uzročnika.

Ispitivanje strugotina s perianalnih nabora glavna je dijagnostička metoda. Štapićem u obliku lopatice ili šibicom navlaženom mješavinom jednakih dijelova glicerina i vode napravi se struganje perianalnih nabora perineuma i unutarnje površine korijena repa. Struganje se prenese na stakalce u kapi glicerola i vode, pokrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom. Detekcija oksiurnih jaja potvrđuje kliničku dijagnozu.

Za dijagnosticiranje kožnog oblika dašeioze i habronematoze preporuča se pregled strugotina kože s "ljetnih ulkusa". Sa svježe ulcerirane površine kože uzima se struganje koje se stavlja u kap razrijeđene klorovodične kiseline (1:1000). Preparat se zatim razdvoji iglama za seciranje, prekrije pokrovnim stakalcem i pregleda pod mikroskopom kako bi se otkrile ličinke drashi ili gabronema.

Istraživanje tkiva

Pregled kože goveda (po Gnedinoj) koristi se za dijagnosticiranje onhocerkoze. Na dnu trbušni zid Nakon pripreme kirurškog polja, iz životinje se izreže mali komad kože debljine 2 mm (veličine malog zrna zobi), a rana se podmaže tinkturom joda. U veterinarskom laboratoriju, ovaj komad kože stavlja se na predmetno staklo fiziološka otopina, razdvojiti iglama za seciranje, a zatim se sve izlije u epruvetu za centrifugu i stavi u termostat nekoliko sati na temperaturu od 37-38°. Zatim se uklone vlakna kože, tekućina se centrifugira, a sediment mikroskopski pregleda kako bi se otkrili pokretni mikroonkocerci.

Ispitivanje dijelova mišićačesto se izvode posthumno. Ponekad se za intravitalnu dijagnozu trihineloze koristi metoda biopsije. Po kirurška intervencija izreže se komad mišića (na primjer, iz vanjskih mišića uha), od kojeg se pripreme mali dijelovi (otprilike veličine zrna zobi). Potonji se postavljaju na donje staklo kompresora, pokrivaju gornjim staklom i spajaju vijcima dok se potpuno ne spljošte. Presjeci se gledaju pod trihineloskopom, mikroskopom s malim povećanjem, pomoću projekcijskog trihineloskopa ili KT-3 projekcijske kamere.

Dijagnostička dehelmintizacija

Za dijagnostičku dehelmintizaciju odabire se nekoliko životinja, izolira se od ostatka stoke i daje im se antihelmintik u terapijskoj dozi. Izmet izlučen iz ovih životinja unutar jednog do dva dana prikuplja se i podvrgava helmintoskopiji radi otkrivanja uzročnika bolesti. U proizvodnim uvjetima često se provode dijagnostičke dehelmintizacije za intravitalnu dijagnostiku monijezioze u preživača, drepanidotenijaze u gusaka, cestodoze u mesoždera, ascariasis u svinja i ascariasis u kokoši.

Imunološke reakcije

Alergičan kožne reakcije predložen za intravitalnu dijagnostiku fascioliaze ovaca, opistorhoza mesoždera i monijezioze ovaca, hemonhijaze i diktiokauloze ovaca, onkocerkoze goveda i konja i trihineloze svinja.

Od seroloških metoda treba spomenuti reakciju skoleksoprecipitacije, koja omogućuje dijagnosticiranje rani stadiji ehinokokoza i reakcija precipitacije korištenjem živih ličinki valjkastih crva i trihinela za identifikaciju odgovarajućih infekcija helmintima.

Proučavanje intermedijarnih domaćina helminta

Rezultate helmintološkog pregleda životinja treba uvijek dopuniti podacima iz studija o infekcijama helmintima posrednih domaćina. Omogućuju razjašnjavanje helmintološke situacije i predviđanje pojave helmintijaza. Međudomaćini helminta mogu biti mekušci (slatkovodni i kopneni), rakovi (kiklopi, dafnije, amfipodi, vodeni magarci), gliste, insekti (mušice, mušice, mušice, vretenca, mravi, kornjaši), zemljišne grinje.

Gustoća (kvantitativni sastav) je od epidemiološkog značaja. pojedinačne vrste posredni domaćini. Što je veći, to je više mogućnosti da se životinje zaraze helmintima. Kopneni međudomaćini nalaze se na različitim mjestima (na gomilama stajnjaka, na pašnjacima, pašnjacima itd.). Vodeni intermedijarni domaćini u ogroman brojŽive u blizini obala stojećih plitkih rezervoara, u šikarama biljaka. Na tim mjestima životinje (osobito) često postaju zaražene helmintijama.

Prijelazne domaćine treba pregledati na prisutnost ličinki helminta u svježem (po mogućnosti živom) stanju pod binokularnom lupom ili mikroskopom s malim povećanjem. Stadiji larve helminta u tijelu posrednih domaćina su na različite faze razvoju, ali najuočljivije su zarazne ličinke. Kao rezultat istraživanja utvrđuje se opseg (postotak) i intenzitet (količina) infestacije intermedijarnih domaćina ličinkama pojedinih vrsta helminta.

Oribatidne ili oklopne grinje (do 1 mm duljine).Žive u gornjim slojevima tla. To su posredni domaćini monijezije preživača i drugih helminta. Da bi se otkrile ličinke trakavice (cisticeroidi), ljuska oribatidne grinje se najprije razdvoji u kapljici vode na stakalcu (pod kontrolom povećala), zatim se uzorak pokrije pokrovnim staklom i pregleda mikroskopski. . Cisticerkoidi monijezije su okruglog oblika (0,15-0,19 mm u promjeru), opremljeni s četiri sisaljke i kaudalnim dodatkom. Vrlo su osjetljivi, pa se ne smije koristiti kompresorski test na grinje.

Gliste drugih rodova (Criodrilus, Eophila) žive u vodenim tijelima s močvarnim, muljevitim obalama. Registrirani su kao posredni domaćini uzročnika histrihoze i porocekoze pataka. Larva Histrichisa je vrlo velika (do 3 cm duljine), bjelkaste boje, vidljiva kroz koža crv u obliku valovite pruge. Larve Porrocecuma su deset puta manje od prethodne ličinke (2,5-3 mm); nalaze se u krvnim žilama tijekom kompresorskog pregleda glista pod mikroskopom.

Istraživanje amfipoda. Amfipodi dosežu duljinu do 2 cm i žive u morskim i slatkovodnim vodama. Registrirani su kao intermedijarni domaćini uzročnika polimorfoze. streptokarijaza i tetrameroza ptica. Ličinke se otkrivaju kompresorskim ispitivanjem ovih rakova. Larve (acanthellae) polimorfusa su ovalnog oblika, narančaste boje, duljine do 1 mm, vidljive makroskopski.

Istraživanje vodenih magaraca. Vodeni magarci dugi su od 1 do 1,5 cm, žive u slatkovodnim vodama i međudomaćini su uzročnika filikoloze ptica. Pregledom kompresora može se otkriti ličinka (acanthella) bijela, ovalan, 0,7 mm dug.

Također možete ispitati druge međudomaćine (mušice, mušice, mušice, vretenca, kornjaše, mrave).

Fluorescentna mikroskopija

Metoda fluorescentne mikroskopije (prema V. G. Evranovoj) je nova metoda za dijagnosticiranje helmintijaza. Omogućuje vam razlikovanje jaja iste vrste od različitih vrsta helminta, kao i razlikovanje živih jaja i ličinki od mrtvih. Prethodno se jaja trematoda, cestoda i nematoda tretiraju otopinama akridin naranče i drugih fluorokroma. Jaja sposobna za život i ličinke nematoda ne svijetle ili slabo svijetle, dok mrtva svijetle jarko i narančaste su, žutozelene ili žute boje.

Fluorescentnom mikroskopijom moguće je razlikovati jaja glavnih cestoždera mesoždera, jaja uzročnika bolesti i heteracidoze kokoši, koja, kao što je poznato, imaju sličnu strukturu u veličini, obliku i boji, kao i razlikovati vitalne i mrtve oociste kokcidija.

Preparati se promatraju pod mikroskopom MUF-3 ili ML-2. Tehnika fluorescentne mikroskopije je relativno jednostavna i može se koristiti u industrijskim uvjetima (veterinarski laboratoriji).

Od drugih studija koje su od sekundarne važnosti u postavljanju dijagnoze helmintijaze. Možete ukazati na metode kao što su određivanje morfološkog sastava krvi (uzimajući u obzir eozinofiliju) i metodu određivanja proteinske frakcije.

Kratke karakteristike jaja helminta

Reprezentativna jaja različite klase razlikuju se po veličini, boji, obliku, strukturi ljuski i unutarnjem sadržaju.

Jaja trematoda. Najčešće ovalnog oblika s kapom na jednom polu. Ljuska je glatka. U nekim vrstama, ljuska je opremljena filamentima (procesima) i tuberkulama. Boja jaja kreće se od svijetlosive do smeđe (obično žute).

Cestoda jaja. Postoje dvije vrste: trakavice i trakavice. Kod lentena nalikuju jajima trematoda (ovalna s kapom). Jaja pantljičara po strukturi se oštro razlikuju od jaja helminta drugih klasa: češće su prosječne veličine, okrugli oblik, siva, zreli (unutar embrija nalazi se onkosfera s tri para embrionalnih kukica).

Jaja nematoda. Razlikuju se od jaja trematoda u nedostatku poklopca; iz jaja cestoda - odsutnost onkosfere.

Veličine, oblik, struktura i boja ljuski jaja nematoda vrlo su raznoliki. Vanjska ljuska Može biti glatka, gomoljasta, stanična: debljina membrana varira od tanke (kod strongilata) do debele (kod trichocephalusa). Većina nematoda ima ovalna, simetrična jajašca, neke imaju polu-cilindrična jajašca (kod draša). Većina nematoda oslobađa nezrela jajašca u fazi predsegmentacije ili nekoliko kuglica koje se drobe; manjina oslobađa zrela jajašca (ličinka se formira unutar jajašca).

Acanthocephalan jaja. Ovalnog su, elipsoidnog i vretenastog oblika: veličine su srednje do velike. dodijeljen u vanjsko okruženje jaja sadrže unutar ličinke - akantor s deset embrionalnih kukica (zrelih).

Klinička opažanja

Epizootološki podaci

U dijagnosticiranju mnogih helmintijaza domaćih životinja značajnu pomoć pružaju epidemiološki podaci (nepovoljni uvjeti farme za pojedine bolesti, godišnje doba, dob oboljelih životinja, priroda pašnjaka i izvora vode, meteorološki uvjeti itd.). Na primjer, masovna bolest sa znakovima vodena bolest trbuha i uginuće ovaca u jesen nakon kišnog ljeta i korištenje močvarnih područja pašnjaka za ispašu daje razlog za sumnju na akutni oblik fascioliaze. Bolest ljetnih guščića sa znakovima poremećaja probave (proljev) i živčanog sustava (pareza) nakon ispaše na plitkoj stajaćoj vodi, obilno naseljenoj kiklopom, osnova je za postavljanje pretpostavljene dijagnoze drepanidotenijaze. Uginuće janjadi u proljeće (3-4 tjedna nakon početka ispaše) treba pobuditi sumnju na oboljevanje mladih ovaca monijeziozom. Također je potrebno uzeti u obzir zonske karakteristike helmintijaza u domaćih životinja, po mogućnosti u kombinaciji s kliničkim opažanjima.